1、本科毕业论文系列开题报告生物技术曼氏无针乌贼的染色体研究一、选题的背景与意义曼氏无针乌贼（SEPIELLAMAINDRONI），俗称墨鱼，是一年生的中型乌贼，是一种重要的经济渔业资源，在中国海洋资源产量中占有重要的位置。曼氏无针乌贼由于具有重要的经济价值而为人们所熟知，乌贼本身不仅具有营养价值高、生活周期短、生长快等特点其生物学意义以及科研价值也越来越为人们重视。目前有关曼氏无针乌贼的研究大多涉及组织学研究（蒋霞敏等，2007；蒋霞敏等，2008；王春林等，2008）和养殖学研究（王春林等，2006）等方面，而对于核型分析的研究国内外还没有相关报道。因此具有一定的进步意义，本实验对曼氏无针乌贼
2、的染色体数目与核型进行研究，以期为其染色体资料的积累及今后遗传图谱，育种等研究提供理论依据。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题（一）研究的基本内容1利用成体以及不同时期的胚胎制作曼氏无针乌贼染色体标本。2制作曼氏无针乌贼染色体标本时秋水仙素处理的浓度及时间。3制作曼氏无针乌贼染色体标本时低渗的浓度及时间。4染色体组成分析。主要目标（二）拟解决的主要问题曼氏无针乌贼染色体标本制备中秋水仙素的处理时间浓度，低渗的时间及浓度及成体PHA的处理方法。三、研究的方法与技术路线（一）研究的方法通过染色体标本制备和观察，查阅文献资料，数据处理分析等研究方法。1样品采集成体取自宁海得水育苗场人工养殖的曼氏无
3、针乌贼。胚胎取自宁海得水育苗场人工养殖的曼氏无针乌贼产下的不同发育阶段的胚胎。2染色体标本制备（1）秋水仙素处理方法对成体进行直接注射成体还需要PHA处理，对胚胎剥去卵膜后秋水仙素浸泡。对秋水仙素的浓度与处理时间设置梯度。（2）低渗KCL溶液，对于浓度和处理时间设置梯度。（3）固定及染色CARNOY液甲醇冰乙酸31固定。GIEMSA染色液染色。（4）关于滴片冷滴片法或热滴片法（5）显微拍摄对染色体标本进行显微拍摄，照片处理，投影。3数据的统计，计算与分析选取一定数目中期分裂相染色体，对染色体数目进行计数，取众数确定曼氏无针乌贼的染色体数，计算得到染色体相对长度，臂率，臂数，并对染色体进行分类。
4、（二）技术路线四、研究的总体安排与进度2010年3月4月查阅相关文献资料。2010年5月6月完成开题报告和一篇2000字以上的综述及亲本培养。2010年7月12月多次采集成体及亲本产下的胚胎制作染色体标本。2011年1月2月翻译两篇外文。亲本培养成体四季采样不同发育阶段的胚胎（PH、温度、盐度、溶氧）一定浓度秋水仙素浸泡注射一定浓度PHA低渗注射一定浓度秋水仙素固定滴片干燥染色产卵及孵化干燥显微拍照染色体分析数据处理及论文撰写2011年3月5月完成一篇科技论文，准备毕业答辩。五、主要参考文献1曹伏军，李长玲，罗杰等。管角螺、细角螺的核型研究J广东海洋大学学报，2008,28（1）15182常建
5、波,魏利平,杨建敏,等文蛤染色体核型及三倍体诱导的初步研究J水产学报,1996,2032692743顾若波,徐钢春,华丹太湖似刺鳊鮈染色体组型分析及细胞核DNA含量J水产学报,2009,33（1）9144管云雁，韩雅丽。两种荔枝螺染色体核型以及性畸变个体染色体研究J海洋环境科学，2004,23321225蒋霞敏,符方尧,李正,等人工养殖曼氏无针乌贼生殖系统的解剖学与组织学研究J中国水产科学，2008,163726蒋霞敏,符方尧,李正,等曼氏无针乌贼的卵子发生及卵巢发育J水产学报,2007,314,6076177李雅娟,毛连菊,李霞,等三倍体皱纹盘鲍活体倍性鉴定用上足触手、外套膜活体组织制备染色
6、体标本J遗传学报,2002,2965145188林明敏,朱香萍,华丹石蝶染色体核型分析J青岛农业大学学报,2009,2631281309陆荣茂,柴学良,董迎辉,等宽壳全海笋的核型分析J台湾海峡,2008,271434610沈亦平,刘汀,姜海波，等近江牡蛎染色体核型的研究J武汉大学学报自然科学版,1994410210611孙振兴中国海洋贝类染色体研究进展J海洋通报,2004,206778312孙振兴,郭胜超,邵雁群,等三种海产帘蛤目贝类的核型研究J海洋学报,2004,261889413王梅林,郑家声我国海洋鱼类和贝类染色体组型研究进展J青岛海洋大学学报,2000,30227728414王妍妍,柳
7、学周,徐永江条半星鲽染色体核型分析J渔业科学发展,2009,30281315王桂云,马庆惠,王志先皱纹盘鲍的染色体研究J动物学杂志，1988,9（2）17117416王春林,樊晓旭,余红卫,等曼氏无针乌贼墨囊组织学及墨汁形成的超微结构J动物学报,2008,54236637217王春林,蒋霞敏,邱勇敢曼氏无针乌贼海水围塘养殖技术J中国水产,2006,8515218闻海波,顾若波,徐钢春,等两种淡水贝类的核型分析J大连水产学院学报,2007,221424519吴萍,董建萍,倪建国,等文蛤染色体的研究J上海水产大学学报,2002,11210610920许崇任动物生物学M北京高等教育出版社,20089
8、811121袁美云,毛连菊,周炜岩牡蛎的染色体核型分析J大连水产学院学报,2008,23（4）31832022张涛,程宝林,张贤刚,等澳洲宝石鲈染色体核型分析J淡水渔业,2008,382767923周岭华,张晓华,相建海鹰爪虾染色体数目与核型的研究J海洋与湖沼,1999,303,25025324周丽青,杨爱国,柳学周,等半滑舌鳎染色体核型分析J水产学报,2005,29341741925朱冬发,王春林,李志强三疣梭子蟹核型分析J水产学报,2005,29（5）64965326PAPANF,EBRAHIMIPOURM,EBRAHIMIPOURMTHESTUDYOFPERSIANGULFCUTTLEF
9、ISHSEPIAPHARAONISCHROMOSOMEVIAINCUBATIONOFBLOODCELLSJJOURNALOFAMERICANSCIENCE,2010,6215216427NAKAMURA,HKAREVIEWOFMOLLUSCANCYTOGENETICFORMOLLUSCANCHROMOSOMEBIVALVIA,POLYPLACOPHORAANDCEPHALOPODA,VENUSJAPENSJOURNALMALACOLOGY198544193226毕业论文文献综述生物技术软体动物染色体的研究进展摘要本文对以往有关软体动物染色体制备方法及现阶段软体动物染色体核型的研究进展做了一简要
10、的综述。秋水仙素的作用时间浓度，低渗的时间是影响染色体制备的关键因素，软体动物的染色体数量变化也较大，其染色体还存在着多态现象。关键词软体动物；染色体制备；染色体组型软体动物是仅次于节肢动物门的第二大类群，迄今有记录的大15000多种（许崇任，2008）。从上个世纪开始出现染色体的研究报道，并取得一定的成绩，对水产动物染色体研究也比较多，如节肢动物（周岭华等，1999；朱冬发等，2005），鱼类（林明敏等，2009；顾若波等，2009；王妍妍等，2009；张涛等，2008；周丽青等，2005），软体动物（李雅娟等，2002；孙振兴等，2004；王梅林等，2000；吴萍等，2002）。但是头足类
11、关于这方面的报道相对比较少（PAPANF,2010），而组织学繁殖等方面相对多些（蒋霞敏等，2007；蒋霞敏等，2008王春林等，2006；王春林等；2008）。随着近年来软体动物育种的发展，作为其细胞遗传学基础的染色体研究也日益受到人们的重视。染色体组型研究是细胞遗传学的基础,不仅有助于探讨物种在分类系统中的地位和系统演化过程,而且对现代分子生物学研究和遗传育种等均具有十分重要的意义进行染色体组型的观察、分析,并逐步建立了较为可靠的软体动物染色体制备方法,旨为解决分类学上的疑难问题提供更科学的依据,并为细胞的融合、人工诱导多倍体，遗传图谱等遗传育种工作和遗传多样性的研究提供基础资料。1软体动
12、物染色体的制备方法11研究材料的选择制备软体动物染色体的材料，大多采用繁殖期的精巢、卵裂或囊胚阶段的早期胚胎、孵化的幼虫及成体的鳃组织等，这些组织的细胞具有分裂旺盛、容易观察到分裂相的优点，其中尤以早期胚胎和各幼虫的分裂相更为理想。而生殖腺组织会使细胞染色体成倍存在而干扰染色体数量的计数，因此，在做软体动物的染色体时往往采用胚胎及幼虫制备染色体,对头足类的染色体制备也有用其血液细胞（PAPANFETAL,2010），但利用生殖腺、胚胎、幼虫制备染色体，受到繁殖季节的制约，利用鳃等组织则无季节限制，但分裂相相对较少。12秋水仙素的处理方法成体一般采用活体注射，王贵云等人将新鲜皱纹盘鲍体内注射秋水
13、仙素08G/ML,在海水中养4H（王桂云等，1988）；但周丽青等对栉节扇贝及虾夷扇贝进行染色体研究时采用活体取鳃，用004秋水仙素溶液处理30MIN周丽青等，2005；各种幼虫及胚胎一般采用秋水仙素浸泡的方法，袁美云等取孵化的岩牡蛎面盘幼虫放入含05G/L的秋水仙素海水中处理23H袁美云等，2008；常建波等在制备文蛤染色体时将发育到816细胞期胚胎时的受精卵，取样用005的秋水仙素簿水处理40MIN常建波等，1996。在制备染色体标本时，不一样的物种所合适的秋水仙素的浓度及处理时间方法都有所不同。秋水仙素的处理在整个制片过程中起关键作用。13低渗处理低渗的目的使细胞体积胀大，染色体松散。一
14、般采用0075MOL/L的KCL溶液，处理时间一般大于30MIN，当然每个物种的生理浓度不一样，所合适的低渗液及低渗时间也各异。低渗时间过长，造成细胞破裂，染色体丢失，不好准确计数，时间过短，导致染色体聚集，不能展开，无法观察与计数。闻海波等将中华圆田螺及背瘤丽蚌取鳃组织蒸馏水低渗1H（闻海波等，2007）；周丽青等将经秋水仙素处理的栉节扇贝和虾夷扇贝的鳃用25海水低渗周丽青等，2005；而王桂云等则分别用50的海水30MIN,25海水30MIN，蒸馏水10MIN依次对皱纹盘鲍的鳃和生殖腺进行低渗处理（王桂云等，1988）。14固定染色体的固定一般用CARNOY氏液甲醇冰醋酸31，重复三次，每
15、次不得小于15分钟（袁美云等，2005），CARNOY氏液必须现配现用，每次加固定液时须轻轻吹打均匀。15滴片干燥及染色采用热滴片法或者冷滴片法，目的是为了使细胞悬液与玻片存在一定的温差，便于细胞的破裂，使染色体较好的分散在玻片上，滴片的时候要距离玻片一定高度，使细胞破裂。一般用热滴片法，比较好维持温度。大多采用空气干燥法干燥，10GIEMSA染液或15的LEISMAN染液对其进行染色，染色时间为5MIN,30MIN,2H不等（陆荣茂等，2008；袁美云等，2008；闻海波等，2007）。2有关软体动物染色体的研究动态21双壳纲染色体的研究动态双壳类，因其高等类具有瓣鳃，又被称为瓣鳃类。其研究
16、报道比较多，尤其是海产类的。常建波等人报道了文蛤的染色体数目为2N38，未发现染色体异形的性染色体，高温和低温诱导的三倍体，染色体数为57，根据二倍体染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数的统计结果，文蛤染色体的核型为2N3818M20SM,NF76（常建波等，1996）；袁美云等人根据岩牡蛎染色体的相对长度、着丝点的位置和形态特征,可把全部染色体配成10对同源染色体。发现10对同源染色体全部为中部着丝粒染色体,无亚中部、亚端部与端部着丝粒染色体,2N2020M,染色体的总臂数NF40（袁美云，2008）；周丽青等人对栉节扇贝及虾夷扇贝的染色体进行研究，核型公式分别为2N8M10SM20STM和S
17、M归为双臂，ST和T归为单臂,总臂数NF56和2N2N6M10SM16ST6T,总臂数NF54。并对它们的杂交一代进行了核型分析，得出核型公式为2N6M11SM18ST3T,总臂数NF55周丽青等，2005。陆荣茂等人对小荚蛏的染色体研究得出其核型公式为12M14SM10ST2T，NF64，未发现性染色体和随体陆荣茂等，2008。双壳类染色体还存在多态现象，沈亦平等（沈亦平，1994在近江牡蛎染色体中观察到一些核型多态现象，一是个别分裂相中出现一条亚端部着丝粒染色体，二是个别分裂相的一对染色体上出现随体。22腹足纲染色体的研究动态对腹足纲的研究也相对较多。王桂云等人对皱纹盘鲍的染色体进行研究，
18、并认为鲍属不同，染色体也存在着些差异，得出皱纹盘鲍的核型公式为2N3622M14SMM和SM归为双臂,染色体总臂NF72，李雅娟等利用上足触手和外套膜分别对皱纹盘鲍染色体的二倍体三倍体进行了研究，染色体数目分别为2N36,2N54。管云雁等报道了黄口荔枝螺和疣荔枝螺的核型疣荔枝螺，其核型公式分别2N242SM20M2ST,2N2422M2ST并认为两种螺的核型具有一定相似性（管云雁等，2004）。曹伏军等对管角螺及细角螺进行了染色体研究，管角螺核型公式为2N6044M10SM6T，染色体总臂数NF114。细角螺核型公式为2N42M10SM2ST6T，总臂数NF112。两种螺的全套染色体中未发现
19、次缢痕、随体，也无性染色体（曹伏军等，2008）。3展望现今在我国乃至世界范围内，对软体动物染色体的研究相继时常被报道，染色体的制片技术也越发成熟。然而对软体动物的已知种类有15000多种，而与对其染色体的研究种类数量只不过是沧海一粟，对软体动物中一些染色体数目较多的种类如头足类的研究报道太少，需要进一步研究。相信未来这方面的研究肯定会有质的飞跃从而为探讨物种在分类系统中的地位和系统演化过程,而且对现代分子生物学研究和遗传育种等提供重要的参考价值。参考文献1曹伏军，李长玲，罗杰等。管角螺、细角螺的核型研究J广东海洋大学学报，2008,28（1）15182常建波,魏利平,杨建敏,等文蛤染色体核型
20、及三倍体诱导的初步研究J水产学报,1996,2032692743顾若波,徐钢春,华丹太湖似刺鳊鮈染色体组型分析及细胞核DNA含量J水产学报,2009,33（19144管云雁，韩雅丽。两种荔枝螺染色体核型以及性畸变个体染色体研究J海洋环境科学，2004,23321225蒋霞敏,符方尧,李正,等人工养殖曼氏无针乌贼生殖系统的解剖学与组织学研究J中国水产科学，2008,163726蒋霞敏,符方尧,李正,等曼氏无针乌贼的卵子发生及卵巢发育J水产学报,2007,314,6076177李雅娟,毛连菊,李霞,等三倍体皱纹盘鲍活体倍性鉴定用上足触手、外套膜活体组织制备染色体标本J遗传学报,2002,29651
21、45188林明敏,朱香萍,华丹石蝶染色体核型分析J青岛农业大学学报,2009,2631281309陆荣茂,柴学良,董迎辉,等宽壳全海笋的核型分析J台湾海峡,2008,271434610沈亦平,刘汀,姜海波，等近江牡蛎染色体核型的研究J武汉大学学报自然科学版,1994410210611孙振兴中国海洋贝类染色体研究进展J海洋通报,2004,206778312孙振兴,郭胜超,邵雁群,等三种海产帘蛤目贝类的核型研究J海洋学报,2004,261889413王梅林,郑家声我国海洋鱼类和贝类染色体组型研究进展J青岛海洋大学学报,2000,30227728414王妍妍,柳学周,徐永江条半星鲽染色体核型分析J渔
22、业科学发展,2009,30281315王桂云,马庆惠,王志先皱纹盘鲍的染色体研究J动物学杂志，1988,9（2）17117416王春林,樊晓旭,余红卫,等曼氏无针乌贼墨囊组织学及墨汁形成的超微结构J动物学报,2008,54236637217王春林，蒋霞敏，邱勇敢曼氏无针乌贼海水围塘养殖技术J中国水产,2006,8515218闻海波,顾若波,徐钢春,等两种淡水贝类的核型分析J大连水产学院学报,2007,221424519吴萍,董建萍,倪建国,等文蛤染色体的研究J上海水产大学学报,2002,11210610920许崇任动物生物学M北京高等教育出版社,20089811121袁美云,毛连菊,周炜岩牡蛎
23、的染色体核型分析J大连水产学院学报,2008,23（4）31832022张涛,程宝林,张贤刚,等澳洲宝石鲈染色体核型分析J淡水渔业,2008,382767923周岭华,张晓华,相建海鹰爪虾染色体数目与核型的研究J海洋与湖沼,1999,303,25025324周丽青,杨爱国,柳学周,等周丽青,杨爱国,刘志鸿,等栉孔扇贝虾夷扇贝杂交子一代与双亲染色体核型的分析J水生生物学报，2005，29（1）10510925朱冬发,王春林,李志强三疣梭子蟹核型分析J水产学报,2005,29（5）64965326PAPANF,EBRAHIMIPOURM,EBRAHIMIPOURMTHESTUDYOFPERSIAN
24、GULFCUTTLEFISHSEPIAPHARAONISCHROMOSOMEVIAINCUBATIONOFBLOODCELLSJJOURNALOFAMERICANSCIENCE,2010,6216216427NAKAMURA,HKAREVIEWOFMOLLUSCANCYTOGENETICFORMOLLUSCANCHROMOSOMEBIVALVIA,POLYPLACOPHORAANDCEPHALOPODA,VENUSJAPENSJOURNALMALACOLOGY198544193226本科毕业设计（20_届）曼氏无针乌贼的染色体研究目录1引言32材料与方法421材料422方法4221染色体标本的
25、制备4222不同取材试验4223PHA的处理试验4224不同浓度秋水仙素及处理时间试验4225不同浓度低渗及处理时间试验5226染色体计数和核型分析53结果与分析531材料对染色体的影响532PHA的处理对染色体的影响533秋水仙素浓度及处理时间对染色体的影响534低渗液浓度处理时间对染色体的影响535染色体数目的统计736染色体分析74讨论1241取材对染色体的影响1242秋水仙素对染色体的影响1243低渗对染色体得影响1343染色体的组型比较13致谢错误未定义书签。参考文献14摘要以曼氏无针乌贼不同发育阶段的胚胎、幼体及成体为材料，对染色体制备方法中植物血细胞凝集素PHYTOHEMAGGL
26、UTININ，PHA的运用，秋水仙素的处理浓度与时间，低渗浓度与时间对染色体标本分裂相的影响进行了探讨，并初步对其染色体进行了分析。结果表明，以囊胚期到原肠胚期的胚胎为材料，先06MG/MLPHA浸泡4个小时，之后用004秋水仙素浸泡50MIN，005MOL/L的KCL低渗处理60MIN，得到相对比较良好的分裂相。曼氏无针乌贼染色体数目为2N82，N41。经初步核型分析显示，曼氏无针乌贼有14对（第114号）中部着丝粒染色体（M）、6对（第1520号）亚中部着丝粒染色体（SM）和21对（第2141号）端部染色体（T），因此，曼氏无针乌贼的核型为2N8228M12SM42M,染色体臂数NF122
27、条。染色体数目较其他软体动物多，另外端部染色体所占比例比较大，为5122。关键词曼氏无针乌贼；染色体；秋水仙素；低渗；核型ABSTRACTDIFFERENTDEVELOPMENTSTAGEEMBRYO,YOUNGANDADULTOFSEPIELLAMAINDRONIWASUSEDASMATERIALSINTHISEXPERIMENTTHEINFACTOFPHA,COLCHICINESONDENSITYANDTIME,LOWPERMEATINGTOCHROMOSOMESPECIMENSSPLITPHASEWERETESTEDANDPRELIMINARYANALYZEDONTHECHROMOSOM
28、ESTHERESULTSHOWSTHEBESTMETHODSWASUSEFROMBLASTULTOGASTRULAASMATERIAL,WITHTHE06MG/MLPHAIMMERSEFOR4HOUR,THENSTEEPTO004COLCHICINESSOLUTIONIN50MIN,ATLASTLOWPERMEABILITYFOR60MIN,WHICHCANGETRELATIVELYGOODSPLITPHASETHECHROMOSOMALNUMBERSFORSEPIELLAMAINDRONIARE2N82,N41ALLCHROMOSOMES2N82WEREMATCHEDIN41PAIRSTHE
29、YWEREDIVIDEDINTO3GROUPSGROUPICONTAINS14PAIRS1ST14THTHATAREMETACENTRICCHROMOSOMESMIIHASONLY6PAIRS15ST20RDOFSUBMETACENTRICCHROMOSOMESSMANDGROUPIIIINCLUDES21PAIRS21TH41RDWHICHARETELOCENTRICCHROMOSOMESTTHEREFORE,THEKARYOTYPEFORMULAOFSEPIELLAMAINDRONIIS2N8228M12SM42M,NF152CHROMOSOMENUMBERAREMORETHANOTHER
30、MOLLUSKS,ANDTELOCENTRICCHROMOSOMESTHASALARGERPROPORTIONFOR5122KEYWORDSEPIELLAMAINDRONICHROMOSOMECOLCHICINESLOWPERMEABILITYKARYOTYPE1引言染色体的研究是对一个物种体细胞内染色体数目、形态和长度等情况进行研究，是细胞遗传学的基本内容。研究物种的染色体不仅有助于探讨物种在分类系统中的地位和系统演化过程，而且对现代分子生物学研究和遗传育种等都具有十分重要的意义。染色体组型的观察、分析，并逐步建立了较为可靠的软体动物染色体制备方法，旨为解决分类学上的疑难问题提供更科学的依据
31、，并为细胞的融合、人工诱导多倍体，遗传图谱等遗传育种工作和遗传多样性的研究提供基础资料。目前有关于染色体研究方面的报道较多，大多集中在鱼类及节肢动物，周丽青等对波纹唇鱼（CHEILINUSUNDULATUS）染色体的制备及核型进行了研究，得出波纹唇鱼二倍体染色体数目2N48,核型为2N4M10SM32ST2T1，舒琥等对长鳍篮子鱼SIGANUSCANALICULATUS的染色体组型的研究表明长鳍篮子鱼具有染色体48条，其核型公式为2N48，48T，臂数NF48，未发现随体、次缢痕和异型性染色体2；周岭华等以精巢、胚胎及无节幼体为材料研究了鹰爪虾（TRACHYPENAEUSCURVIROSTRI
32、S）染色体的数目及核型,染色体数目为2N70,N35核型公式为2N7042M10SM12ST6T3；朱冬发等研究了三疣梭子蟹的核型，得出三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）核型为2N10640M6SM60T4。有关软体动物染色体主要有文蛤MERETRIXMERETRIXLINNAEUS核型为2N3818M20SM,NF76（常建波）5；皱纹盘鲍（HALIOTISDISCUSHANNAI）核型公式为2N3622M14SMM和SM归为双臂,染色体总臂NF72（王桂云）6；管角螺（HEMIFUSUSTUBA）及细角螺核型公式为2N6044M10SM6T，染色体总臂数NF114
33、。（HEMIFUSUSTERMATAMUS）核型公式为2N42M10SM2ST6T，总臂数NF112（曹伏军）；小荚蛏（SILIQUAMINIMAIGMELIN）核型公式为2N3812M14SM10ST2T，NF64（陆荣茂）8。但迄今为止有关头足类的染色体报道相对较少，仅见PAPAN等通过培养的虎斑乌贼（SEPIAPHARAONIS）的血液细胞，得出其染色体数目为2N48，并且在所有的分裂相中发现其具有中部着丝粒染色体，近端部着丝粒染色体和端部着丝粒染色体9。曼氏无针乌贼（SEPIELLAMAINDRONI），俗称墨鱼、血墨，是我国重要的海洋头足类经济渔业资源，在中国海洋资源产量中占有重要的
34、位置。隶属于软体动物门、头足纲、二鳃亚纲、十腕目、乌贼科、无针乌贼属，为我国沿海广温广布种。曼氏无针乌贼曾被誉为东海区四大渔业之一，但80年代后期开始，该种资源明显衰退，产量急剧下降，目前数目甚少，仅作为兼捕对象，对其资源的保护已迫在眉睫10,11,12。曼氏无针乌贼由于具有重要的经济价值而为人们所熟知，其本身不仅具有营养价值高、生活周期短、生长快等特点，其生物学意义以及科研价值也越来越为人们重视。曼氏无针乌贼作为我国东海重要资源，近年来对于曼氏无针乌贼的相关报道也日趋增多。这些研究主要集中生态学13,14,15，形态学16,17,18,19，养殖学20,21,22,23等方面。而对于曼氏无针
35、乌贼染色体的研究国内外还没有相关报道。本实验以曼氏无针乌贼的胚胎为材料，并对染色体制备方法中秋水仙素的处理浓度与时间，低渗浓度与时间等对其染色体标本分裂相的影响进行了探讨，并选取了相对分散较好的中期分裂相进行了染色体粗略计数，分析了核型，以期为曼氏无针乌贼遗传图谱、育种等研究提供理论依据。2材料与方法21材料实验所用材料为2010年7月至2010年11月之间采自浙江省宁海得水水产育苗厂养殖的曼氏无针乌贼不同发育阶段的胚胎（室内水泥池自然生产获得），刚孵化出的幼体及成体。22方法221染色体标本的制备取曼氏无针乌贼的胚胎剥去外部黑色坚韧而富有弹性的三级卵膜、幼体及成体为材料，浸泡于06MG/ML
36、的PHA溶液中一定时间（成体PHA注射），然后用秋水仙素处理样品一段时间，除去卵黄，吹打散细胞，用低渗液低渗，然后用CARNOY液甲醇冰乙酸31固定，离心，弃上清液，固定三次，滴片，室温干燥，用10GIEMSA染液染色20MIN，自来水冲洗，空气干燥法干燥后镜检。222不同取材试验分别取曼氏无针乌贼受精卵期，囊胚期，原肠胚期等不同发育阶段的胚胎，刚孵化出的幼体，浸泡于06MG/ML的PHA溶液中4H，成体按25G/G的标准注射PHA，12H后再注射一次，取精巢、肾等组织，之后004的秋水仙素处理50MIN，005MOL/LKCL溶液低渗处理60MIN，各三平行。其他步骤参考221。223PHA
37、的处理试验采用囊胚期到原肠胚期的胚胎为材料，浸泡于06MG/ML的PHA溶液中4H，对照组不对其进行PHA浸泡，之后用004的秋水仙素处理50MIN，005MOL/LKCL溶液低渗处理60MIN，各三平行。其他步骤参考221。224不同浓度秋水仙素及处理时间试验采用囊胚期到原肠胚期的胚胎为材料，秋水仙素浓度分别为001，002,003，004，005，006，01，02，03。时间为30MIN,40MIN,50MIN,60MIN,70MIN，80MIN，90MIN，浸泡于06MG/ML的PHA溶液中4H，005MOL/LKCL溶液低渗处理60MIN，各三平行。其他步骤参考221。225不同浓度
38、低渗及处理时间试验采用囊胚期到原肠胚期的胚胎为材料，低渗液浓度分别为50海水，25海水，125海水，0075MOL/LKCL,005MOL/LKCL,0025MOL/LKCL，时间为40MIN，50MIN，60MIN，70MIN，80MIN，90MIN，100MIN，浸泡于06MG/ML的PHA溶液中4H,004的秋水仙素处理50MIN，各三平行。其他步骤参考221。226染色体计数和核型分析用OLYMPUSBX60荧光显微镜对染色体标本进行观察，对不同条件处理下的分裂相细胞进行显微摄影，并选取分散相相对较好的，染色体形态相对来说较容易辨认的中期分裂相进行着重显微摄影。选取染色体分散较好的底片
39、经幻灯机投影到白纸上进行染色体计数。其中适于做核型分析的中期相用铅笔在白纸上勾画出染色体的形态,染色体形态的分类标准按照LEVAN24等的分类标准。臂比指数在1017之间的称为中央着丝粒染色体（M）；在1730之间的称为亚中部着丝粒染色体（SM）；3070为亚端部着丝粒染色体（ST），着丝粒指数大于70的为端部着丝粒染色体（T）。染色体相对长度计算公式如下染色体相对长度实测长度/全部染色体长度总和1003结果与分析31材料对染色体的影响经过多次试验发现，材料的选取直接影响到染色体标本的质量。以囊胚期和原肠胚期的处理较为理想（表1）。32PHA的处理对染色体的影响通过多次试验发现，06MG/ML
40、的PHA溶液中浸泡4H，之后所制作成的染色体标本，分裂相明显较没有处理过的增多（图3）。33秋水仙素浓度及处理时间对染色体的影响秋水仙素的处理是染色体标本制作中的关键，对结果起关键作用。通过多次实验摸索发现，004的秋水仙素，时间50MIN，达到的效果相对来说比较理想表2。34低渗液浓度处理时间对染色体的影响低渗是实验过程中另一重要的处理条件，多次实验发现，005MOL/LKCL溶液低渗处理60MIN，得到的分裂相相对比较理想。浓度过低，时间过短，细胞没有膨胀；浓度过高，时间过长，细胞破碎严重，没有完整的分裂相（表3）。表1不同材料对染色体的影响TAB1THEINFACTOFDIFFERENT
41、MATERIALSONTHECHROMOSOMES材料MATERIALS受精卵期ZYGOTE卵裂期TRANSGENE囊胚期BLASTUL原肠胚期GASTRULA初具形态期INITIALSHAPE幼体LARVAE成体（肾，精巢）ADULTKIDNEY,TESTICLE处理结果RESULTSOOFTRANSACTION注表示不理想；表示较理想。NOTEUNDESIRABILITYDESIRABILITY表2秋水仙素对染色体的影响TAB2THEINFACTOFLCOLCHICINESONTHECHROMOSOMES处理时间（MIN）PROCESSTIME（MIN）秋水仙素浓度（）COLCHICINE
42、SCONCENTRATION（）00100200300400500601020330405060708090注表示未见染色体；表示分散不太好；表示分散较好。NOTESHOWNOTSEECHROMOSOMESSHOWNOTVERYGOODSCATTEREDSHOWBETTERSCATTERED表3低渗溶液对染色体的影响TAB3THEINFACTOFLOWPERMEABILITYONTHECHROMOSOMES处理时间（MIN）PROCESSTIME（MIN）海水（）SEAWATER（）KCL浓度（MOL/L）KCLCONCENTRATION（MOL/L）502512500750050025405
43、060708090100注表示未见染色体；表示分散不太好；表示分散较好。NOTESHOWNOTSEECHROMOSOMESSHOWNOTVERYGOODSCATTEREDSHOWBETTERSCATTERED35染色体数目的统计在显微镜下对曼氏无针乌贼分散较好的28个染色体中期分裂相进行计数。观察结果表明，染色体为82条的分裂相最多，为11个，出现的百分比率为3926，而80条的为5个，所占的百分比率为1786，多于82条的仅为2个，所占的百分比率为1714，曼氏无针乌贼的中期分裂相为二倍体，其染色体数目为2N82（表4）。非众数部分的染色体数目可能是由细胞制片过程中的误差所造成的。表4胚胎细
44、胞分裂中期染色体数出现频率TAB4FREQUENCYOFCHROMOSOMALNUMBEROFSOMATICCELLSFROMEMBRYOS染色体数目CHROMOSOMENO72747576788081828386总计TOTAL细胞数CELLNUMBER1212252111128百分率PERCENTAGE3577143577147141786714392635735710036染色体分析对实验所得图片进行染色体的显微测量、分析，根据臂比和相对长度进行同源染色体配对，曼氏无针乌贼全部染色体配成41对（图1）。计算出染色体相对长度和着丝粒指数的变化范围分别为086457和04590表5。据LEVA
45、N等的染色体分类标准对曼氏无针乌贼的染色体核型进行了初步的分析具中部着丝粒染色体（M）有14对，亚中部着丝粒染色体（SM）有6对，端部着丝粒染色体21对（图2）。核型公式2N8228M12SM42T。染色体臂数NF122条。图1曼氏无针乌贼细胞分裂中期染色体显微图相FIG1THEMICROGRAPHOFMETAPHASECHROMOSOMESINSEPIELLAMAINDRONI图2曼氏无针乌贼核型FIG2KARYOTYPEOFSEPIELLAMAINDRONI图3PHA对染色体制片的影响FIG3THEEFFECTOFPHAONTHECHROMOSOMES注A、PHA未处理的细胞；B、经PHA
46、处理的细胞NOTEA、PHAUNPROCESSEDCELLSB、PHAPROCESSEDCELLSABAB图4两种类型的染色体FIG4TWOKINDOFCHROMOSOMES注A、B、C、X型染色体；D、杆状染色体NOTEA、B、C、XCHROMOSOMED、LEVERCHROMOSOMECD表5曼氏无针乌贼核型指数TAB5INDICESOFKARYOTYPEINSEPIELLAMAINDRONI染色体对编号CHROMOSOMEPAIRNO相对长度RELATIVELENGTH着丝粒指数CENTROMERICINDEX臂率ARMRATIO类型TYPE14570163931045152003M24
47、250124494235122005M34730174495159115007M45400214445213113002M54440114310040126008M64020144333062123004M73920064553175114005M84700084590232112004M94320104219090130007M103150064519245115006M113150094418139121005M122720174536188116004M132360074251145130005M141640083967175153010M152630073245108210005SM1
48、62800072891044243010SM172340103237106200004SM182760123484040183007SM192850093251113201005SM202460103182075223010SM2122201007T2216801107T2318500907T2418100607T2517400807T2615500707T2715500907T2814801607T2914900707T3012100907T3112900607T3212300907T3312000507T3412501207T3512800407T3613400607T3708901007
49、T3809100707T3908901107T4007400807T4108600807T注M为中部着丝粒染色体SM为亚中部着丝粒染色体T为端部着丝粒染色体NOTEMFORTHEMETACENTRICCHROMOSOMESSMFORTHESUBMETACENTRICCHROMOSOMESTFORTHETELOCENTRICCHROMOSOMES4讨论41取材对染色体的影响材料是影响软体动物染色体制片中一个重要的因素，海产软体动物一般选取腮，生殖腺，各期幼虫或胚胎等作为染色体标本制作的材料，三疣梭子蟹以胚胎，生殖腺，幼体作为材料4；硬壳蛤（MERCENARIAMERCENARIA）染色体标本制作选取48细胞期的胚胎为材料19；岩牡蛎CRASSOSTREANIPPONA染色体标本的制作用面盘幼虫作为核型的材料26，PAPAN等用血液细胞培养法得到虎斑乌贼的染色体数目9，但是这种材料选择有一定技术上的难度。作者在实验过程中，通过成体取腮及生殖腺的方法多次尝试，但由于试验前需要活体注射PHA，容易使乌贼受刺激而喷墨，对乌贼产生毒害而死亡，很难取到活体腮及生殖腺等材料。采用刚孵化出的幼体作为染
