1、本科毕业论文系列开题报告海洋生物资源与环境免培养法研究三疣梭子蟹养殖塘细菌群落演替一、选题的背景与意义我国的海水养殖业发达，随着市场需求的扩大和海水养殖技术水平的提高，海水养殖业的养殖模式已趋向集约化、高密度、高产出，但是越来越多的养殖环境遭到了严重破环，极大的制约了养殖业的健康发展。在海水养殖生态系统里，微生物对其生态环境的平衡以及水质的调节起着重要的作用，它们参与物质的循环和能量的流动。因此，了解海水养殖环境中微生物的群落演替，有助于我们更为深入地掌握微生物的分布特征及其在整个生态系统中的功能与作用，对发展健康养殖业具有重要的意义。长久以来，人们都是利用传统的微生物学培养方法对微生物进行研
2、究。近年来，人们认识到传统的培养方法存在局限性，而分子生物学技术的不断成熟和广泛应用，为微生物生态学的发展提供了新的研究方法，人们可以从基因水平上深入了解复杂环境样品中的微生物功能、遗传和群落结构的演替，极大地丰富了人们对未培养微生物的认识，为更好地开发利用环境中丰富的微生物资源提供了新的机遇。其中构建16SRDNA克隆文库最早被GIOVANNONI（1990）等人用于研究藻海（SARGASSOSEA）中浮游细菌的多样性，随后，很多学者都采用该方法对微生物多样性展开了类似的研究（FUHRMANETAL，1993）。克隆文库法可以获得较多的微生物群落多样性的信息，但其对分析的克隆数目有要求，为了
3、使结果更具有代表性，通常可以采用物种丰富度的覆盖率评估来估算不同样品所要选取的克隆数目。本课题通过免培养法研究三疣梭子蟹养殖池塘环境中微生物群落的演替，采用不依赖于培养的分子手段构建细菌16SRDNA克隆文库，并进行系统发育学分析。研究不同养殖时期，水体中免培养细菌的群落结构及变化，能够全面客观的反应三疣梭子蟹养殖池塘生态系统中免培养微生物区系的组成及演替情况。调查三疣梭子蟹养殖塘水体的细菌群落组成,分析物种多样性,初步探讨三疣梭子蟹养殖塘水体细菌群落在生态系统中的作用,对三疣梭子蟹养殖具有一定的指导意义。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容通过免培养法研究三疣梭子蟹养殖池塘环境
4、中微生物群落的演替，采用不依赖于培养的分子手段构建细菌16SRDNA克隆文库，并进行系统发育学分析。拟解决的主要问题（1）PCRDGGE技术的掌握；（2）掌握ECOIL感受态细胞的制备；（3）进行系统发育学分析时掌握基础生物信息学，如NCBI、EBI、MEGA40等。三、研究的方法与技术路线研究方法样品采集后，提取养殖塘中细菌的总DNA，然后PCR扩增16SRDNA全序列，经DGGE筛选出不同带型的，构建16SRDNA克隆文库并测序，最后进行系统发育学分析。技术路线水样总DNA的提取分析不同养殖时期，养殖塘水样中微生物群落结构及变化情况系统发育学分析DGGE筛选出不同发育型构建16SRDNA克
5、隆文库测序（不同时期）水样四、研究的总体安排与进度20087200810采样，查询与论文有关的资料、撰写试验计划；20081120093样品的分离与纯化，样品DNA的提取；2009420103PCRDGGE，构建16SRDNA克隆文库，测序；2010420109运用生物信息学软件进行数据处理及分析，确定分类地位，构建系统发育树等，获得初步结果；201010201011实验数据的整理分析以及对整个试验的补充、完善阶段；20101220114分析数据，撰写论文，结题、答辩。主要参考文献1SOLBRIGOTFROMGENESTOECOSYSTEMSARESEARCHAGENDAFORBIODIVER
6、SITYREPORTOFAIUBSSCOPEUNESCOWORKSHOPTHEINTERNATIONALUNIONOFBIOLOGICALSCIENCES，BOULEVARDOLEMONTMORENNYPARISFRANCE19912WATVEMG，GANGALRMPROBLEMSINMEASURINGBACTERIALDIVERSITYANDAPOSSIBLESOLUTIONJAPPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY，1996，62（11）429943013ISTOCKCA,BELLJA,FERGUSONN,ETALBACTERIADIVERSITYANDEVO
7、LUTIONTHEORETICALANDPRACTICALPERSPECTIVESJJINDMICROBIOL,1996,17341371504刘晶晶，陈全震，曾江宁等海水养殖区微生物生态研究浙江海洋学院学报（自然科学版），2006，25（1）72775柳承璋，宋林生，吴青分子生物学技术在海洋微生物多样性研究中的应用MARINESCIENCES，2002，26（8）27306刘真，邵宗泽南海深海沉积物烷烃降解菌的富集分离与多样性初步分析微生物学报，2007，47（5）8698737李秋芬，曲克明，陈碧鹃等老化虾池生态系中几类主要细菌的季节变化特征海洋水产研究，2002，23（2）12288高尚
8、德，陈旭仁，吴以平中国对虾养成后期间虾池水体和底泥中细菌含量的变化水产学报，1994，18（2）1381429郭平，许美美对虾养殖池水域环境细菌的动态变化海洋与湖沼，1994，25（6）62563010王晓颖，席峰，袁建军等虾池沉积环境中若干功能菌及弧菌的时空变化厦门大学学报自然科学版，2006，45，增刊25025611MATTHEWSPAYNE，MIKERHALL，RAYMONDBANNISTERETALMICROBIALDIVERSITYWITHINTHEWATERCOLUMNOFALARVALREARINGSYSTEMFORTHEORNATEROCKLOBSTERPANULIRUSOR
9、NATUSAQUACULTURE，2006，258809012钱丽君，张德民，徐小红应用DGGE分析三疣梭子蟹养殖塘底泥细菌的多样性水产学报，2007，31（2）20421013XUHS，ROBERTSN，SINGLETONFL，ETA1SURVIVALANDVIABILITYOFNONCULTURABLEESCHERICHIACOILANDVIBRIOCHOLERARINTHEESTUARINEANDMARINEENVIRONMENTJMICROBECOL，1982，8（4）31332314AMANNRI，LUDWIGSCHLEIFERKHPHYLOGENETICIDENTIFICATION
10、ANDINSITUDETECTIONOFINDIVIDUALICROBIALCELLSWITHOUTCULTIVATIONMICROBIOLREV1995，5914316915MORRISCE，BARDINM，BERGEO，ETALMICROBIALBIODIVERSITYAPPROACHESTOEXPERIMENTALDESIGNANDHYPOTHESISTESTINGINPRIMARYSCIENTIFICLITERATUREFROM1975TO1999MICROBMOLBIOL，REV2002，6659261616MUYZERG,WAALEC,UITTRLINDENAGPROFILINGO
11、FCOMPLEXMICROBIALPOPULATIONBYDENATURINGGRADIENTGELELECTROPHORESISANALYSISOFPOLYMERASECHAINREACTIONAMPLIFIEDGENESCODINGFOR16SRRNAJAPPLENVIRONMICROBIOL,1993,59369570017GORDONW,CAROLEJN,JOHNC,ETALMICROBIALDIVERSITYINDEEPSUBSEAFLOORSEDIMENTSASSESSEDBYDENATURINGGRADIENTGELELECTROPHORESISDGGEEB/OLHTTP/WWW
12、CHMBRISACUK/DEEPBUG/MEMBERS/CARDIFF/ISSMPOSTERGWPDF,2002110818GILANDCTHEEFFECTOFANACUTECOPPEREXPOSUREONTHEDIVERSITYOFAMICROBIALCOMMUNITYINNORTHSEASEDIMENTSASREVEALEDBYDGGEANALYSISTHEIMPORTANCEOFTHEPROTOCOLJMARPOLLUTBULL,2004,495650451319HUGENHOLTZP,PITULLEC,HERSHBERGERKL,ETALNOVELDIVISIONLEVELBACTER
13、IALDIVERSITYINAYELLOWSTONEHOTSPRINGJJBACTERIOL,1998,80236637620张宝涛，王立群，伍宁丰等PCRDGGE技术及其在微生物生态学中的应用生物信息学，2006，313213421GIOVANNONI,SJ,TBBRITSCHGI,CLMOYER,ANDKGFIELD1990GENETICDIVERSITYINSARGASSOSEABACTERIOPLANKTONNATURE345606322FUHRMANJA，MCCALLUMTB，DAVISAAPHYLOGENETICDIVERSITYOFSUBSURFACEMARINEMICROBIA
14、LCOMMUNITIESFROMTHEATLANTICANDPACIFICOCEANSAPPLENVIRONMICROBIOL，1993，591294130223SOGINML,MORRISONHG,HUBERJA,WELCHDM,HUSE,SM,NEALPR,ARRIETAJM,HERNDLGJMICROBIALDIVERSITYINTHEDEEPSEAANDTHEUNDEREXPLORED“RAREBIOSPHERE”PROCEEDINGSOFTHENATIONALACADEMYOFSCIENCES,2006,10332121151212024COLWELLRK，XUANOMAOC，CHA
15、NGJINTERPOLATING,EXTRAPOLATING,ANDCOMPARINGINCIDENCEBASEDSPECIESACCUMULATIONCURVESECOLOGY，2004，852717272725SINGLETONDR，FURLONGMR，RATHBUNSL，ETALQUANTITATIVECOMPARISONOF16SRRNAGENESEQUENCELIBRARIESFROMENVIRONMENTALSAMPLESAPPLENVIRONMICROBIOL，2001，6743744376毕业论文文献综述海洋生物资源与环境海洋微生物多样性的研究摘要海洋微生物多样性是生物多样性的
16、重要组成部分。本文综述了海洋微生物多样性的概念，海洋养殖环境中微生物多样性的研究现状以及国内外开展海洋微生物多样性的主要研究方法和原理。重点介绍了分子生物学技术在研究中的应用,对DGGE指纹图谱和16SRDNA进行了详细的阐述。关键字海洋微生物多样性；分子生物学技术；DGGE；16SRDNA克隆文库1海洋微生物多样性的概念海洋微生物的种类繁多，可达1000万种，其种群的丰富程度也远远超出人类先前的认识，且大部分属于未知的品种。通过对海洋微生物多样性的研究，特别是针对大多数未知种群的研究，可以探知蕴藏其中的无法估量的资源，同时也可用于监控环境变化，对于环境状态、环境污染，微生物群落会作出迅速反应
17、。早在20世纪90年代，SOLBRIG1指出微生物群落多样性有3个组成要素即物种多样性、遗传多样性和功能多样性。起初的研究重点在物种多样性和遗传多样性，但随着各项技术的发展和研究角度的拓宽，微生物多样性的研究还包括生活环境的多样性、生长繁殖速度的多样性、生活方式的多样性、基因的多样性和微生物资源开发利用的多样性等（WATVEETAL，1996，ISTOCKETAL，1996，刘晶晶等，2006）。2,3,4本文所说的海洋微生物多样性（MARINEMICROORGANISMSDIVERSITY）是指所有海洋微生物种类、种内遗传变异以及它们生存环境的总称，是物种多样性、遗传多样性和生态系统多样性的
18、综合表述。目前，柳承璋等（2002）5认为多样性的研究作为海洋微生物资源开发的基础，通常集中在以下几个层次即分类多样性（TAXONOMICDIVERSITY）、系统发育多样性（PHYLOGENETICDIVERSITY）、遗传多样性（GENETICDIVERSITY）和功能多样性（FUNCTIONALDIVERSITY）。近年来，刘真等（2007）6对于海洋天然药物的开发和利用，海洋污染环境的生物修复与整治，刘晶晶等（2006）4微生物对近海养殖环境的生态影响以及海水养殖动物的病害等热点的研究也大大推动了微生物多样性的研究。2海洋养殖环境中微生物多样性的研究现状我国的海水养殖业有着悠久的历史，
19、随着市场需求的扩大和海水养殖技术水平的提高，海水养殖业已趋向集约化、高密度、高产出的养殖模式,越来越多的养殖环境遭到了严重破环，极大的制约了养殖业的健康发展。在海水养殖生态系统里，微生物对其生态环境的平衡以及水质的调节起着重要的作用，它们参与物质的循环和能量的流动。因此，了解海水养殖环境中微生物的多样性，有助于我们更为深入地掌握微生物的分布特征及其在整个生态系统中的功能与作用，对发展健康养殖业具有重要的意义。近年来，在养殖环境微生物群落结构的研究方面，国内外已有很多相关报道。从研究方法来看，已由传统的培养方法逐渐向各种分子手段转变。早期的研究主要以平板培养计数的方法为主，研究对象也集中在几类致
20、病菌或某些功能微生物上。李秋芬等（2002）7报道了虾池生态系统中几类细菌的季节性变化，他们发现在养殖中后期弧菌和硝酸盐还原菌数量增长很快且数量较高。高尚德等（1994）、郭平等（1994）8,9报道了养虾池中细菌的数量和变化规律同温度、PH值及虾病有密切关系。王晓颖等（2006）10研究了虾池沉积环境中若干功能菌及弧菌的时空变化。这些研究多是在传统的分离培养方法的基础上进行细菌计数，而我们知道自然界中绝大部分的微生物是目前人们还无法纯培养的，采用传统的分离培养方法，不足以得到丰富的微生物多样性信息。近几年，以PCRDGGE为代表的DNA指纹图谱技术以及荧光原位杂交等分子手段常被应用于微生物群
21、落的分析。MATTHEW等（2006）11应用PCRDGGE技术以及构建16SRDNA克隆文库的方法研究了南美白对虾育苗池微生物群落的多样性，结果发现不同分析方法所得出的结果之间存在着差异。从研究内容来看，这些微生物群落所处的环境多样，其中包括网箱养殖区、养殖池塘、滩涂等。另外微生物所处的微环境（生境）也各不相同，包括养殖水体、沉积物、甚至是养殖动物体内。综上所述，微生物群落结构的组成及变化与海水养殖的关系十分密切，在养殖池塘的物质循环、能量流动、生态平衡及环境净化等方面起着十分重要的作用。了解养殖环境中细菌群落的组成、功能及其多样性，有助于了解养殖池塘生态系的特性，并对病害起到早期的预警作用
22、。3微生物多样性的研究方法31微生物多样性研究的传统方法自19世纪科赫（KOCH）创立微生物纯培养技术以来，已有数千种细菌、病毒和约10万种真菌在实验室中得到了纯培养，纯培养技术已成了研究微生物的必要技术之一。所谓纯培养技术（CULTUREMETHODS），是指在实验室条件下，利用合适的培养基对样品进行稀释培养，最终获得纯培养物，进而开展一系列的研究。早期的海洋微生物多样性研究也是建立在这种传统培养基础上的，主要是从细菌形态和生理生化水平出发，对不同菌株的各种分类特征进行实验和描述，并以此为依据从众多考虑的细菌中逐个排出，直至正确的鉴定出未知菌株。通过纯培养方法对可培养细菌（CULTIVATE
23、DBACTERIA）进行一系列的研究，可以准确的了解微生物细胞的生命活动以及环境中各种微生物相互协调的规律。但是传统的分离培养法也存在很多不足之处，某些寡营养微生物较难用培养方法进行分析，如海洋微生物等。此外，在对微生物分类特征进行常规鉴定时，也经常出现表型表达不稳定、敏感性不高、测试项目多等问题。32基于分子生物学技术的研究方法越来越多的证据（表1）12表明，由于受到现有技术的限制，自然界中绝大部分的微生物是目前人们还无法纯培养的。钱丽君等（2007）13将传统的微生物培养方法与现代分子生物学技（PCRDGGE）相结合，研究了三疣梭子蟹养殖塘底泥可培养微生物的多样性，提高了分析通量。但仍未涉
24、及到占细菌总数99的不可培养细菌。1982年，徐怀恕等14提出了“不可培养（活）微生物”（VIABLEBUTNONCULTURABLEMICROORGANISMS，VBNCMICROORGANISMS）的概念。顾名思义，不可培养微生物（UNCULTIVATEDMICROORGANISMS）是指迄今所采用的分离培养方法还未获得纯培养的微生物。由于不可培养微生物无论是其物种类群，还是新陈代谢途径、生理生化反应、产物等都存在着丰富的新颖性和多样性，因而比以往的可培养微生物具有更为丰富和多样的可供人类开发利用的生物资源。表1几个环境样品中可培养细菌的比率环境样品可培养率（）海水（SEAWATER）00
25、1010淡水（FRESHWATER）025湖水（MESOTROPHICLAKE）0110无污染的河口水样（UNPOLLUTEDESTUARINEWATERS）0130活性污泥（ACTIVATEDSLUDGE）115沉淀物（SEDIMENT）025土壤（SOIL）03注可培养的细菌是以菌落生成单位（CFU）来计算的（引自AMANNETAL，1995）上世纪60年代开始，分子遗传学和分子生物学技术在细菌分类学中得到了广泛应用。WOESE指出16SRRNA及其类似的RRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。MORRIS等人（2002）15的研究也显示，在过去十五年中对微生物群落多样性的研究方法主
26、要为分子生物学方法。分子生物学技术的广泛应用，使得我们摆脱了纯培养条件的束缚，开辟了一条更客观的探索环境中微生物多样性的新思路。321变性梯度凝胶电泳（DENATURINGGRADIENTGELELECTROPHORESIS，DGGE）1993年MUYZER16首次证实了变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和种群差异方面具有独特的优越性。近年来，该方法已被广泛的用于各种环境微生态的研究中，主要用于对微生物多样性进行定性或半定量的评估。通过DGGE图谱，可以确定环境微生物群落中优势类群或独特种群的遗传多样性。GORDON17等通过DGGE的方法对太平洋不同位点的海洋
27、沉积物中的微生物多样性进行了研究,发现深海沉积物中存在着丰富的微生物资源,并且证实PCRDGGE的方法可用于快速分析微生物群落。GILLAN18采取三种不同的方法对DGGE法的可靠性进行了测试,结果证实DGGE法是研究污染物质对海洋微生物多样性影响的一个很有价值的工具。DGGE技术具有可靠、可重复、快速和容易操作等特点，能克服传统微生物研究方法的不足，重现微生物多样性，提供微生物在时间和空间上的动态变化。但它也存在一定的局限性，例如，利用DGGE分离的PCR产物，一般要求DNA长度在500BP以下，否则DGGE的分辨率会下降，而判断微生物所属的系统类群，要求分析的16SRDNA片段长度至少达到
28、500BP（HUGENHDTZETAL，1998）19，MUYZER等（1993）还指出此法只能对菌体数量大于总菌量1的优势种群进行分析。可见，DGGE技术并不能提供某一生境中微生物群落的真实图景，因此要想更详尽地分析微生物群落的复杂性，还应与其他技术相结合，如FISH和微电极测量技术等方法（张宝涛等，2006）。2032216SRDNA克隆文库构建目前，构建16SRDNA克隆文库是微生物分子生态学中用来调查环境中原核微生物组成的常用方法之一。其原理是提取环境样品中所有微生物的基因组DNA，并用PCR扩增16SRDNA序列，然后建立基因文库，扩增每个克隆中16SRDNA片段进行测序。最后将所测
29、得的序列与现有数据库中（GENEBANK或EMBL）的已知序列进行比对，从而获得关于微生物群落多样性的信息。文库中的序列信息不但可以用来分析样品中物种的丰富度与多样性，同时还可以将其作为其他分子方法的基础，开展进一步研究，例如，用于设计荧光原位杂交（FISH）的探针或变性梯度凝胶电泳（DGGE）所使用的引物。该方法最早被GIOVANNONI（1990）21等人用于研究藻海（SARGASSOSEA）中浮游细菌的多样性，随后，很多学者都采用该方法对微生物多样性展开了类似的研究（FUHRMANETAL，1993）。22克隆文库法可以获得较多的微生物群落多样性的信息，但其对分析的克隆数目有要求，为了使
30、结果更具有代表性，通常可以采用物种丰富度的覆盖率评估来估算不同样品所要选取的克隆数目。SOGIN200623认为只有在克隆数目足够的情况下才可以较为完整的认识种群组成的情况。此外，排除核酸提取、PCR及克隆过程产生的偏差，该方法的主要问题还在于如何能准确的评估群落的多样性，为此许多专家（COLWELLETAL，2004；SINGLETONETAL，2001）24,25提出使用参数或非参数的方法对种群的多样性进行评估。在多样性丰富的生态系统中，该方法工作量较大，测序费用较高。针对这些问题通常在测序前要经过序列筛选，剔除重复序列，仅将代表序列进行测序。序列筛选一般采用前面所述的DNA指纹技术，如D
31、GGE、SSCP、RFLP等。参考文献1SOLBRIGOTFROMGENESTOECOSYSTEMSARESEARCHAGENDAFORBIODIVERSITYREPORTOFAIUBSSCOPEUNESCOWORKSHOPTHEINTERNATIONALUNIONOFBIOLOGICALSCIENCES，BOULEVARDOLEMONTMORENNYPARISFRANCE19912WATVEMG，GANGALRMPROBLEMSINMEASURINGBACTERIALDIVERSITYANDAPOSSIBLESOLUTIONJAPPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLO
32、GY，1996，62（11）429943013ISTOCKCA,BELLJA,FERGUSONN,ETALBACTERIADIVERSITYANDEVOLUTIONTHEORETICALANDPRACTICALPERSPECTIVESJJINDMICROBIOL,1996,17341371504刘晶晶，陈全震，曾江宁等海水养殖区微生物生态研究浙江海洋学院学报（自然科学版），2006，25（1）72775柳承璋，宋林生，吴青分子生物学技术在海洋微生物多样性研究中的应用MARINESCIENCES，2002，26（8）27306刘真，邵宗泽南海深海沉积物烷烃降解菌的富集分离与多样性初步分析微生物学
33、报，2007，47（5）8698737李秋芬，曲克明，陈碧鹃等老化虾池生态系中几类主要细菌的季节变化特征海洋水产研究，2002，23（2）12288高尚德，陈旭仁，吴以平中国对虾养成后期间虾池水体和底泥中细菌含量的变化水产学报，1994，18（2）1381429郭平，许美美对虾养殖池水域环境细菌的动态变化海洋与湖沼，1994，25（6）62563010王晓颖，席峰，袁建军等虾池沉积环境中若干功能菌及弧菌的时空变化厦门大学学报自然科学版，2006，45，增刊25025611MATTHEWSPAYNE，MIKERHALL，RAYMONDBANNISTERETALMICROBIALDIVERSITY
34、WITHINTHEWATERCOLUMNOFALARVALREARINGSYSTEMFORTHEORNATEROCKLOBSTERPANULIRUSORNATUSAQUACULTURE，2006，258809012钱丽君，张德民，徐小红应用DGGE分析三疣梭子蟹养殖塘底泥细菌的多样性水产学报，2007，31（2）20421013XUHS，ROBERTSN，SINGLETONFL，ETA1SURVIVALANDVIABILITYOFNONCULTURABLEESCHERICHIACOILANDVIBRIOCHOLERARINTHEESTUARINEANDMARINEENVIRONMENTJMIC
35、ROBECOL，1982，8（4）31332314AMANNRI，LUDWIGSCHLEIFERKHPHYLOGENETICIDENTIFICATIONANDINSITUDETECTIONOFINDIVIDUALICROBIALCELLSWITHOUTCULTIVATIONMICROBIOLREV1995，5914316915MORRISCE，BARDINM，BERGEO，ETALMICROBIALBIODIVERSITYAPPROACHESTOEXPERIMENTALDESIGNANDHYPOTHESISTESTINGINPRIMARYSCIENTIFICLITERATUREFROM1975
36、TO1999MICROBMOLBIOL，REV2002，6659261616MUYZERG,WAALEC,UITTRLINDENAGPROFILINGOFCOMPLEXMICROBIALPOPULATIONBYDENATURINGGRADIENTGELELECTROPHORESISANALYSISOFPOLYMERASECHAINREACTIONAMPLIFIEDGENESCODINGFOR16SRRNAJAPPLENVIRONMICROBIOL,1993,59369570017GORDONW,CAROLEJN,JOHNC,ETALMICROBIALDIVERSITYINDEEPSUBSEAF
37、LOORSEDIMENTSASSESSEDBYDENATURINGGRADIENTGELELECTROPHORESISDGGEEB/OLHTTP/WWWCHMBRISACUK/DEEPBUG/MEMBERS/CARDIFF/ISSMPOSTERGWPDF,2002110818GILANDCTHEEFFECTOFANACUTECOPPEREXPOSUREONTHEDIVERSITYOFAMICROBIALCOMMUNITYINNORTHSEASEDIMENTSASREVEALEDBYDGGEANALYSISTHEIMPORTANCEOFTHEPROTOCOLJMARPOLLUTBULL,2004
38、,495650451319HUGENHOLTZP,PITULLEC,HERSHBERGERKL,ETALNOVELDIVISIONLEVELBACTERIALDIVERSITYINAYELLOWSTONEHOTSPRINGJJBACTERIOL,1998,80236637620张宝涛，王立群，伍宁丰等PCRDGGE技术及其在微生物生态学中的应用生物信息学，2006，313213421GIOVANNONI,SJ,TBBRITSCHGI,CLMOYER,ANDKGFIELD1990GENETICDIVERSITYINSARGASSOSEABACTERIOPLANKTONNATURE34560632
39、2FUHRMANJA，MCCALLUMTB，DAVISAAPHYLOGENETICDIVERSITYOFSUBSURFACEMARINEMICROBIALCOMMUNITIESFROMTHEATLANTICANDPACIFICOCEANSAPPLENVIRONMICROBIOL，1993，591294130223SOGINML,MORRISONHG,HUBERJA,WELCHDM,HUSE,SM,NEALPR,ARRIETAJM,HERNDLGJMICROBIALDIVERSITYINTHEDEEPSEAANDTHEUNDEREXPLORED“RAREBIOSPHERE”PROCEEDINGS
40、OFTHENATIONALACADEMYOFSCIENCES,2006,10332121151212024COLWELLRK，XUANOMAOC，CHANGJINTERPOLATING,EXTRAPOLATING,ANDCOMPARINGINCIDENCEBASEDSPECIESACCUMULATIONCURVESECOLOGY，2004，852717272725SINGLETONDR，FURLONGMR，RATHBUNSL，ETALQUANTITATIVECOMPARISONOF16SRRNAGENESEQUENCELIBRARIESFROMENVIRONMENTALSAMPLESAPPLE
41、NVIRONMICROBIOL，2001，6743744376本科毕业设计（20_届）免培养法研究三疣梭子蟹养殖塘细菌群落演替目录1前言12材料和方法121样品采集122水样的总DNA提取1221试剂1222菌体收集1222总DNA提取123PCR扩增16SRDNA全序列22416SRDNA克隆文库的构建及测序3241PCR产物的纯化、回收与连接3242ECOIL感受态细胞的制备3243连接产物的转化325PCRDGGE技术326基于16SRDNA的系统发育学分析53结果与讨论631A克隆文库分析6311PCRDGGE分析6312系统发育学分析732B克隆文库分析9321PCRDGGE分析93
42、22系统发育学分析113316SRDNA克隆文库的多样性分析144小结15参考文献17附录20I摘要三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）是我国海产经济蟹类，但是病害发生频繁。养殖水体中菌群结构及其演替规律对于探明梭子蟹发病原因及制定病害防治措施具有重要意义。本文采用构建16SRDNA克隆文库的方法调查三疣梭子蟹养殖塘水体中七月份和八月份细菌的群落结构。通过两个16SRDNA克隆文库的构建，共获得了131条有效序列。结果发现，两个文库中细菌的多样性丰富，共可归属为五个门变形菌门（PROTEOBACTERIA）、蓝细菌门（CYANOBACTERIA）、放线菌门（ACTINO
43、BACTERIA）、CFB类群（CYTOPHAGAFLAVOBACTERIUMBACTEROIDES）以及厚壁菌门（FIRMICUTES）。其中细菌优势类群为蓝细菌门、变形菌纲和变形菌纲，同时获得了蓝细菌门等通过细菌普通培养法无法获得的类群，故通过克隆文库可以更加全面的反映养殖塘水体细菌群落结构。不同养殖时间，蓝细菌门始终占优势，变形菌门、放线菌门和CFB类群细菌均有所增加，而厚壁菌门消失，两个克隆文库中细菌的群落组成及比例明显不同，即实验期间梭子蟹养殖水体中细菌群落发生了演替现象。关键词三疣梭子蟹；细菌群落演替；克隆文库ABSTRACTPORTUNUSTRITUBERCULATUSISAKI
44、NDOFMARINEECONOMYCRABSINCHINA,BUTDISEASEOCCURSFREQUENTLYASTHECOMMUNITYSTRUCTUREANDSUCCESSIONOFMICROORGANISMINAQUACULTURE16SRDNACLONELIBRARYCONSTRUCTIONWASUSEDTOINVESTIGATEBACTERIALCOMMUNITYSTRUCTUREINTHESAMEWATEROFPORTUNUSTRITUBERCULATUSREARINGPONDINJULYANDAUGUSTBYTHECONSTRUCTIONOFTWO16SRDNACLONELIB
45、RARY,131EFFECTIVESEQUENCESHASBEENOBTAINEDTHEBACTERIALCOMMUNITIESOFTHETWOCLONELIBRARIESWEREFOUNDTOBEDIVERSE,INCLUDINGMEMBERSOFFIVEPHYLIPROTEOBACTERIA,CYANOBACTERIA,ACTINOBACTERIA,CYTOPHAGAFLAVOBACTERIUMBACTEROIDESCFBGROUP,ANDFIRMICUTESBACTERIAASSIGNEDTOCYANOBACTERIA,PROTEOBACTERIAANDPROTEOBACTERIAWER
46、EDOMINATEDCYANOBACTERIAWHICHDIDNTOBTAINEDWITHTHEMETHODOFMICROBIOLOGICALCULTURESOTHROUGHCULTIVATIONINDEPENDENTMETHODCANMOREFULLYREFLECTTHEREARINGPONDWATERBACTERIALCOMMUNITYSTRUCTURETHEBACTERIALCOMPOSITIONSOFTWOLIBRARYWEREDIFFERENTINPARTICULAR,THEPROPORTIONSOFVARIOUSGROUPSSHIFTEDSIGNIFICANTLYACROSSTHE
47、SAMPLINGDATESKEYWORDSPORTUNUSTRITUBERCULATUSBACTERIALCOMMUNITYSUCCESSIONLIBRARYCONSTRUCTION21前言梭子蟹养殖塘一般是一种人工生态系统，其中微生物对这种系统的平衡起着很重要的作用，特别是细菌，对梭子蟹的健康生长也有着非常重要的影响12。在这个生态系统中，细菌群落组是相对稳定的状态，有益菌和有害菌二者的相互制约使得养殖动物处在一个相对稳定的环境中，但一旦细菌群落组成发生了变化，将会导致其生态功能多样性发生较大改变，因此而产生一系列后果，包括水质的恶化和病害的爆发等34。因此，对养殖环境中的细菌群落演替进行研
48、究分析是非常有必要的。越来越多的证据表明，自然界中绝大部分的微生物无法纯培养5，由于不可培养微生物的物种类群及新陈代谢途径、生理生化反应、产物等都存在着丰富的多样性和新颖性，因而比起以往的可培养微生物就具有更加多样和丰富的可以供给人类进行开发和利用的生物资源6。本研究从三疣梭子蟹养殖塘水样中直接提取细菌总DNA，然后通过构建16SRDNA克隆文库的方法来分析水体中微生物的群落演替，从而更为全面的了解不同养殖阶段养殖水体中微生物的群落组成及变化。2材料和方法21样品采集我们于2008年7月12日、8月1日对宁海县明港东坝的三疣梭子蟹养殖塘进行为期两个月的跟踪调查。调查期间，分批次采集水样，采样间
49、隔为2030D。水样的采集时间为11001300AM，采集方法遵照海洋调查规范第6部分7海洋生物调查GB/T1276362007）的要求进行，在采样前开动水车30MIN，使水体充分混匀，然后从深度约05M处取水，采样量为5L，共采样3次。水样采集后贴上标签，立即置于黑暗、4的样品保存箱中保存,在4H内对样品进行处理8。22水样的总DNA提取221试剂TE缓冲液100MMTRISCL（PH80），10MMEDTA（PH80），10贮存液（PH80），分装后121灭菌20MIN，室温保存；溶菌酶缓冲液40MMEDTA（PH80），50MMTRISCL（PH80），10M/V）蔗糖，用022M的过滤器过滤除菌，4保存；STE缓冲液10MMEDTA（PH80），25MMTRISCL（PH80），50MM葡萄糖，121灭菌20MIN，4保存；1工作液（PH80）1MMEDTA（PH80），10MMTRISCL（PH80）9。222菌体收集菌体
