1、本科毕业论文系列开题报告海洋生物资源与环境鲈鱼的PPAR启动子基因克隆一、选题的背景与意义核受体超家族是转录因子中最大的一个家族。过氧化物酶体增殖物激活受体PEROXISOMEPROLIFERATORSACTIVATEDRECEPTOR，PPAR是一类由配体激活的核转录因子，属于核内受体超家族成员。1990年，在啮齿类动物的肝脏中克隆出过氧化物酶体增值物激活受体PPAR后，紧接着克隆出了其同源基因PPAR及PPAR，从此掀起了研究PPAR基因的热潮。近年来，有关PPAR的多态性的研究十分活跃，提高了PPAR的生物学地位及其在人类疾病中作用的认识。有关PPAR的多态性的研究十分活跃，提高了PPA
2、R的生物学地位及其在人类疾病中作用的认识。过氧化物酶体增殖剂活化受体（PPAR是一个由配体激活的核转录因子属于核激素受体（NUCLEARHORMONERECEPTOR）超家族。被激动剂激活以后。该受体可以促进葡萄糖的利用以及胰岛素的增敏。激动剂成为一类全新的型糖尿病治疗药物。前人们正致力于探讨干预PPAR基因转录和影响PPAR蛋白功能的药物及其作用机制，若能全面地揭示PPAR功能，则将对肥胖、糖尿病、肿瘤等疾病的治疗大有益处。近年来有关PPAR多态性的研究成果层出不穷，提高了我们对PPAR生物学地位及其在人类疾病中作用的认识。PPAR在多种疾病发生发展过程中有着重要作用。目前认为PPAR的常见
3、多态性影响胰腺B细胞功能，导致胰岛素分泌周组织对胰岛素敏感性的改变。它与2型糖尿病、肥胖、心血管疾病等发病风险相关联，其多态性的效应可被遗传和环境因素修饰，如肥胖、种族、遗传背景等。但是，各种突变在不同人群的研究结果不一致，可能是由基因互作及基因与环境的相互作用有关。总之从遗传学角度去探讨这些疾病的发病机制，研究干预PPAR基因转录的药物，将会从基因水平对这些疾病的诊断、预防和治疗带来新的突破。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题（一）研究的基本内容1鲈鱼的PPAR启动子基因克隆（二）拟解决的问题1鲈鱼的PPAR启动子基因的引物设计。2掌握PCR及其他分子的克隆的方法三、研究的方法与技术路线1
4、、鲈鱼DNA的提取2、根据已知的MRNA序列，设计克隆启动子的引物3、PCR跑电泳4、连化42C热激，90S，1H摇匀5、选阳性克隆6、序列测序7、去NCBI进行对比四、研究的总体安排与进度201011201012毕业论文选题，进行文献查阅和资料收集20101220101制定具体研究计划和试验方案，完成开题答辩与综述。2010120104完成实验根据已知的MRNA序列，设计克隆启动子的引物PCR跑电泳连化42C热激，90S，1H摇匀选阳性克隆序列测序去NCBI进行对比鲈鱼DNA的提取2010420105数据和材料整理分析总结2010520106论文撰写,提交并答辩五、参考文献1陈刚,罗敏,丁伟
5、,等瘦素受体基因变异与中国人肥胖的关系J中华内分泌代谢杂志,2001,1752983002陈志武,章家胜复方银杏叶对大鼠心肌缺血损伤的保护作用叫中成药J1998,202030313刘仿,王文涓,金呈强PPAR激动剂吡格列酮对JURKATT细胞分化的调节作用J中华微生物学和免疫学杂志,2009,2911LL54勇王,继文PPAR基因在脊椎动物发育过程中的功能研究J生物信息学,2004,2151555利平,付方明PPAR研究进展J国外医学内分泌学分册,2003,23129326乾勇PPAR的结构与功能及其生物学作用J国外医学卫生学分册,2000,752842887刘晓海,董志PPAR的结构及其与疾
6、病的关系J国外医学药学分册国外医学药学分册,2007,3432002058郑以漫,项坤三上海地区汉人瘦素受体基因GLN223ARG变异的研究J上海第二医科大学学报,1999,1954354379李晓燕银杏叶提取物药理作用研究进展刚J药物流行病学杂志,2004,131111310称莉,李齐发,乔永等湖羊肌肉组织HFABP和PPAR基因表达水平与肌内脂肪含量的相关研J中国农业科学2008,413776378311吴江维,杨公社PPAR在八眉猪不同组织中的表达差异J畜牧兽医学报,2008,39327327712俊萍,朱丹妮等银杏叶的化学成分及其抗氧化活性J,中国天然药物2008,612613胡怡秀,
7、藏雪冰银杏茶调节血脂和抗氧化作用实验研究J实用预防医学,2000,7213513614郑以漫,项坤三上海地区汉人瘦素受体基因GLN223ARG变异的研究J上海第二医科大学学报,1999,19543543715乔永湖羊肌肉组织HFABP和PPAR基因表达水平与肌内脂肪含量的相关研J中国农业科学,2008,41113776378316吴江维,杨公社PPAR在八眉猪不同组织中的表达差异J畜牧兽医学报,2008,39327327717田丽霞,刘永坚,刘栋辉,等葡萄糖和玉米淀粉对草鱼生长和肠系膜脂肪沉积的影响J水产学报,2000，24543844118张文炜,徐列明转录因MEF2对多种信号通路的调节及其
8、生物学作用J生物化学与生物物理学报,2004,20442342719王博,吴江维PPAR在八眉猪不同组织中的表达差异J畜牧兽医学报,2008,39327327720金平,孔北华多聚乙烯基亚胺介导的卵巢特异性启动子调控下的自杀基因抑制卵巢癌细胞生长的体外研究J癌症,200578068L121庞卫君,李影脂肪细胞分化过程中的分子事件J细胞生物学杂志,2005,2749750022TANIGUCHIM,GUANLL,ZHANGADIPOGENESISOFBOVINEPERIMUSEULARPREADIPOCYTESJBIOCHEMBIOPHYSRES023KASONO,NISHIDA,TAMEMOT
9、OHTHIAZOLIDINEDIONESINCREASETHENUMTOFPIATCLETSINILILOLLLNETHMMOEYTOPENICPURPURAMICEVIAINHIBITIONOFPHAGOCYTICACTIVITYOFTHERETIEULOENDOTHELIALSYSTEM2009,2611LL824KLIEWERS,XUHE,LAMBERTMHPEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATEDRECEPTORSFROMGENESTOPHYSIOLOGYJRECENTPROGHORMRES,20015623926325KELLERJM,COLLETP,BIANCH
10、IA,ETALIMPLICATIONSOFPEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATEDRECEPTORSPPARSINDEVELOPMENTCELLLIFESTATUSANDDISEASEJINTJDEVBIOL,2000,4442944226DJOUADIF,WEINHEIMERCJ,SAFFITZJE,ETALANDERRELATEDDEFECTINLIPIDMETABOLISMANDGLUCOSEHOMEOTASISINPEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATEDRECAPTORDEFICIENTMICEJJCLININVEST,1998,102108
11、31091毕业论文文献综述海洋生物资源与环境鲈鱼的PPAR启动子基因克隆摘要本文简述了鲈鱼的PPAR的功能，总体介绍了PPAR的研究现状，参考其他物种的PPAR基因序列，克隆测序获得鲈鱼PPAR序列，旨在了解和验证PPAR的功能，以及其在生物学上所发挥的重要意义。关键词鲈鱼PPAR；克隆过氧化物酶体增殖物激活受体PEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATEDRECEPTOR,PPAR是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员，1990年ISSEMANN首先发现了这种能被一类脂肪酸样化合物过氧化物酶体增殖剂PEROXISOMEPROLIFERATORS,PP激活,而被命名为激
12、活受体PEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATEDRECEPTOR,PPAR。根据结构的不同，PPAR可分为、或和三种类型，其中PPAR主要表达于脂肪组织及免疫系统，与脂肪细胞分化、机体免疫及胰岛素抵抗关系密切，是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物TROGLITAZONE,TZDS作用的靶分子，成为近年来研究热点。1研究背景1990年，在啮齿类动物的肝脏中克隆出过氧化物酶体增值物激活受体PPAR后，紧接着克隆出了其同源基因PPAR及PPAR，从此掀起了研究PPAR基因的热潮。近年来，有关PPAR的多态性的研究十分活跃，提高了PPAR的生物学地位及其在人类疾病中作用的认识。有关PPA
13、R的多态性的研究十分活跃，提高了PPAR的生物学地位及其在人类疾病中作用的认识2研究现状近年来有关PPAR多态性的研究成果层出不穷，提高了我们对PPAR生物学地位及其在人类疾病中作用的认识。PPAR在多种疾病发生发展过程中有着重要作用。目前认为PPAR的常见多态性影响胰腺B细胞功能，导致胰岛素分泌周组织对胰岛素敏感性的改变。它与2型糖尿病、肥胖、心血管疾病等发病风险相关联，其多态性的效应可被遗传和环境因素修饰，如肥胖、种族、遗传背景等。但是，各种突变在不同人群的研究结果不一致，可能是由基因互作及基因与环境的相互作用有关。PPAR与肿瘤的关系成为研究热点。已证实PPAR在多种恶性肿瘤组织中均有表
14、达，如肺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌及乳腺癌等。许多研究表明，通过抑制PPAR的表达能够抑制诸如肝癌、食管癌等肿瘤细胞的生长，诱导细胞凋亡、引起细胞周期阻滞、降低肿瘤细胞粘附及转移能力。总之从遗传学角度去探讨这些疾病的发病机制，研究干预PPAR基因转录的药物，将会从基因水平对这些疾病的诊断、预防和治疗带来新的突破。3研究的方法LU鲈鱼DNA的提取；根据已知的MRNA序列；设计克隆启动子的引物；PCR跑电泳；连化42C热激，90S，1H摇匀；选阳性克隆序列测序；NCBI进行对比。4研究前景随的着社会的进步和发展，人们对动物的风味的要求越来越高，科学，合理地调控动物机体脂肪沉积成为动物育种和生产领域
15、的重要课题。鉴于PPAR在脂类代谢方面的重要作用，一些学者也开始了再动物方面的研究。四参考文献1陈刚,罗敏,丁伟,等瘦素受体基因变异与中国人肥胖的关系J中华内分泌代谢杂志,2001,1752983002陈志武,章家胜复方银杏叶对大鼠心肌缺血损伤的保护作用叫中成药J1998,202030313刘仿,王文涓,金呈强PPAR激动剂吡格列酮对JURKATT细胞分化的调节作用J中华微生物学和免疫学杂志,2009,2911LL54勇王,继文PPAR基因在脊椎动物发育过程中的功能研究J生物信息学,2004,2151555利平,付方明PPAR研究进展J国外医学内分泌学分册,2003,23129326乾勇PPA
16、R的结构与功能及其生物学作用J国外医学卫生学分册,2000,752842887刘晓海,董志PPAR的结构及其与疾病的关系J国外医学药学分册国外医学药学分册,2007,3432002058郑以漫,项坤三上海地区汉人瘦素受体基因GLN223ARG变异的研究J上海第二医科大学学报,1999,1954354379李晓燕银杏叶提取物药理作用研究进展刚J药物流行病学杂志,2004,131111310称莉,李齐发,乔永等湖羊肌肉组织HFABP和PPAR基因表达水平与肌内脂肪含量的相关研J中国农业科学2008,413776378311吴江维,杨公社PPAR在八眉猪不同组织中的表达差异J畜牧兽医学报,2008,
17、39327327712俊萍,朱丹妮等银杏叶的化学成分及其抗氧化活性J,中国天然药物2008,612613胡怡秀,藏雪冰银杏茶调节血脂和抗氧化作用实验研究J实用预防医学,2000,7213513614郑以漫,项坤三上海地区汉人瘦素受体基因GLN223ARG变异的研究J上海第二医科大学学报,1999,19543543715乔永湖羊肌肉组织HFABP和PPAR基因表达水平与肌内脂肪含量的相关研J中国农业科学,2008,41113776378316吴江维,杨公社PPAR在八眉猪不同组织中的表达差异J畜牧兽医学报,2008,39327327717田丽霞,刘永坚,刘栋辉,等葡萄糖和玉米淀粉对草鱼生长和肠系
18、膜脂肪沉积的影响J水产学报,2000，24543844118张文炜,徐列明转录因MEF2对多种信号通路的调节及其生物学作用J生物化学与生物物理学报,2004,20442342719王博,吴江维PPAR在八眉猪不同组织中的表达差异J畜牧兽医学报,2008,39327327720金平,孔北华多聚乙烯基亚胺介导的卵巢特异性启动子调控下的自杀基因抑制卵巢癌细胞生长的体外研究J癌症,200578068L121庞卫君,李影脂肪细胞分化过程中的分子事件J细胞生物学杂志,2005,2749750022TANIGUCHIM,GUANLL,ZHANGADIPOGENESISOFBOVINEPERIMUSEULAR
19、PREADIPOCYTESJBIOCHEMBIOPHYSRES023KASONO,NISHIDA,TAMEMOTOHTHIAZOLIDINEDIONESINCREASETHENUMTOFPIATCLETSINILILOLLLNETHMMOEYTOPENICPURPURAMICEVIAINHIBITIONOFPHAGOCYTICACTIVITYOFTHERETIEULOENDOTHELIALSYSTEM2009,2611LL824KLIEWERS,XUHE,LAMBERTMHPEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATEDRECEPTORSFROMGENESTOPHYSIOLOGY
20、JRECENTPROGHORMRES,20015623926325KELLERJM,COLLETP,BIANCHIA,ETALIMPLICATIONSOFPEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATEDRECEPTORSPPARSINDEVELOPMENTCELLLIFESTATUSANDDISEASEJINTJDEVBIOL,2000,4442944226DJOUADIF,WEINHEIMERCJ,SAFFITZJE,ETALANDERRELATEDDEFECTINLIPIDMETABOLISMANDGLUCOSEHOMEOTASISINPEROXISOMEPROLIFERAT
21、ORACTIVATEDRECAPTORDEFICIENTMICEJJCLININVEST,1998,10210831091本科毕业设计（20_届）鲈鱼PPAR启动子的克隆目录引言111实验材料和仪器1111实验材料1112主要试剂和和试剂盒1113主要仪器122实验方法1221基因组DNA提取1222PPAR启动子区域的获取12221特异性引物的设计1223PPAR启动子的克隆122311STPCR反应122322NDPCR反应132333RDPCR反应1324电泳检测与克隆使用引物1325PCR产物的切胶纯化14251重组质粒的构建和检测14252感受态细胞的制备1526重组质粒的转化152
22、7重组质粒的鉴定16271重组质粒的抽提16272重组质粒的PCR检测及测序163实验结果与分析1631鲈鱼PPAR启动子基因序列分析1632鲈鱼PPAR启动子基因功能位点与结构的分析174讨论18致谢错误未定义书签。摘要PPAR（PEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATEDRECEPTOR），即过氧化物酶体增殖剂激活受体，是一类由配体激活的核转录因子，是核受体家族的一员。目前在哺乳动物中发现PPAR存在三种亚型，即PPAR、PPAR也称PPAR和PPAR。它们是配体调节的转录因子，在脂类代谢过程中起非常重要的作用。PPAR的三种亚型参与脂肪细胞分化作用的时相及程度各有不同，
23、通过转染具有分化成脂肪细胞潜能的多种细胞系进行评价，PPAR的成脂作用最强。PPAR具有脂肪组织特异性,能被脂肪酸及外源性过氧化物酶体增殖剂激活,而调控某些参与脂质代谢的酶的表达。为研究PPAR在脂肪组织研究中的表达调节，我们克隆了PPAR起始密码子上游1411BP序列，并使用生物信息学对此序列展开分析，查找其潜在的转录因子识别位点，其中有C/EBPB、CDXA、SRY、AML1A、SOX5、S8、PBX1、GATA等22个潜在的转录结合因子。关键词鲈鱼；PPAR启动子；克隆ABSTRACTPPARPEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATEDRECEPTOR,THEPEROX
24、ISOMEPROLIFERATORACTIVATEDRECEPTORITISACLASSOFLIGANDACTIVATEDNUCLEARTRANSCRIPTIONFACTORANDAMEMBEROFTHENUCLEARRECEPTORFAMILYTHEREARETHREESUBTYPESOFPPAR,NAMELYPPAR,PPARALSOKNOWNASPPARANDPPARTHEYARELIGANDREGULATEDTRANSCRIPTIONFACTORSPPARPLAYAVERYIMPORTANTROLEINLIPIDMETABOLISMPPARTHREESUBTYPESOFCELLSINV
25、OLVEDINTHEROLEOFFATPHASEANDTOVARYINGDEGREES,BYTRANSFECTIONWITHTHEPOTENTIALTODIFFERENTIATEINTOFATCELLSEVALUATEAVARIETYOFCELLLINES,PPARADIPOGENICROLEOFTHESTRONGESTPPARWITHADIPOSETISSUESPECIFIC,WHICHCANBEEXOGENOUSFATTYACIDSANDPEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATED,ANDREGULATIONOFCERTAINENZYMESINVOLVEDINTHEEXP
26、RESSIONOFLIPIDMETABOLISMPPARINADIPOSETISSUEFORTHESTUDYOFTHEEXPRESSIONANDREGULATION,WECLONEDTHEPPAR1411BPSEQUENCEUPSTREAMOFTHESTARTCODON,ANDTHISSEQUENCEUSINGBIOINFORMATICSTOANALYZE,TOFINDPOTENTIALTRANSCRIPTIONFACTORRECOGNITIONSITES,OFWHICHC/EBPB,CDXA,SRY,AML1A,SOX5,S8,PBX1,GATAANDOTHER22POTENTIALTRAN
27、SCRIPTIONBINDINGFACTORKEYWORDSBASSPPARPROMOTERCLONING引言核受体超家族是转录因子中最大的一个家族。过氧化物酶体增殖物激活受体PEROXISOMEPROLIFERATORSACTIVATEDRECEPTOR，PPAR是一类由配体激活的核转录因子，属于核内受体超家族成员。1990年，在啮齿类动物的肝脏中克隆出过氧化物酶体增值物激活受体PPAR后,紧接着又克隆出了其同源基因PPAR和PPAR，从此掀起了研究PPAR基因的热潮1。近年来，有关PPAR的多态性的研究十分活跃，提高了PPAR的生物学地位及其在人类疾病作用的认识2。过氧化物酶体增殖剂活化受
28、体（PPAR是一个由配体激活的核转录因子属于核激素受体（NUCLEARHORMONERECEPTOR）超家族。被激动剂激活以后,该受体可以促进葡萄糖的利用及胰岛素的增敏。激动剂成为一类全新的型糖尿病治疗药物。目前人们正致力于探讨如何干预PPAR基因转录和影响PPAR蛋白功能的药物及其作用的机制，若能全面地揭示PPAR功能，则将对肥胖、糖尿病、肿瘤等疾病的治疗大有益处。近年来有关PPAR多态性的研究成果层出不穷，提高了我们对PPAR生物学地位及其在人类疾病中作用的认识3。目前认为PPAR的常见多态性影响胰腺B细胞功能，导致胰岛素分泌周组织对胰岛素敏感性的改变。它与型糖尿病、肥胖、心血管疾病等发病
29、风险相关联，其多态性的效应可被遗传和环境因素修饰，如肥胖、种族、遗传背景等。但是，各种突变在不同人群的研究结果并不一致，可能是由基因互作及基因与环境的相互作用有关4。脂类在鱼体的营养代谢活动中担任着多种角色，作为鱼类的能量来源之一，有1020来自脂类的分解供能。另外,脂类还能提供鱼体所需的必需脂肪酸促进脂溶性维生素和类胡萝卜素等的吸收，改善动物的健康状况6。所以适当的脂肪储存是必须的。但是当脂肪含量过多时，就会在组织间转化为体脂沉积下来，将有可能影响鱼类的肉质。哺乳动物脂肪生成主要在肝脏组织中，而鱼类的脂肪合成主要在于肝脏、心脏、肠以及脂肪组织中。基因表达分析显示脂肪合成转录因子的表达模式在哺
30、乳类与鱼类存在巨大的差异。这些分析表明哺乳类与鱼类的脂肪合成是不同的9。PPAR是动物脂肪组织发育的重要调控因子，其信号通路影响细胞系统与脂肪代谢。PPAR在脂肪组织分化中的作用已在人体和小鼠胎盘试验中得到证实11。PPAR能够诱导肝细胞表达载脂蛋白、脂肪酸氧化酶系与脂蛋白脂酶等，从而促进脂质的氧化代谢，降低血脂浓度。PPAR的活化能够选择性诱导地与脂肪酸吸收相关的基因在脂肪组织的表达，如脂蛋白脂酶、脂肪酸转运蛋白与酰基COA合成酶基因等，但并不改变这些基因在肌肉组织中的表达，从而导致脂肪酸在肌肉组织中的相对缺失。对人PPAR的研究发现PPAR2在脂织中表达量很高，该基因PRO12ALA多态性
31、与血清载脂蛋白B在不同基因型个体间的显著差异有关，证明PPAR2多态性可能与脂肪代谢异常有着密切关系14。1实验材料和仪器11实验材料鲈鱼购买于宁波水产品大世界，活体取肌肉组织液氮速冻后备用。12主要试剂和和试剂盒氨苄青霉素上海生工，酵母提取物OXOID公司，胰蛋白胨OXOID公司，NACL，甘油上海生工，DNA凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒碧云天生物有限公司PMD18TVECTOR、UNIVERSALGENOMICDNAEXTRACTIONKITVER30、GENOMEWALKINGKIT、TAQDNA聚合酶TAKARA公司13主要仪器SORVALLFRESCO台式高速冷冻离心机（SORVA
32、L公司），PCR仪（BIORAD公司），ND1000型微量紫外分光光度计THERMO公司，YDS3液氮罐四川亚西橡塑机器有限公司，电泳仪北京六一仪器厂，HVE50型高压灭菌锅HIRAYAMA公司，DK8D电热恒温水槽上海精宏实验设备有限公司2实验方法21基因组DNA提取使用研钵进行匀浆时（1）100MG的鲈鱼组织入冰浴预冷的研钵中，快速用力展研成匀浆。（2）650L的SOLUTIONA和09L的RNASEA1（使用时请混匀），温和研磨30秒钟。注）使用上述注）的实验材料时，请在加入SOLUTIONA及RNASEA1后，将研钵置65水浴上研磨1分钟。（3）650L研磨好的组织匀浆液移至COLLE
33、CTIONTUBE中。如果匀浆体积不足650L，请补充SOLUTIONA至650L，65保温5分钟。22PPAR启动子区域的获取221特异性引物的设计根据本实验已经克隆到的PPAR基因CDNA全长，按计三条特异性引物，即SP1、SP2、SP3。图1特异性引物设计示意图FIG1SCHEMATICDESIGNOFSPECIFICPRIMERS根据经过验证的已知序列区（最好不少于500BP）设计三个特异性引物（见上图）设计方向为需要扩增的未知区域方向，SP2的位置应设计在SP1的内侧，SP3位于SP2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，一般以60100BP为宜。引物设计原则引物的长度为2226
34、NT，GC含量4555，TM值6070，引物TM值计算公式TM693041（G/C）100650/L（引物碱基数）。其他要求和普通PCR反应用引物相同。232311STPCR反应以APPRIMER（四种中的任意一种，以下以AP1PRIMER为例）作为上游引物，SP1PRIMER为下游引物，进行1STPCR反应。按下列组份配制1STPCR反应液。TEMPLATE（基因组DNA）X500NG,DNTPMIXTURE（25MMEACH）8L,10LAPCRBUFFERI（MG2PLUS）5L,TAKARALATAQ（5U/L）05L,AP1PRIMER（100PMOL/L）1L,SP1PRIMER（
35、10PMOL/L）1L,DH2OUPTO50L1STPCR反应条件如下941MIN981MIN9430SEC651MIN5CYCLES722MIN9430SEC；253MIN；722MIN9430SEC；651MIN；722MIN9430SEC；651MIN；722MIN15CYCLES9430SEC；441MIN；722MIN7210MIN2322NDPCR反应将1STPCR反应液稀释11000倍后，取1L作为2NDPCR反应的模板，以AP1PRIMER为上游引物，SP2PRIMER为下游引物，进行2NDPCR反应。按下列组份配制2NDPCR反应液。TEMPLATE（1STPCR反应液）1L
36、,DNTPMIXTURE（25MEACH8L,10LAPCRBUFFERII（MG2PLUS）5L,TAKARALATAQ（5U/L）05L,AP1PRIMER（100PMOL/L）1L,SP2PRIMER（10PMOL/L）1L,DH2OUPTO50L2NDPCR反应条件如下9430SEC；651MIN；722MIN39430SEC；651MIN；722MIN315CYCLES9430SEC；441MIN；722MIN37210MIN2333RDPCR反应将2NDPCR反应液稀释11000倍后，取1L作为3RDPCR反应的模板，以AP1PRIMER为上游引物，SP3PRIMER为下游引物，进
37、行3RDPCR反应。按下列组份配制3RDPCR反应液。TEMPLATE（2NDPCR反应液）1L,DNTPMIXTURE（25MEACH8L,10LAPCRBUFFERII（MG2PLUS）5L,TAKARALATAQ（5U/L）05LAP1PRIMER（100PMOL/L）1L,SP3PRIMER（10PMOL/L）1L,DH2OUPTO50L3RDPCR反应条件如下9430SEC；606821MIN；7224MIN39430SEC；606821MIN；7224MIN315CYCLES9430SEC；441MIN；7224MIN37210MIN24电泳检测与克隆使用引物取1ST，2ND，3R
38、DPCR反应液各5UL，使用1的琼脂糖凝胶进行电泳。由于第一次克隆到的片段过短，我们在第一次克隆到的片段基础下上设计引物继续克隆PPAR启动子区域。表1引物对克隆的花鲈的PPAR基因5侧翼区TABLE1PRIMERSFORCLONINGTHE5FLANKINGREGIONOFLATEOLABRAXJAPONICUSPPAR引物名称引物序列（5TO3）PRIMERNAME表PRIMERSEQUENCEPPGA1SP1TGTTGGTCAGGTGCTCTTCGCTCTPPGA1SP2TGAGGAGATGCAGGATACAAGCGGPPGA1SP3TGGAGGCGTAGTCTAACGTGGACAPPG
39、A1SP4AGGTCCACGGCGTTCAGACTGAAAPPGA2SP1TAGACACGCACACACACTCAGCACPPGA2SP2TGAACTCTGGCACTGAGAAATGGGTPPGA2SP3TTCCTCTGTTGCTGTTTGGGTGGCPPGA2SP4CAAAAGCACACAGAGAGCAGGGACT25PCR产物的切胶纯化切胶回收清晰的电泳条带，以SP3PRIMER为引物对PCR产物进行DNA测序，具体实验步骤如下1琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其他DNA尽可能分开，然后在紫外分析仪上用干净的手术刀割下含需回收DNA的琼脂块，放入15ML离心管中。判定DNA片段的位置时尽可
40、能使用长波长紫外光，在紫外光下照射的时间应尽可能短。2按照100L/100MG琼脂糖凝胶的比例加入BINDINGBUFFER，置于5060水浴中10MIN，使胶彻底融化。加热融胶时，每2MIN混匀一次。3将融化的胶溶液转移至套放在收集管内的纯化柱中，室温放置1MIN。12000RPM离心1MIN。4取下纯化柱，倒掉收集管中的废液，将纯化柱放入同一个收集管中，加入700LWASHSOLUTION，12000RPM室温离心1MIN。5重复步骤4一次。6取下纯化柱，倒掉收集管中的废液，将纯化柱放入同一个收集管中，12000RPM室温离心1MIN。7将纯化柱放入一根新的15ML离心管中，在柱子膜中央加
41、1030L水（PH70），室温或37放置5MIN。812000RPM室温离心1MIN，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于20备用。251重组质粒的构建和检测PCR纯化产物与PMD18T载体的连接经回收纯化的PCR产物与PMD18T载体进行连接，10L反应体系如下产物7L，PMD18T载体3L，SOLUTIONI250L。将上述混合物混匀，置4连接过夜。252感受态细胞的制备材料、试剂和仪器设备大肠杆菌DH5。01MOL/LCACL2称取分子量为147的CACL22H2O（上海生工生物工程技术服务有限公司）147G加蒸馏水定容至100ML，高压灭菌后4保存备用，甘油（上海试剂
42、四厂）。LB培养基950ML蒸馏水中加入5G酵母提取物（OXOID公司），10G胰蛋白胨（OXOID公司），5GNACL。调整PH值至70定容至1000ML。如需要固体培养基则每1000ML液体培养基中加入15G琼脂，高压灭菌后备用。氨苄青霉素（上海生工生物工程技术服务有限公司）。主要仪器设备方法BIOFUGESTRATAS大型冷冻离心机（HERAEUS公司）。（1）从LB平板上挑取新活化的ECOLIDH5单菌落，接种于35MLLB液体培养基中，37振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1100150的比例接种于100MLLB液体培养基中，37振荡培养23小时至OD60005左右
43、。（2）将培养液转入50ML离心管中，冰上放置10MIN，然后于4下4000RPM离心10MIN。（3）弃去上清，用预冷的01MOL/L的CACL2溶液10ML轻轻悬浮细胞，冰上放置1530MIN后，4下4000RPM离心10MIN。（4）重复步骤（3）。（5）弃去上清，加入2ML预冷的01MOL/L的CACL2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，加入甘油至终浓度15即成感受态细胞悬液。（6）感受态细胞悬液分装成200L的小份，贮存于70备用。注意事项（1）细胞生长状态和密度不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入
44、对数生长期时为好。（2）试剂的质量所用的试剂，如CACL2等均需是最高纯度的GR或AR，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。（3）防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，枪头等要高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。26重组质粒的转化（1）去5L连接产物加入100L感受态细胞悬液中，轻轻混匀，冰浴20MIN。（2）42水浴热激90S，急速冰上冷却，冰浴23MIN。（3）加800L37预热的LB液体培养基，37170RPM振荡培养45
45、60MIN。（4）将100L菌液涂布于加有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37培养过夜。27重组质粒的鉴定重组质粒的鉴定一般有两种，即限制性内切酶酶切和PCR检测。271重组质粒的抽提碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为当菌体在NAOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。质粒抽提采用碱裂解法所用溶液配方如下溶液50MMO1L葡萄糖5MMO1L三羟甲基氨基甲烷TRISHCLPH8010MMO1L乙二胺四乙酸EDTAPH80溶液II0
46、4MO1LNA0H，2SDS十二烷基硫酸钠，用前等体积混合。溶液III5MO1L醋酸钾60ML冰乙酸115ML水285ML步骤如下（1）取15ML培养物入微量离心管中，室温离心8000G1MIN，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。（2）将细菌沉淀重悬于100L预冷的溶液中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。（3）加200L新鲜配制的溶液，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），冰上放置5MIN。（4）加入150L预冷的溶液，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，冰上放置5MIN。（5）12000G离心7MIN。（6）移上清于一新离心管中，加入1ML预冷的无水乙醇，混匀，室温放置25MIN，12000G离心
47、5MIN。（7）1ML预冷的70乙醇洗涤沉淀12次，弃上清，将沉淀在室温下晾干。（8）20L灭菌蒸馏水溶解沉淀。20保存备用。272重组质粒的PCR检测及测序以PMD18T载体通用引物M13F和M13R为上、下游引物，进行PCR检测，PCR反应体系同21342，引物序列见表2，PCR反应条件如下预变性945MIN；9430S，5230S，722MIN，32个循环；最后72延伸4MIN。表2PMD18T载体的通用引物TABLE2PMD18TVECTORPRIMERS引物名称引物序列53M13FGGTAACGCCAGGGTTTTCCM13RCAGGAAACAGCTATGACC3实验结果与分析31鲈
48、鱼PPAR启动子基因序列分析应用基因组步行技术，经过第1次WALKING扩增得到约600BP的PCR条带，将该条带回收、克隆、测序后得到605BPDNA片段，除去已知序列62BP,获得未知序列543BP；之后在第一次WALKING的基础上设计四条特异性，经过四轮不对称PCR获得片段大小约1000BP条带，将该条带回收、克隆、测序后得到935BPDNA片段，两次WALKING之后拼接获得PPAR启动子片段大小1411BP,序列如下ATGTGGCCCTAGTGGCCCCCTATACATATAAACTATTTTTGTCCTAGACTGTATCAGATTCAAACAAGTAACTTGTAGCTTTAA
49、AGCCTGTAGTTTAGAAAAAACACTTTAACAATTAAATGCATCACATAAACAAGATATTGTACTCATTTCTGCATCATCAAACAACGTTGTACAAACGTACCCTTGATTATATAGCCCTGAATGTGGTTTGCTTTTGTGTGGACCGTAGTAACCTCCGATGACTGGACTTTGACCATCTCGGCTGACTTCTCTCCTCCAATGTGTGATCTGAGTTAGATATTGGAATGACTGAAGAGCCTTCATTCATTTGTATCAACAAAGAGCTGAATATCTAGAGGGAGCCGTGTGGTAGCAATCTGTTTCCAAGACTTTCTCAATGTTGGTTAAGCTAATTTTTCATACATTACTCAGGTAA
