1、本科毕业论文系列开题报告食品质量与安全花生中黄曲霉素的分析一、选题的背景与意义黄曲霉毒素是一类有毒致癌化合物，污染粮食及其制品，给人类健康造成严重威胁。自20世纪60年代以来,有关黄曲霉毒素的危害被大量报道，以致黄曲霉毒素已成为最受人们关注的一种真菌毒素。因此，运用准确、快速、简便的检测方法进行食品的货架期研究对人类食品安全有重要意义。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容以花生为实验材料，运用黄曲霉毒素B1试剂盒，在不同温度和湿度下对其货架期进行研究，并判断样品中黄曲霉毒素含量突变的时间点，对花生的储藏条件和储藏时间进行数据整理和系统分析。拟解决问题1、运用黄曲霉毒素B1试剂盒对恒温变
2、湿和恒湿变温条件下储藏的样品进行黄曲霉毒素含量测定2、固定储藏条件下依据储藏时间制定定点测量毒素含量，整理数据确定该储藏条件下含量突变点和最长货架期三、研究的方法与技术路线研究方法1、将花生分组，分别放置在不同的温度和湿度下，摸索其含量增长的时间范围，每个储藏条件下按时间坐标置大约5个点，进行实验2、采取黄曲霉素B1试剂盒快速检测方法，对各批花生样品进行黄曲霉素含量的测定3、对不同储藏条件下的花生样品进行前处理，收集黄曲霉素提取液，以备测定4、按照试剂盒说明书进行操作，同时做空白组进行对照5、运用酶标仪对样品和空白组进行吸光值测定，查标准曲线，得出样品中黄曲霉素含量6、对实验所得数据进行整理分
3、析，得出每个储藏条件下毒素含量突增的时间点以及相应的毒素含量，进而得出各储藏条件下的花生的货架期技术路线四、研究的总体安排与进度2009年9月2010年11月1、实验前的准备工作查找资料，了解实验的相关信息和实验方法2、文献整理，实验方案的确定，完成开题报告和综述2010年12月2011年3月1、根据制定的实验方法进行实验将不同条件下储藏的花生样品去皮减碎将花生分批放置在设定的温度和湿度下进行储藏按照黄曲霉素B1试剂盒说明对样品进行实验操作用酶标仪对样品进行吸光值的测定，同时做空白对照运用黄曲霉素B1试剂盒绘制黄曲霉素标准曲线查标准曲线得样品中黄曲霉素含量加入25ML甲醇水（11）溶液和20M
4、L石油醚分液漏斗分液，对样品提取液进行稀释整理分析数据，得出花生在每个储藏条件下的货架期以及其毒素含量2、对实验所得数据进行初步整理2010年4月2010年5月1、整理实验数据，进行实验分析2、毕业论文撰写3、毕业论文定稿，完成毕业设计五、主要参考文献1BROWNRL,BHATNAGARD,CLEVELANDTE,ETALRECENTADVANCESINPREHARVESTPREVENTIONOFMYCOTOXINCONTAMINATIONAKKSINHAEDSMYCOTOXINSINAGRICULTUREANDFOODSAFETYCNEWYORKMARCELDEKKER,1998351379
5、2CHARLESL,WILSON,SAMIRDROBYMICROBIALFOODCONTAMINATIONMNEWYORKCRCPRESS,20012082293BHATNSGARD,YUJ,EHRLICHKCTOXINSOFFILAMENTOUSFUNGIAINMBREITENBACHEDSFUNGALALLERGYANDPATHOGENICITY,CHEMIMMUNOLCVOL81,BASEL,KARGER,20021672064栾丽杰黄曲霉毒素与食品安全山东省农业管理干部学院学报,20052165HSUICETALNATURE,19913504274286邓卓霖,等中华肿瘤杂志,1997
6、,19118217SKIPPERPL，TANNENBAUMSRPROTEINADDUCTSINTHEMOLECULARDOSIMETRYOFCHMICALCARCINOGENEJCARCINOGENESTS（LOND），1990，11（3）5075188南燕浅谈粮油食品中黄曲霉毒素的污染粮油仓储科技通讯,2007059李佐卿免疫亲和柱HPLC快速测定蜂蜜中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2J光谱实验室,2001,181283110“NATURALPOISONS”CHAP26OFFICIALMETHODOFANALYSISASSOCIATIONOFOFFICIALANALYTICALCHEMIST
7、SM1980198426142511王晶,王林,黄晓蓉食品安全快速检测技术M北京化学工业出版社,2002,929412WJBACHMANANDJTSTEWARTHPLCPOSTCOMLUMNDERIVATIZATIONTEACHNIQUESJLCGC,198938,713JJAIMEZ,ETALAPPLICATIONOFTHEASSAYOFAFLATOXINSBYLIQUIDCHROMMATOGRAGHYWITHFLUORESCENCEDETECTIONINFOODANALYSISMJOURNALOFCHROMATOGRAPHYA,200088211014中国国家标准SGB/T50092222
8、003食品中黄曲霉毒素的测定北京中国标准出版社出版,2004,17918415张鹏,张艺兵,赵卫东花生中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的多功能净化柱2高效薄层色谱分析J分析测试学报,1999,186626416涂文升高效液相色谱法同时检测食品中四种黄曲霉毒素J中华预防医学杂志,2002,36534334517陶义川酶联免疫测定法M北京人民出版社,198418CHUFSUSNOIAPPLANDENVIRONMICROBIOLMPUBLISHEDBYTHEAMERICANSOCIETYFORMICROBIOLOGY,197751125112819GB/T5009222003食品中黄曲霉毒素的测定
9、S20AOACINTERNATIONALOFFICIALMETHODSOFANALYSISMODI2FIEDM16THEDITION,METHOD99034,AOAC,ARLINGTON,VA,199521杨长志,康庆贺,田丰,等免疫亲和柱法测定小麦中黄曲霉毒素J化学工程师,2002,936323322王晶,张鹏,张艺兵,等免疫亲和层析净化荧光光度法快速测定酱油及醋中黄曲霉毒素J2003,15541241423食品中黄曲霉毒素的测定中华人民共和国国家标准GB/T18979200324张淼,王家传,张培正我国食品安全存在的问题及解决的科技途径,中国果蔬J2004,6434425农军目前国家几种检
10、测黄曲霉毒素B1标准方法的分析与探讨J分析与测试,2003,增刊535426蔡正森,钟文辉,张东升,等ELISA法和HPLC法检测粮油食品中黄曲霉毒素B1含量的比较研究J中国卫生检验杂志,2004,143302304毕业论文文献综述食品质量与安全食品中黄曲霉毒素含量分析摘要黄曲霉毒素是一类有毒致癌化合物,易造成粮油类食品及其制品的污染,给人类健康造成严重威胁，带来食品安全隐患。针对于目前应用于食品中黄曲霉毒素的检测方法，本文进行了简要介绍和评述，并对近年来应用于黄曲霉毒素B1的快速检测方法的研究进展和发展趋势进行了综述和讨论。关键词黄曲霉毒素B1；检测方法；研究进展黄曲霉毒素AFLATOXIN
11、,AFT是主要由黄曲霉和寄生曲霉等真菌所产生的一类有毒的次生代谢物。在世界不同地区都已发现了这些真菌大量存于供人类食用的食品中，黄曲霉毒素污染已带来严重的食品安全问题1,2。20世纪60年代以来，有关黄曲霉毒素的危害被大量报道，以致黄曲霉毒素成为最受人们关注的一种真菌毒素3。因此，寻求简便、快速、准确的检测方法，对黄曲霉毒素进行高效定性定量分析是黄曲霉毒素研究的一个重要方面。1黄曲霉素概况黄曲霉毒素AFLATOXIN，简称AFT是一种真菌毒素,由黄曲霉和寄生曲霉等真菌所产生的次级代谢产物,其主要是在一定条件下由粮油食品上常见的黄曲霉AFLAVASLINK和寄生曲霉APERASILICUSSPE
12、AVE所产生的有毒的次级代谢产物。其它某些霉菌和放线菌在适宜条件下也能产生该毒素。黄曲霉毒素是一类结构类似的化合物,其在结构上都含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮又叫香豆素。目前已经分离鉴别出20多种毒素,主要有B和G两大类。其中，在紫外线照射下产生蓝紫色荧光的称为B类黄曲霉毒素AFTB；产生黄绿色荧光的称为G类黄曲霉毒素AFTG。其中以黄曲霉毒素B1最为常见,毒性最大,致癌性也最强,故在食品检测中以黄曲霉毒素B1为污染指标。2影响黄曲霉毒素产生的因素21温度和水分温度和水分是影响黄曲霉生长的主要因素。饲料中水分含量在12以上，相对湿度为85左右，温度为27都足以使黄曲霉生长并产生毒素。据研究表
13、明，黄曲霉毒素最易污染含水在17左右的谷物。22营养成分花生、花生油、玉米、大米、棉籽、咖啡、可可籽、畜禽饲料4等最易受到黄曲霉毒素污染；大麦、小麦、咸肉、火腿、香肠、家庭自制的面酱等,也易受黄曲霉毒素污染。23氧气和CO2的体积分数一般低氧体积分数或高CO2体积分数可以抑制黄曲霉的生长，特别在相对湿度小并且低温的情况下效果显著5。3黄曲霉毒素的毒性黄曲霉毒素是一种肝毒素,主要对肝脏造成损害,其毒性是人们所熟知的剧毒物KCN氰化钾的10倍,为砒霜的68倍,被列为极毒毒素。同时，黄曲霉毒素也是目前发现的化学致癌物中致癌性最强的物质之一，其致癌性比已知的致癌物二甲基亚硝酸高75倍,为奶油黄二甲基偶
14、氮苯的900倍。黄曲霉毒素可引起急性中毒、慢性中毒和癌症。31黄曲霉毒素的危害黄曲霉毒素为肝脏致癌型毒素，被国际癌症研究组织（IARC）指认为有足够证据证明的致癌物,它兼有致癌和促癌的作用，可引起肝细胞坏死、肝硬化，并诱发肝癌、胃癌等,造成动物代谢系统紊乱,是目前发现的最强的致癌物质之一。食用被黄曲霉毒素严重污染的食品后会出现发热、腹痛、呕吐、食欲减退的症状，严重时出现肝脾肿大、肝区疼痛、皮肤黏膜黄染、腹水、下肢浮肿及肝功能异常等中毒性肝病症状，也可能会出现心脏扩大、肺水肿，甚至痉挛、昏迷等症状。由于不易防止食物被真菌污染，因此人们对长期食用低剂量黄曲霉毒素污染的可能性非常关注。除作为诱变剂和
15、致癌剂之外，黄曲霉毒素也可以影响免疫系统，使畜禽对多种传染性疾病的易感性增加。慢性中毒情况下，畜禽除了生产力稍有下降外，临床症状不很明显，因此不易诊断。此外，黄曲霉毒素中毒目前尚无特效治疗药物。32AFT对DNA的损伤1991年HSU6发现AFTB1可能使P53基因249位密码子发生颠换7。1997年邓卓霖证明这一理论，并发现是249位密码子第3号位点发生了GT颠换，从而确定了AFT对DNA的损伤8。321AFTB1与蛋白质结合AFTB1白蛋白结合物是一种黄曲霉毒素暴露的长期标志。它的半衰期为1420天，与正常健康人的白蛋白半衰期相似，AFTB1白蛋白加和物是稳定的，可作为AFTB1暴露超过周
16、或月的靶向生物标志物9。322AFT与鸟嘌呤结合AFT可与N7嘌呤结合生成AFT1N7鸟嘌呤加合物，该加合物与肝具显著相关性,并在个体水平上提供了AFT暴露。4黄曲霉毒素对粮油食品的污染黄曲霉毒素主要污染粮油及其制品,其中以花生和玉米最为严重。黄曲霉是粮油食品上最常见的霉菌之一,易在玉米、稻谷、花生、桃仁、果仁等粮食和坚果上生长,其生长温度范围是647,生长最适温度为3038，生长最低相对湿度为8086。最适产毒温度为2430,最适产毒相对湿度为8590。黄曲霉在水分为185的玉米、稻谷、小麦上生长时,于第3D开始产生黄曲霉毒素,第10D毒素含量达到最高峰。近几年来,在酒类、酱油、豆酱等部分调
17、味品、营养饮料、食品工业用的酶制剂等中也相继发现黄曲霉毒素的存在,原因是酿造原料和辅料在运输或储藏过程中遇雨受潮而发生了霉变。此外,用霉变的玉米喂养畜禽,黄曲霉毒素就会在动物体内畜积,给人类带来食用危害10。5黄曲霉毒素的检测方法目前，食品中AFB1限量已经成为限制出口的技术壁垒，为保障食用者的健康及出口贸易的需要,提高AFB1的检测能力、发展快速准确灵敏的检测技术势在必行。自20世纪60年代以来,所建立的检测方法已经达30余种,可分为五大类一类是定性检测方法,主要是一些简单生物学方法约10种,现在已停止使用；第二类是半定量检测方法,如薄层色谱法TLC；第三类是定量检测方法，包括建立在色谱基础
18、上的理化方法，如液相色谱法LC、高效液相色谱法HPLC和近年来新发展起来的质谱检测MASS；第四类是建立在免疫化学基础上的快速测定的方法，如放射免疫测定RIA和酶联免疫测定方法ELISA；第五类是免疫化学和仪器分析结合的方法，免疫亲和柱荧光分光光度法、免疫亲和柱HPLC法1115等。下面主要介绍TLC、HPLC和LISA三类。1薄层色谱法TLC。TLC法是检测AFB1最常用的方法,也是我国测定食品及饲料中AFB1的国家标准方法之一。其原理是在试样中黄曲霉毒素B1经提取、浓缩、薄层分离后,于波长365NM紫外光下产生蓝紫色荧光,并根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来进行含量测定16。TLC有单向
19、展开和双向展开法,其中，双向展开法能够进一步除去样品中的杂质,提高检测的灵敏度。虽然TLC法设备简单、成本低，易于普及到基层单位测定,目前国内外仍然使用,但由于该方法操作步骤较多,样品前处理烦琐,并且提取和净化效果不够理想，提取液中所含杂质较多，因此在展开时影响斑点的荧光度，易导致灵敏度下降。但TLC法是检测AFB1的经典方法,仍作为普通实验室的常用方法。目前，在TLC法基础上又发展出了高效薄层层析法HPTLC，该法可同时测定B1、B2、G1、G2四种黄曲霉毒素，具有样品处理过程简单、净化效果好、检测速度快、效率高的特点。张鹏、赵卫东、张艺兵等采用以多功能净化柱MFC净化结合高效薄层色谱法测定
20、食品中黄曲霉毒素,以空白样品为基底，进行05G/KG、20G/KG、10G/KG三个水平回收率实验，平均回收率可达到86599017。2高效液相色谱分析法HPLC。HPLC是近几年发展起来的AFB1的检测方法,主要利用荧光检测器进行检测,在适宜的流动相下,采用反相C18柱,使多种黄曲霉毒素同时进行分离。其原理为样品中的黄曲霉毒素B1经柱层分离后,通过对色谱峰的面积的测量来进行含量计算。该方法的优点是特异性强、灵敏度高、定量准确，可以同时分离多种黄曲霉毒素，操作简便，定量精确，适用于大批量样品的分析。但其所需色谱仪、积分仪的价格昂贵，且前处理复杂，建立方法比较困难，操作时需要专门的技术人员，目前
21、尚未能广泛使用。涂文升应用该方法同时检测食品中4种黄曲霉毒素，其分离效果好，重复性强，最低检出限达到PG级水平，回收率在9261992518。3酶联免疫法ELISA。ELISA方法是利用免疫学、酶及生化技术来对AFB1进行检测,开辟了AFB1分析方法的新领域。ELISA是20世纪70年代出现的新免疫技术，最初由荷兰学者VANWEEMAN和瑞典学者ENGVALL与PERLMAN同时提出19，主要应用于病毒的检测，70年代中后期开始用于真菌毒素的检测20。其原理是样品中的黄曲霉毒素B1与定量特异性抗体进行反应,多余的游离抗体与酶标板内的包被抗原相结合，在加入酶标记物和底物后显色，并与标准比较来测定
22、含量。该方法灵敏度高，特异性较强，检测结果准确稳定，实验操作污染少，一次实验同时可检测多个样品。我国应用于测定食品中曲霉毒素的酶联免疫方法原理是试样中的AFB1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后进行显色，再与标准比较测定含量21。目前AOAC在检测食品中黄曲霉毒素时,常用该方法对玉米、花生、棉籽和花生酱中黄曲霉毒素B1、B2、G1进行检测。酶联免疫吸附斑点免疫筛选杯筛选分析1990年首次通过AOACIUPAC方法22,在协同实验中,采用ELISA法得到的正确检测黄曲霉毒素污染阳性样品95的置信区间。6存在问题及展望自20世纪
23、五、六十年代以来，对粮油及其制品中黄曲霉毒素B1的检测逐渐探索出了多种方法。这些方法都曾经在各个历史时期对黄曲霉毒素检测作出了一定贡献，但也都存在着操作复杂、污染大、对仪器设备要求高、假阳性率高、检测时间长等缺陷。随着技术的发展，已经不能适应当代社会的污染小、灵敏度高、检测时间短、操作简单的检测要求。故以免疫分析为基础的准确、快速、无污染、智能化检测技术成为黄曲霉毒素B1快速检测方法研究中的热点。AFB1免疫亲和技术与仪器如HPLC分析联用的检测方法明显优于传统的ELISA方法,已被国内外农产品及食品检疫部门接受应用2324，而我国目前食品中黄曲霉毒素的测定采用的就是免疫亲和层析净化高效液相色
24、谱法和荧光光度法25。然而，这类方法也存在着免疫亲和微柱纯化样品成本高、样品处理依赖手工操作、检测过程自动化和检测结果智能化程度低的问题2628。免疫亲和微球纯化结合快速专用速测仪实现AFB1的快速定量检测被认为是未来AFB1快速检测技术发展的趋势。随着AFT特异性抗体研制的成功和技术上的进步，使高质量抗体更易于获得，从而使免疫化学技术在AFT分析测定方面得到了快速发展和广泛应用；近年来，生物技术和免疫学技术的迅猛发展，生物技术与免疫学技术相结合将会对AFT及各种致病微生物检测产生巨大的影响，例如，PCR技术的广泛应用，生物传感器技术的进步和应用以及免疫学方法的发展，这些技术将会发挥越来越重要
25、的作用。参考文献1BROWNRL,BHATNAGARD,CLEVELANDTE,ETALRECENTADVANCESINPREHARVESTPREVENTIONOFMYCOTOXINCONTAMINATIONAKKSINHAEDSMYCOTOXINSINAGRICULTUREANDFOODSAFETYCNEWYORKMARCELDEKKER,19983513792CHARLESL,WILSON,SAMIRDROBYMICROBIALFOODCONTAMINATIONMNEWYORKCRCPRESS,20012082293BHATNSGARD,YUJ,EHRLICHKCTOXINSOFFILAM
26、ENTOUSFUNGIAINMBREITENBACHEDSFUNGALALLERGYANDPATHOGENICITY,CHEMIMMUNOLCVOL81,BASEL,KARGER,20021672064DILARANILUFER,DILEKBOYACIOGLUCOMPARATIVESTUDYOFTHREEDIFFERENTMETHODSFORTHEDETERMINATIONOFAFATOXINSINTAHINIJJAGRICFOODCHEM2002,50,337533795栾丽杰黄曲霉毒素与食品安全山东省农业管理干部学院学报,20052166HSUICETALNATURE,1991350427
27、4287NANUALEE,SHUOWANG,ROBINDALLAN,ETALARAPIDAFLATOXINB1ELISADEVELOPMENTANDVALIDATIONWITHREDUCEDMATRIXEFFECTSFORPEANUTS,CORN,PISTACHIO,ANDSOYBEANSJJAGRICFOODCHEM2004,52,274627558邓卓霖等中华肿瘤杂志,1997,19118219SKIPPERPL,TANNENBAUMSRPROTEINADDUCTSINTHEMOLECULARDOSIMETRYOFCHMICALCARCINOGENEJCARCINOGENESTS（LOND
28、）,1990,11（3）50751810南燕浅谈粮油食品中黄曲霉毒素的污染粮油仓储科技通讯,20070511李佐卿免疫亲和柱HPLC快速测定蜂蜜中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2J光谱实验室,2001,181283112“NATURALPOISONS”CHAP26OFFICIALMETHODOFANALYSISASSOCIATIONOFOFFICIALANALYTICALCHEMISTSM1980198426142513王晶,王林,黄晓蓉食品安全快速检测技术M北京化学工业出版社,2002,929414WJBACHMANANDJTSTEWARTHPLCPOSTCOMLUMNDERIVATIZAT
29、IONTEACHNIQUESJLCGC,198938,715JJAIMEZ,ETALAPPLICATIONOFTHEASSAYOFAFLATOXINSBYLIQUIDCHROMMATOGRAGHYWITHFLUORESCENCEDETECTIONINFOODANALYSISMJOURNALOFCHROMATOGRAPHYA,200088211016中国国家标准SGB/T50092222003食品中黄曲霉毒素的测定北京中国标准出版社出版,2004,17918417张鹏,张艺兵,赵卫东花生中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的多功能净化柱2高效薄层色谱分析J分析测试学报,1999,186626418
30、涂文升高效液相色谱法同时检测食品中四种黄曲霉毒素J中华预防医学杂志,2002,36534334519陶义川酶联免疫测定法M北京人民出版社,198420CHUFSUSNOIAPPLANDENVIRONMICROBIOLMPUBLISHEDBYTHEAMERICANSOCIETYFORMICROBIOLOGY,197751125112821GB/T5009222003食品中黄曲霉毒素的测定S22AOACINTERNATIONALOFFICIALMETHODSOFANALYSISMODI2FIEDM16THEDITION,METHOD99034,AOAC,ARLINGTON,VA,199523杨长志
31、,康庆贺,田丰等免疫亲和柱法测定小麦中黄曲霉毒素J化学工程师,2002,936323324王晶,张鹏,张艺兵,等免疫亲和层析净化荧光光度法快速测定酱油及醋中黄曲霉毒素J2003,15541241425食品中黄曲霉毒素的测定中华人民共和国国家标准GB/T18979200326张淼,王家传,张培正我国食品安全存在的问题及解决的科技途径,中国果蔬J2004,6434427农军目前国家几种检测黄曲霉毒素B1标准方法的分析与探讨J分析与测试,2003,增刊535428蔡正森,钟文辉,张东升,等ELISA法和HPLC法检测粮油食品中黄曲霉毒素B1含量的比较研究J中国卫生检验杂志,2004,14330230
32、4本科毕业设计（20_届）花生中黄曲霉素的分析目录1引言142材料与方法1621试剂与材料16211原材料16212试剂16213主要仪器1722实验方法17221在常温下花生中黄曲霉素的变化17222湿度对花生中黄曲霉素的影响17223温度对花生中黄曲霉素的影响17224对花生货架期的预测1723黄曲霉素的检测方法17231样品处理17232分析检测程序173结果与分析1831标准曲线的绘制1832常温下花生中黄曲霉素的变化1933湿度对花生中黄曲霉素的影响2034温度对花生中黄曲霉素的影响2135花生货架期的预测224小结235展望23致谢错误未定义书签。参考文献24摘要黄曲霉毒素是一类有
33、毒致癌化合物,易造成粮油类食品及其制品的污染,而花生作为一种重要的优质食用油原料极易在存储期内受到黄曲霉毒素的污染，给人类健康造成严重威胁，带来食品安全隐患，故寻求一种快速精确的检测方法对其进行定性定量分析是极为重要的。目前国际认定的广泛应用的检测方法很多，相比于各种传统方法，本实验采取了基于免疫学原理的酶联免疫快速检测方法对不同储藏条件下花生中的黄曲霉素进行测定分析，用该方法可以准确、快速的检测出花生中黄曲霉素B1的含量，进而绘制固定储藏条件下花生中黄曲霉毒素含量的变化曲线，寻求该条件下毒素含量的变化规律，以用于花生储藏时间的控制，保证食用的安全性，经实验结果分析，初步预测在常温条件下花生可
34、以贮存612个月，且可以安全食用。关键词黄曲霉素B1；酶联免疫分析法；花生。ABSTRACTAFLATOXINISAKINDOFTOXICCARCINOGENICCOMPOUNDSWHICHEASILYCAUSECONTAMINATIONINGRAINFOODS,WHILEASANIMPORTANTQUALITYEDIBLEOILRAWMATERIALS,PEANUTSEXTREMELYEASILYRECEIVEAFLATOXINCONTAMINATIONINITSSTORAGEPERIOD,BEINGASERIOUSTHREATTOHUMANHEALTHANDBRINGINGHIDDENTR
35、OUBLEINFOODSAFETY,SOSEEKINGARAPIDANDACCURATEDETECTIONMETHODSOFQUALITATIVEANDQUANTITATIVEANALYSISISEXTREMELYIMPORTANTINCURRENT,MANYINTERNATIONALRECOGNITIONTESTINGMETHODSAREWIDELYUSEDANDCOMPAREDWITHTHETRADITIONALMETHODS,WEADOPTENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAYFASTDETECTIONMETHODFORAFLATOXININPEANUTSUNDER
36、DIFFERENTSTORAGECONDITIONS,WHICHISBASEDONIMMUNOLOGYPRINCIPLES,CANACCURATELYANDRAPIDLYDETECTTHECONTENTOFAFLATOXINB1INPEANUTSTHENDRAWTHECURVESOFCHANGINGCONTENTOFAFLATOXININPEANUTSUNDEREACHFIXEDSTORAGECONDITIONANDSEEKTHECHANGERULESOFTOXINSCONTENTTOCONTROLTHESTORAGETIMEOFPEANUTSANDENSURETHEEDIBLESAFETYB
37、YANALYSISINGTHEEXPERIMENTALRESULTS,PRELIMINARYFORECASTTHATPEANUTSCANSTOREFOR612MONTHSANDISSAFETOEATUNDERNORMALTEMPERATURECONDITIONKEYWORDSAFLATOXINB1ENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAYPEANUTS11引言黄曲霉毒素（AFLATOXINS,AF）是曲霉属中的黄曲霉和寄生曲霉所产生的一类有毒的次级代谢产物。于1960年研究火鸡X病时首次被发现，在此以后不断地研究表明，这类毒素具有极高的致癌性，对动物有着巨大的危害1。在自然界
38、中，黄曲霉的生长要求不高，在有氧条件下，花生和玉米是其最好的繁殖场所，黄曲霉毒素是二氢呋喃香豆的衍生物，到目前为止，已发现黄曲霉毒素至少有黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q1等17种结构相似的化合物，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2是粮油制品中黄曲霉毒素的主要存在形式，其中以黄曲霉毒素B1的毒性和致癌性为最强2，黄曲霉毒素在1993年被世界卫生组织（WHO）癌症研究机构（INTERNATIONALAGENCYOFRESEARCHONCANCER,IARC）认定为I类致癌物质3。图1黄曲霉毒素化学结构FIG1CHEMICALSTRUCTUREOFAFLATOXIN黄曲霉毒素耐
39、热，其产生的最适温度为1214，相对湿度为8687。黄曲霉菌产毒量在2434之间最高，黄曲霉在48小时内快速生长，当霉菌处于低温、干燥或与其他霉菌竞争时，就会产生黄曲霉毒素4。黄曲霉毒素难溶于水、己烷、乙醚和石油醚，易溶于甲醇、氯仿、乙腈和二甲基甲酰胺等有机溶剂，其分子量为312346，熔点为200300。黄曲霉毒素对光、热和酸稳定，通常热处理对其破坏程度很小，只有在熔点温度下毒素才发生分解。黄曲霉毒素遇碱能够迅速分解，PH为910时可迅速分解成几乎无毒的盐，且此反应可逆，即在酸性条件下又可以复原，纯毒素在高浓度下稳定，而低浓度的纯毒素在紫外辐射下易分解，在自然情况下食品中污染的黄曲霉毒素有很
40、强的稳定性，B1毒素在268269时才可以分解。黄曲霉毒素在紫外线照射下，毒素能发出很强的荧光，其中B1、B2在紫外线下发出紫蓝色荧光，而G1、G2发出黄绿色荧光。黄曲霉毒素在自然界中分布广泛，普遍存在于各种食品和粮食中，特别是花生、大豆、玉米等农产品中，而由于在人体中黄曲霉毒素不易被分解，所以即使是误食了低浓度的黄曲霉毒素，在毒素累积到一定数量后也会引发癌症。黄曲霉毒素对作物的污染始于田间，由于不良储藏条件和过高含水量，作物在收获后会出现霉菌爆发和毒素污染。黄曲霉毒素的污染及其程度受季节和地理因素以及农作物生长、收割、储存等条件影响，潮湿地区更适合于毒素产生。产毒霉菌可以在各种各样的食物中生
41、长，特别是植物性食物，如玉米、花生、棉籽等。一般来说，谷物水分在14以上（花生水分在9以上）最适合黄曲霉的繁殖和生长5。黄曲霉毒素毒性非常强，其毒性相当于10倍的氰化钾，68倍的砒霜，100倍的敌敌畏，对人和动物的肝、肾脏有很大危害，还对动物胚胎有影响，会降低产奶和产蛋量，造成免疫抑制和反复感染，此外乳牛的奶中还会产生黄曲霉毒素B1的代谢产物M1，对不同动物黄曲霉毒素B1、M1、G1可引起各种不同的癌症6。摄入被该毒素污染的食品可诱发人类的原发性肝癌、胃癌及肺癌等，致癌时间最短的仅为24周；接触黄曲霉毒素后，乙肝病毒携带者引发肝癌的几率是一般人的60倍。食用黄曲霉毒素污染的食品后，可能会出现发
42、热、腹痛、呕吐等症状，严重的在23周内会出现肝脾肿大，肝区疼痛肝功能异常等肝病症状，也可能出现心脏扩大，肺水肿，甚至痉挛，昏迷等严重症状。由于黄曲霉毒素特别是B1毒素是潜在的致癌物质，长期接触低剂量的黄曲霉毒素对人也会有一定影响。据世界粮农组织（FAO）估计，有25的食用作物受到真菌毒素的污染，其中主要的就是黄曲霉毒素。由于在农作物生长、收获、晾干、加工和储藏的任何环节黄曲霉毒素都可以存在，因此极易污染花生、玉米等农产品，并由此直接进入食物链，最终造成淀粉类食品、动物性食品的连锁污染。目前在农产品原料的加工产品中也发现了黄曲霉毒素，由于毒素的存在降低了作物的产量和质量。由于各国分别制订了相应的
43、黄曲霉毒素的标准和法规，从而对贸易会造成一定的影响，例如欧盟多次以黄曲霉毒素超标为由拒绝进口花生及其制品的输入6。在我国建立的标准中，规定了乳及乳制品中黄曲霉素的最高允许量为5G/KG。FDA规定用于人类消费食物中的黄曲霉毒素B1水平为20G/KG，大多数动物饲料中黄曲霉毒素B1水平在20300G/KG之间。联合国有关组织（如WHO、FAO及UNEP等）也多次组织调查并提出了毒素的控制标准7。世界卫生组织在1995年规定食品中黄曲霉毒素B1最高允许浓度为15G/KG，在婴儿食品中不得检出；欧盟国家的规定更加严格，要求人类生活消费品中黄曲霉毒素B1的含量不得超过2G/KG，总量不得超过4G/KG
44、。对黄曲霉毒素的检测方法有很多，其中常用的方法主要有TLC、HPLC、ELISA等。TLC法是过去检测黄曲霉素最常用的方法，至今中外检测机构仍然在用，是我国的一种国标方法。其原理是针对不同样品，选取合适的提取溶剂从样品中将黄曲霉素提取出来，经柱层析净化后，并在薄板上展开以分离，利用其在波长365NM紫外光下产生蓝紫色荧光荧光特性,根据薄层上显示出的荧光斑点的强弱来测定毒素含量8。该方法虽然有设备简单、费用低廉、易于普及的优点，但是操作繁琐、杂质较多且灵敏度较差。HPLC法是在近年来发展起来的一种检测方法，其原理是利用高效液相色谱仪（用ODSC18柱）和柱后衍生系统分离，再用荧光检测器测定。与之
45、配套的柱后衍生系统有我国国标规定的碘衍生化法，也有国外的溴衍生化法，此外还有较为先进的电化学衍生化法和光化学衍生化法。该方法的优点是快速且能够准确的进行定性定量分析，检测限也很低，但其所需设备较为繁琐且检测花费较大。ELISA法是以免疫、酶及生化计数为基础的近年来研究开发出来的一种较为新颖的检测方法，也是我国所用的一种国标方法。ELISA是上世纪70年代出现的一种新的免疫检测技术，其原理是利用抗体抗原之间的特异性免疫学反应，并通过测定酶活力的方法使灵敏度升高。在反应中，样品中所含的黄曲霉毒素B1与抗体特异性反应,多余的抗体与酶标板内的包被抗原结合,再加入酶标记物和底物进行显色反应,与标准比较来
46、测定毒素含量。该方法的特点是灵敏度高,特异性强,检测结果稳定准确,一次性可检测多个样品。另外IAC/SFB法同样也是我国国标方法的一种。其原理是利用黄曲霉素中各种毒素不同的荧光特性，再用光度计测定样品中每种黄曲霉毒素的含量。大致过程是用甲/水提取样品中的毒素并对提取液进行过滤、稀释，滤液在经过含有黄曲霉素特殊抗体的免疫亲和柱的净化过程后，黄曲霉毒素与免疫亲和小柱上的抗体特异性键合，再用蒸馏水除去柱上的杂质，再用甲醇洗脱目标化合物，在专用的荧光光度计中加显色剂测定样品中的黄曲霉素含量9。黄曲霉毒素作为一种剧毒素，存在于世界上大多数食品制品中，造成了极大的安全隐患，花生作为一种重要的植物油原料，极
47、易受黄曲霉毒素的污染，从而易引发食品安全问题，而目前使用的检测方法因操作复杂、对仪器设备要求高、检测时间长、假阳性率高等，随着时代的发展,已经不能适应当代社会的检测要求。为了降低和消除黄曲霉素造成的污染，减少经济损失以及保证食品的食用安全性，需要有快速、经济和灵敏的检测方法。近些年来所开发出的免疫学分析方法具有很多突出的优点，例如灵敏度高、分析费用低、重现性好、能在短时间内处理大量样品等10、11。相比于其他已有方法，酶联免疫法以其特有的优势成为最实用的检测方法。由于抗原抗体之间的特异性反应，检测过程中定性、定量分析同时完成，所以不必对呈现阳性结果的样品再做确证试验，简化了处理步骤。由此可以看
48、出酶联免疫法是一个准确性高，安全性、实用性强的检测方法，故在本实验中采取酶联免疫快速测定法对不同储藏条件下的花生样品中的黄曲霉毒素含量进行定性定量分析，从而预测各储藏条件下花生的储藏期限，避免因食用含大量黄曲霉毒素花生引起的食品安全问题。22材料与方法21试剂与材料211原材料花生购买自农贸市场，初步经初步检测为无虫蛀无霉变新鲜花生籽粒甲醇分析级石油醚分析级212试剂黄曲霉毒素B1（AFB1）酶联免疫定量测试盒江苏省苏微微生物研究有限公司包括包被抗体的反应板96孔；A试剂样品稀释液；B试剂AFB1标准溶液（0,01,025,05,1,2NG/ML）；C试剂酶标抗原；D试剂酶标抗原稀释液；E试剂
49、浓缩洗涤液；F试剂显色底物液A；G试剂显色底物液B；H试剂终止液；反应板框架1块。试剂配制（1）A试剂（样品稀释液）先配置PBS缓冲液（PH74）30GNA2HPO412H2O，025GNAH2PO42H2O，87GNACL定容至1000ML。可根据实验需要按比例配制。A试剂取1000ML甲醇，加入900MLPBS缓冲液（PH74），混匀即得样品稀释液。可根据实验需要按比例配制。（2）每瓶C试剂（酶标抗原）中准确加入15MLD试剂（酶标抗原稀释液），充分溶解，配成实验用酶标抗原溶液，28保存。（3）取适量E试剂（浓缩洗涤液）用蒸馏水稀释20倍待用。213主要仪器酶标仪内置45NM滤光片MK3型，热电（上海）仪器有限公司；恒温培养箱（050）DNP9162型，宁波江南仪器厂面包发酵箱FX11型，广州市鑫南方电热设备有限公司；1000L、200L移液枪及配套枪头；电子天平JY2002型，上海方瑞仪器有限公司。22实验方法221在常温下花生中黄曲霉素的变化称取100G花生样品，平铺至三个培养皿中，该过程中要保证样品没有重叠，充分分散平铺，放置在常温下，不定期的测定花生样品中黄曲霉素的含量。222湿度对花生中黄曲霉素的影响在恒温30、湿度分别为60、70、80的三个不同储藏条件下，考察花
