1、本科毕业设计（20_届）产纤维素酶的海洋细菌的筛选及初步鉴定所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录中英文摘要1引言111纤维素酶研究简介112纤维素酶的应用2121在饲料工业上的应用2122在造纸业中的应用213细菌纤维素酶的优势314海洋细菌纤维素酶的特性315课题意义32材料与方法521实验材料5211培养基5212试剂5213引物5214菌种522实验方法5221初筛5222复筛6223鉴定63结果与分析831初筛结果832复筛结果1033菌株E9和W8的分子鉴定结果114小结12致谢13参考文献14摘要为筛选出纤维素酶高产菌，从宁波大学实验室取得150株海洋细
2、菌菌株，复苏后在CMCNA选择培养基上培养，经刚果红染色法，菌落周围产生透明圈的有38株，透明圈与菌落直径比HC大于3的有9株，其中编号为E9和W8的菌株HC值最大都为425。用DNS法对这9株菌进行复筛，筛选出CMC酶活和滤纸酶活都较高的菌株，仍为E9和W8，其中菌株E9的CMC酶活和FPA分别为115U和567U，菌株W8的CMC酶活和FPA分别为111U和541U。经16SRDNA法鉴定，菌株E9和W8分别与THALASSOBACTERSTENOTROPHICUS和MARIBACTERDOKDONENSIS的16SRDNA系列具有较高的相似性，相似度分别为95和99。关键词海洋细菌；纤维
3、素酶；筛选；16SRDNAABSTRACTINORDERTOOBTAINTHECELLULASEPRODUCINGBACTERIA,150MARINEBACTERIAFROMOURLABORATORYWERESCREENEDBASEDONTHECMCNAMEDIUMPLANTTHERESULTSSHOWED38OF150STRAINSCOULDPRODUCECELLULASEAMONGTHEM,9STRAINSHAVEHIGHERACTIVITYHC3THEHCOFE9ANDW8WASTHEHIGHESTHC425THEANALYSISOFE9BASEDONCMCASEACTIVITYANDF
4、PAWAS115UAND567U,RESPECTIVELYTHEW8WAS111UAND541U,RESPECTIVELYMOLECULARPHYLOGENETICANALYSISOFMARINEBACTERIABASEON16SRDNASEQUENCESINDICATEDTHATTHEYEXHIBITEDTHEHIGHTESTSIMILARITY95AND99,RESPECTIVELYTOTHE16SRDNAFRAGMENTSOFTHALASSOBACTERSTENOTROPHICUSANDMARIBACTERDOKDONENSIS。KEYWORDSMARINEBACTERIACELLULA
5、SESCREENING16SRDNA1引言11纤维素酶研究简介纤维素物质是世界上最丰富的却又未得到充分利用的可再生性物质资源宝库，它将是人类未来的能量、食物和化工原料的主要来源。合理开发和科学利用这一丰厚天然资源是世界各国研究开发的重点领域。利用微生物生产的纤维素酶将其转化为人类急需的能源食物和化工原料，对于人类社会的可持续发展具有非常重要的意义。筛选出产高活性纤维素酶的菌株是开发利用纤维素资源的前提和关键。纤维素是绿色植物细胞壁的主要成份，是自然界中含量最丰富的有机碳水化合物，生物界最重要的碳源。纤维素属于多糖，由毗喃葡萄糖分子通过（14）糖昔键缩合生成的线性大分子多聚物。纤维二糖是其基本单
6、元。纤维素分子的大小由聚合度DP定义，即一个分子所含葡萄糖残基数。植物纤维素DP14000，微生物纤维素DP3500，商品纤维素DP50一50001。目前纤维素被彻底分解而又无污染的一条有效途径是利用纤维素酶的水解作用。利用纤维素酶将纤维素水解成葡萄糖称为纤维素的生物转化工艺，生物转化的关键就是纤维素酶的生产。纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称,是一个有多种水解酶组成的复合酶系。根据其作用方式一般可将纤维素酶分为内切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CHB）和葡萄糖苷酶（BG）2。在这3种酶的协同作用下,纤维素最终被分解成葡萄糖。纤维素酶来源非常广泛，如昆虫、软体动物、原生动物、细
7、菌、放线菌、真菌等都能产生纤维素酶。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，研究较多的有木霉属、曲霉属、根霉属和漆斑霉属3，其中丝状真菌木霉属被公认是产纤维素酶最高的菌种之一4。有许多种木霉不但分泌的纤维素酶产量高，而且纤维素酶系的三种组分（葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、葡萄糖昔酶）比例较协调，因而纤维素酶酶活较高。更为有利的是木霉分泌的纤维素酶是胞外酶，所以分离纯化比较容易5，而且木霉具有培养粗放，适应性强的特点，适于固体培养和液态深层发酵，从而可以大规模应用于生产，目前在工业、农业、环境科学等方面有着广泛的用途，成为当前生产上应用较多的菌种，也是目前国内外研究最广泛的纤维素酶产生菌，在学术
8、研究中引起广泛关注。其中里氏木霉TRICHODERMAREESEI因其纤维素酶产量较高，易于培养和控制、产纤维素酶稳定性好、培养及代谢产物安全无毒等优良特点，成为生产纤维素酶典型菌种6。纤维素酶三种组分协同水解纤维素的过程是首先纤维素酶分子吸附到纤维素表面，由葡聚糖内切酶EG随机水解纤维素非结晶区的1，4糖普键，将长键纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；葡聚糖外切酶CBH可从纤维素线性分子的非还原性末端水解，每次切下一个纤维二糖分子；葡萄糖苷酶（BG）则将纤维二糖水解成葡萄糖分子。由于纤维素底物的高度复杂性以及底物的多样性，纤维素酶作用机制目前还没有完全研究清楚。12纤维素酶
9、的应用自从1906年SEILLIERE从蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，人们对纤维素酶做了大量的研究，特别是20世纪80年代以来,由于分子生物学的发展及生物工程技术的兴起，纤维素酶的研究出现了新的前景。现在纤维素酶的应用已扩展到医药、纺织、日用化工、造纸、食品发酵、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理及饲料等各个领域，其应用前景十分广阔7。专家预测，针对扮演绿色化学品的纤维素酶的研究开发利用是新世纪的可再生性资源的关键。对于解决工农业原料来源、能源危机、环境污染等问题具有十分重要的意义。121在饲料工业上的应用由真菌木霉和黑曲霉所产生的纤维素酶同时含有能将天然纤维素降解成易消化糖的多种酶组分，且降
10、解纤维素的能力很强。利用纤维素酶这种特性，可使粗饲料制作成低纤维饲料。这已在兔等家禽饲养中得到了试验应用，但推广面还很小。酶制剂作为家畜饲料添加剂在国外已引起越来越多的关注。用于制作酶剂的酶有多种，由于家禽家畜一般难消化利用纤维素和半纤维素，因此，纤维素酶在饲料酶制剂中应用最为普遍。使用饲料纤维素酶制剂，可以促进动物的消化吸收，大大提高动物对饲料的利用率。饲料酶母是重要的饲料蛋白资源,饲料酵母通过植物纤维原料水解后生产饲料酵母前景广阔。传统的植物纤维原料水解方法为酸法水解鉴于酸水解需高温、高压,对设备要求高，投资大，水解副产物多，糖得率低，水解液中有害物质多，不便于酵母繁殖等缺点，纤维素酶法水
11、解替代酸水解用于植物原料生产饲料酵母是必然趋势。122在造纸业中的应用8用纤维素酶和半纤维素酶结合处理，可促进脱墨过程，并且能在低PH值的纸浆进行脱墨。四川轻化工学院的李文俊等9，对纤维素酶在废报纸脱墨中的应用进行了实验性探索。实验结果表明A酶法脱墨能获得比化学法脱墨更好的脱墨效果，还能改善浆料的强度及其滤水性。同时，还确定国产废报纸纤维素酶法脱墨最佳工艺条件为PH60，酶用量01，时间40MIN，温度40，浆浓度55。一些难处理的废料如含纤维较低的脱墨淤泥（其中含4050的无机墨水）和细小纤维等，用酶法处理可节约开支，减少污染。纤维素酶首先将废料降解成糖，再将其转换成乙醇等化学原料或燃料，达
12、夫谢列卢以每克底物1040单位酶活性的比例使50的脱墨淤泥转化成糖，而墨汁存在不影响酶活性；孙伟强等将造纸中的细小纤维进行细菌发酵可产酒精；陈惠忠等将酶解和发酵同时进行，可转化造纸厂的废纤维为酒精。MANSFIELD等10,用复合纤维素酶NOVOZYMESP342选择性地单独处理纸浆的粗长纤维级分，可提高成浆得率，降低酶的使用量，并改善纸张的平滑度，从而改善纸张的印刷适性。尽管存在纸浆黏度和撕裂度降低的缺点，但纸浆的抗张强度增加10，使粗糙的花旗松纤维原料可以生产出高级纸品。13细菌纤维素酶的优势细菌主要产中性纤维素酶和碱性纤维素酶，这类酶制剂对天然纤维素的水解作用较弱，长期以来没有得到足够的
13、重视。但细菌所含纤维素酶基因一般不含内含子，可直接从基因组DNA中克隆到目的基因用于工程菌的构建。因此细菌纤维素酶基因的克隆，既利于研究纤维素酶基因的多样性，也利于高效纤维素酶基因工程菌的构建。随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，以及耐热性纤维素酶在燃料酒精生产中应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的应用性能和巨大的经济价值11。14海洋细菌纤维素酶的特性新近研究表明海洋微生物酶一般在高盐条件下仍具有高的活性，这使它们可以被应用到工业中某些需要苛刻条件的生产工艺中12；同时海洋微生物酶还具有耐高温、可以在室温下长时间保持高活性、耐极端PH等特性。这些特性将
14、可以在很大程度上解决因工业化生产中的高盐、高温、强碱或强酸等使酶失活的问题。因此，海洋细菌纤维素酶比陆地细菌更有优势，研究这方面内容也显得很有意义。15课题意义工业革命提高了世界对能源主要是矿物燃料的需求。随着工业化的进展，石油的需求量很大因此，出现了严重的环境问题16。随着石化燃料由短缺变枯竭，能源成为人类面临的共同问题。寻找新的能量来源关系到经济的可持续发展及至人类的生存问题17。纤维素与石化燃料不同，它是自然界中最丰富的而且能够循环再生的多糖类有机质6。地球上每年光合作用可产生大于100亿吨植物干物质，一半以上是纤维素和半纤维素。另外，人类活动产生的废弃物中也含有大量纤维素，如农业废物稻
15、草，稻壳，花生壳，麦杆，玉米芯，甘蔗渣等、食品加工废物果皮、果渣等、木材废物木屑、树皮以及城市废弃物4060固体废物是垃圾和废纸。我国每年光作物秸杆一项就有5亿吨之多，高于全国粮食总产量13，这些纤维素物质除部分作为造纸和植物性纤维利用外，大部分被燃烧或废弃，不仅造成资源浪费，还会污染环境。以植物性纤维为原料，利用微生物生产纤维素酶，并将纤维转化为人类急需的能源、食物和化工原料，如葡萄糖、酒精、饲料等产品，不仅可作为新能源、新资源为人类造福，而且对人类社会解决全球能源危机、食品和饲料资源紧张以及环境污染有着重大意义，对于人类社会的可持续发展具有非常重要的意义14，因而成为世界各国竞相开展的研究
16、课题15。2材料与方法21实验材料211培养基2216E培养基配方蛋白胨5G酵母膏1GFEPO44H2O00148G琼脂18GPH7678212试剂羧甲基纤维素钠（CMCNA）01刚果红溶液1MOL/LNACL洗脱液PH值为48，0LMOL/L的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液3,5二硝基水杨酸（DNS）试剂称取酒石酸钾钠1820G，溶于500ML蒸馏水中，加热（切记不超过50），于热溶液中依次加入3，5二硝基水杨酸（DNS）63G，NAOH210G，重蒸酚50G，无水亚硫酸钠50G，搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至1000ML，贮存于棕色瓶中避光4冰箱保存，放置一周后使用，使用前用烧结玻璃过滤器过滤
17、（有效期为6个月）。1MG/ML标准葡萄糖溶液精确称取105烘至恒重的无水葡萄糖分析纯1000G，以蒸馏水溶解后，定容至1000ML容量瓶中制备成LMG/ML的标准葡萄糖溶液。再稀释成L00G/ML，200G/ML，300G/ML，400G/ML，500G/ML的不同浓度的葡萄糖溶液，用蒸馏水做对照，绘制出反应葡萄糖溶液浓度与其对应的吸光度值之间关系的葡萄糖标准曲线，及曲线方程式。213引物27F（5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3）1429R（5GGTTACCTTGTTACGACTT3）214菌种来源于宁波大学实验室22实验方法221初筛从超低温冰箱（70）中取出菌株接种到斜面22
18、16E培养基中，28下培养2D。待斜面培养基上长出大量菌后，用接种环将菌接种到CMCNA选择培养基上，一个平板接4株菌（点种时要尽量点圆），28下培养2D。待平板上出现菌落后，测量菌落直径D，记录数据。小心刮去菌落，用01的刚果红溶液染色30MIN。染色结束后，用1MOL/LNACL溶液脱色2次，每次20MIN，观察有无透明圈并测量透明圈直径D。计算HCD/D。HC值越大，表明酶活越强。222复筛粗酶液的制备挑取斜面培养基上培养的菌种，接种于25ML羧甲基纤维素钠发酵培养基中，28下培养2D。所得发酵液经4、5000R/MIN离心30MIN，收集上清液作为粗酶液,用于酶活力的测定。CMC酶活测
19、定取05ML适当稀释的粗酶液，加入1CMCNA底物溶液CMCNA溶于PH值为48，0LMOL/L的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液2ML，50保温酶解反应30MIN，先预热5分钟。然后加入DNS显色液3ML，放入已沸腾的水中沸水浴5MIN，流水冷却后在540NM下测吸光度。同时用100煮沸5MIN后失活的酶做对照，扣除本底。根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出CMC酶活值。在此CMC酶活力单位定义为以1CMCNA溶液为底物，在一定反应条件PH48，50，恒温30MIN下，以水解反应中，LML纤维素酶液LMIN催化纤维素生成LG（1MOL）葡萄糖为1个CMC酶活单位，
20、以U表示。滤纸酶活（FPA）测定取05ML适当稀释粗酶液，加入PH值为48，0LMOL/L的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液LML，再加入5005MG滤纸1CM6CM一条，于50保温酶解反应1小时先预热5分钟。然后加入DNS显色液3ML，放入已沸腾的水中沸水浴5MIN，流水冷却后在540NM下测吸光度。同时用100煮沸5MIN后失活的酶液做对照，扣除本底。根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。在此滤纸酶活单位定义为以滤纸为底物，在一定反应条件PH48，50，恒温LH下，以水解反应中，LML纤维素酶液LMIN催化纤维素生成LG（1MOL）葡萄糖为1个滤纸酶活单位
21、，以U表示。223鉴定细菌基因组DNA的制备去培养到指数生长期细菌菌液5ML，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。引物设计海洋细菌16SRDNA基因扩增选用通用引物27F（5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3）和1429R（5GGTTACCTTGTTACGACTT3）进行扩增。PCR反应体系与条件PCR采用50L体系，反应条件为943MIN；9440S，591MIN，7240S，30个循环；7210MIN。PCR产物进行1琼脂糖凝胶电泳。PCR克隆PCR产物进行1琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的条带，回收DNA，将纯化后的PCR产物先与PMD18TVECTOR连接，然后转
22、化到DH5细胞，后提取重组质粒进行目的片段的测序DNA序列测定和系统发生学分析测序由上海生工生物技术有限公司完成。获得的16SRDNA序列提交GENBANK用BLAST软件与已知序列进行对比，确定与其序列相似度最高的菌种。3结果与分析31初筛结果经刚果红染色后，菌落周围有透明圈产生的有38株菌，数据见表1。表1初筛有透明圈产生的菌株及其HC值菌株编号菌落直径（D）透明圈直径DHC值（D/D）E3411275E8141435INE3331E64615E549225INE5362E1814175E2101414E48273375E7914156W78253125E10102525E9834425E
23、111222183E12932356E138232875E16933367W11118164W282835W221117155W8834425W3814175W4925278W5822275W6102323YHRDO15E1115136YHRDO15E914156YHHSSOO5E712171YHRDO12E818225YHHSOO53E8151875YHHDO151E82025YHRDO14E81215ATCI0204710143YHHDO14E712171SSEM28101818YHHDO16E913144YHHDO161E723329YHHDO16E101818图1个别菌株初筛透明圈图其
24、中HC值大于3的共有E81，E4，W7，E9，E12，E16，W2，W8，YHHDO161E这9株菌，其中编号为E9和W8的菌株HC最大，都为425。产纤维素酶菌株因为产生的纤维素酶分解CMCNA，使得染色液被洗脱，所以菌落周围形成了透明圈。HC值是透明圈直径与菌落直径的比值，能定性表示酶的活性大小，HC值越大，表明酶活越强。32复筛结果对上述9株菌进行复筛，用DNS法测得各自的CMC酶活和FPA，见表2。表2复筛菌株CMC酶活和FPA菌株编号CMC酶活U/MLFPA（U/ML）E81103533E492492W763436E9115567E1256363E1655387W246267W811
25、1541YHHDO161E62441从表2可看出，9株菌的纤维素酶活与选择性刚果红染色所得到的结果基本上相符合，HC值较大的，CMC酶活也相对较大，其中编号E9的菌株CMC酶活最大为115U，编号W8的菌株CMC酶活为111U。编号E9的FPA也是最大为567U，FPA最小的是菌株W2，为267U。不同菌株对滤纸的分解能力和进程相差较大。E9和W8分解滤纸的能力最强；W2则最弱。在分解滤纸的进程中，E9和W8中的滤纸片在反应一个小时后四角开始变薄，而其它菌株的滤纸没有任何变化。反应三个小时后，除株W2的滤纸仍没被分解、滤纸没有变化外，其他菌株中的滤纸均开始变形；而E9和W8中的滤纸片则更是已经
26、崩溃，呈网状的碎片，但它们的分解进程不大一样E9分解滤纸是个渐进的过程，而W8分解滤纸的高峰出现在第二个小时与第三个小时之间。33菌株E9和W8的16SRDNA分子鉴定结果以海洋细菌的16SRDNA通用引物27F和1492R对菌株E9和W8基因组DNA进行扩增，测得各自的序列（图2,3），将其与GENBANK数据库中的已知序列进行了相似性分析，结果显示菌株E9和W8在GENBANK中分别与THALASSOBACTERSTENOTROPHICUS和MARIBACTERDOKDONENSIS的16SRDNA系列具有较高的相似性，相似度分别为95和99（表3）。E9AGAGTTTGATCCTGGCT
27、CAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGCTCTCTTCGGAGGGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTACCCTTTTCTAAGGAATAGCCACTGGAAACGGTGAGTAATACCTTATACGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGAGAAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA
28、GTGGGGAATCTTAGACAATGGGCGCAAGCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTCGTAAAGCTCTTTCGCCAGGGATGATAATGACAGTACCTGGTAAAGAAACCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGTTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGACTATTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCCTTGATACTGGTAGTCTTGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCG
29、AGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCAAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGTTGCATGCAATTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTT
30、ACCAACCCTTGACATCCCTGTCGCGGTTACCGGAGACGGTTTCCTTCAGTTCGGCTGGACAGGTGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGGTTAAGTCCGGCAACGAGCGCAACCCACATCTTTAGTTGCCAGCAGTTCGGCTGGGCACTCTAGAGAAACTGCCCGTGATAAGCGGGAGGAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAATGACAATGGGTTAATCCCAAAAAGTTATCTCAG
31、TTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTAACAGCATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTTTACCCGAAGGCCGTGCGCCAACCTTTCGAGGGGGCAGCGGACCACGGTGAGCTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC图2菌株E9的16SRDNA序列W8AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAGCGCTAGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGGGGCAGCGGGG
32、AAAAGCTTGCTTTTCCGCCGGCGACCGGCGCACGGGTGCGCACCGCGTATGGAACCTGCCTTGTACAGGGGAATAGCCCAGGGAAACTTGGATTAATGCCCCGTAGTACCGTATTTCGGCATCGTTATACGGTTAAAGCCTTCGGGCGGTACAAGATGGCCATGCGTCCCATTAGCTAGATGGTAAGGTAACGGCTTACCATGGCTACGATGGGTAGGGGCCCTGAGAGGGGGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGAC
33、AATGGAGGAGACTCTGATCCAGCCATGCCGCGTGCAGGAAGAATGCCCTATGGGTAGTAAACTGCTTTTATACGGGAAGAAAAAGAGCTACGTGTAGCTTACTGACGGTACCGTAAGAATAAGGACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTCCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGGCCGATAAGTCAGGGGTGAAAGTCTGCCGCTCAACGGTAGAACTGCCTTTGATACTGTCGGTCTTGAGTTATAGTGAAGTTGCCGGAAT
34、ATGTAGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATTACATAGAACACCGATTGCGAAGGCAGGTGACTAACTATATACTGACGCTGATGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGCTGTCCGGAACCTTGAGTTCTGGGCGGCCAAGCGAAAGTGATAAGTATCCCACCTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGA
35、ACCTTACCAGGGCTTAAATGCATATTGACAGGGTCAGAGATGACTTTTCCTTCGGGCAATTTGCAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCAGGTTAAGTCCTATAACGAGCGCAACCCCTACCGTTAGTTGCCAGCATGTCATGATGGGGACTCTAACGGGACTGCCGGTGCAAACCGTGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGTCCTGGGCCACACACGTGCTACAATGGCAGGTACAGAGAGCAGCCACGTCGCAAGGCGGAGCGA
36、ATCTATAAAACCTGTCACAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGGATATCAGCCATGATCCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGCCGGGAGTGCCTGAAGTCCGTCACCGTAAGGAGCGGCCTAGGGCAAGATCGGTAACTAGGGCTAAGTCGTAACAAGGTAACC图3菌株W8的16SRDNA序列表3菌株E9和W8的16SRDNA序列与GENBANK中已知序列的对比STRAINS16SRDNAPARTIALSIZE/B
37、PTHEMOSTRELATEDSPECIESACCESSIONNUMBERSEQUENCESIMILARTY/E91429THALASSOBACTERSTENOTROPHICUSNR07720595W81492MARIBACTERDOKDONENSISAY960750994小结初筛从150株海洋细菌菌株中筛选出了38株产酶菌，用定性的方法，即用HC值来衡量酶活大小，挑选出了9株活性较大的菌株。进一步对这9株菌所产纤维素的酶活进行定量的测定，测其CMC酶活和滤纸酶活，结果与初筛的结果基本相一致，HC值大的，CMC酶活和滤纸酶活也相对较大。最后采用16SRDNA鉴定法确定了菌株E9和W7分别与TH
38、ALASSOBACTERSTENOTROPHICUS和MARIBACTERDOKDONENSIS的16SRDNA系列具有较高的相似性，相似度分别为95和99。参考文献1谢占玲,吴润纤维素酶的研究进展J草业科学,2004,21472762窦烨,王清路,李俏俏纤维素酶的应用现状J中国酿造,2008,271215173刘小杰,何国庆,陈启和康宁木霉ZJ5纤维素发酵培养基的优化J浙江大学学报工学版,2003,3756236284王青莎,王颉,刘景彬康宁木霉固态发酵秸杆生产纤维素酶的研究J纤维素科学与技术,2005,13426305管斌,谢来苏,丁友昉,等里氏木霉纤维素酶高产菌株发酵特性的测试J中国酿造
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