1、本科毕业设计（20_届）纯氧和臭氧在养鱼系统中的正负效应所在学院专业班级海洋生物资源与环境学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言12材料与方法121实验场所122实验用鱼及饲养条件123实验主要仪器224实验设计2241臭氧实验设计2242纯氧实验设计225实验方法与步骤2251关于臭氧实验的实验方法与步骤2252关于纯氧实验的实验方法与步骤2253耗氧率的测定与计算23结果331臭氧处理后的耗氧率变化332臭氧处理后的血液化验结果433臭氧处理对鳃丝组织的影响434不同溶氧水平处理后鲫鱼的耗氧率变化635不同溶氧水平处理后的血液生理指标64讨论741臭氧对养殖水质的净化作用742臭氧
2、对鲫鱼耗氧率及鳃丝组织的影响743不同溶氧水平对鲫鱼耗氧率的影响744高溶氧及低氧对鲫鱼的血红球的影响85小结8致谢8参考文献8摘要本文采用臭氧发生器和高压纯氧对体长8CM12CM的鲫鱼，进行了每次充臭氧20MIN、45MIN、70MIN及溶解氧浓度2219MG/L、2852MG/L、1670MG/L的分组处理，以鱼的耗氧率、血液生理指标、鳃丝的显微组织结构作为判别指标。结果表明以20MIN和45MIN为单位的臭氧处理组耗氧率高出对照组约12，有利于鱼的生长。而以70MIN为单位的臭氧处理组耗氧率低于对照组约13，且鳃丝组织已受损坏。另外，在22MG/L的高溶氧水平条件下，耗氧率比低氧水平高出
3、9，有利于实验鱼的生长。关键词纯氧；臭氧；耗氧率；血红蛋白。ABSTRACTTHISPAPERADOPTSOZONEGENERATORANDPRESSUREOFPUREOXYGEN8CM12CMLENGTHOFTHECARP,45MIN20MIN,70MINEVERYTIMEFILLINGOZONEANDDISSOLVEDOXYGENCONCENTRATION,2219MG/L,2852MG/L,1670MG/LPACKETPROCESSING,WITHOXYGENCONSUMPTIONOFFISHRATE,BLOODPHYSIOLOGICALINDEXES,FILAMENTSMICROSTR
4、UCTURESTRUCTUREASTHEJUDGEINDEXTHERESULTSSHOWSTHATTHEUNITFOR20MINAND45MINOZONEOXYGENCONSUMPTIONRATEWASTREATEDWITH12PERCENT,TOCONTROLTHEGROWTHOFFISHANDTOTHEOZONEPROCESSINGUNITFOR70MINOXYGENCONSUMPTIONRATESLOWERTHANTHECONTROLGROUPOFABOUT13,ANDFILAMENTSORGANIZATIONHASDAMAGEDINADDITION,IN22MG/LHIGHDISSOL
5、VEDOXYGENLEVELCONDITIONS,LOWOXYGENCONSUMPTIONRATEHIGHERTHAN9,OXYGENLEVELSINTHEGROWTHOFFISHTOEXPERIMENTKEYWORDSOXYGENOZONEOXYGENRATEHEMOGLOBIN1引言目前，在我国的水产养殖中水污染日益严重，病害频发，加之超负荷高密度养殖，经常会导致养鱼水中溶氧过低，制约了养殖产量的增加1。鱼类的呼吸依赖于水中的溶解氧含量，如果水中的氧含量过低鱼类将无法正常生长。主要养殖鱼类正常生长所需要的溶解氧含量一般在45MG/L以上。常用的增氧措施是空气增氧，为进一步提高鱼产量一些地方
6、也尝试用高压液氧增氧。使用纯氧养鱼可达到一定的效果，主要表现在同一养殖条件下可提高产量，饲料利用率提高，鱼类能更好消化与吸收,鱼类生长速度提高,疾病和死亡率降低,药物使用量减少,药物残留降低,产品品质更高持续保持充足的溶氧,即使在水温高的条件下也不例外,大大缩短了养殖周期2。水中溶氧达正常值时鱼类摄食好、生长快、饲料利用率高。当溶氧低于正常值时，鱼类的摄食和生长都将受到一定的影响，摄食率和消化率下降。在低溶氧水中，鱼类的摄食率和消化率都将显著降低，而体能消耗增加，结果是饵料系数增加而生长速度缓慢3。特别是当溶氧低于2MG/L时，鱼类基本上停止摄食。当溶氧低于1MG/L时，鱼类就会浮头。而当溶氧
7、低于05MG/L时，鱼类即可窒息死亡。同时，在低氧或缺氧状态下，从有机物的分解到水中正常物质循环都受到抑制，有毒物质积累，水质恶化，影响鱼类生长环境4。如果溶氧偏高，一般对鱼类没有太大的危害，但深度过饱和溶氧有时会引起气泡病，并且会消耗太多的能源5。臭氧在18世纪就被发现，以其强氧化性，达到消毒杀菌，净化水质作用，并且可以自身分解产生氧气，不会产生残留，因而在水产养殖领域中日益受到人们的青睐6。目前臭氧主要应用于鱼虾育苗、养殖加工过程中的水体消毒及水质净化。它可杀灭繁殖型细菌、芽抱、病毒、真菌、原虫包囊等。主要依靠其强大的氧化作用而呈现杀菌作用7。它能破坏或分解病原菌的细胞壁,迅速扩散透人细胞
8、内,氧化破坏细胞内醉而使病原菌致死8。臭氧可以对水中的硫化物、氨、氰化物进行降解,有毒的硫化物、氨、氰化物通过与臭氧反应后,产生了无毒的H2SO4、CO2、N2等物质,从而达到净化水质的目的9。臭氧由于稳定性差,一般多在现场生产即刻使用。人工产生臭氧的方法很多,有电化学法、光化学法,但以高压电放电法的臭氧产气最大,最经济实用。产生的方法是根据自然界闪雷击产生臭氧的原理,在臭氧发生器中设工一的高压电极,让经过干澡处理的空气流过两高压电极间的通道,在高压电放电作用下,空气中的氧电离成臭氧。目前常用这种高压电放电法产生臭氧。产生的臭氧从臭氧发生器输人到封闭的消毒水池中,对水进行杀菌处理,处理后的水用
9、泵送入养殖池中使用10。臭氧对人体及水产养殖对象也有损害,为此必须通过嗓气或活性炭将臭氧或臭氧合成物去除后再注人养殖池作为养殖用水。如以杀菌为目的,则必须将有效臭氧浓度作用一定时间后再去除臭氧,用于育苗和养殖用水,特别是海水养殖,必须有去除残留氧化物的设备,将其减少到对鱼虾贝无毒性的量为止11。本实验以鲫鱼（CARASSIUSAURATUS）作为实验鱼，分别用不同浓度的纯氧和臭氧进行处理后，测定各处理组的耗氧率及血液生理指标的变化，并在显微镜下观察鳃丝组织的特征。通过分析获得纯氧与臭氧对鱼类呼吸代谢和血液相关指标的影响，以期在实际水产养殖中更合理地应用纯氧和臭氧。2材料与方法21实验场所宁波大
10、学曹光彪科技楼118实验室及宁波大学包玉书科学楼12号楼221实验室。22实验用鱼及饲养条件11购买自市场上的鲫鱼，鱼体规格8CM12CM。先在1M3的大水槽中暂养10D，选择体色正常、健康无伤、摄食正常、大小基本均匀的22尾用于实验。实验用水为去氯自来水，PH值7067，整个实验在常温下进行，水温为1218。实验水槽体积12L。23实验主要仪器天狮小型臭氧灭菌器（型号SRT400TS），臭氧发生量400MG/小时；高压氧气瓶；充气机一台；全自动血液分析仪（医院）。24实验设计241臭氧实验设计本实验分4个组，其中3个臭氧处理水平组，1个对照组，每组3尾鲫鱼。每天充臭氧6次，分别是800、10
11、00、1300、1500、1800、2000，实验共进行6D。臭氧充气A组每次充臭氧20MIN。臭氧充气B组每次充臭氧45MIN。臭氧充气C组每次充臭氧70MIN。空气充气D组每次充空气30MIN。实验结束后，测定鱼的耗氧率、血液生化，观察鳃丝组织的变化。242纯氧实验设计本实验分3个组，每组3尾鲫鱼，其中1个纯氧充气组，溶解氧保持在2219MG/L以上；1个空气充气组，溶解氧量保持在70002852MG/L左右；1个缺氧组，溶解氧1670MG/L左右。实验共持续6天。纯氧充气A组每24小时补充纯氧一次；空气充气B组每12小时补充空气一次；缺氧C组持续保持低氧水平。实验过程中，各组以12H后水
12、样的溶解氧为监测指标，控制水体溶氧水平。实验结束后，测定鱼的耗氧率、血液生化的变化。25实验方法与步骤251关于臭氧实验的实验方法与步骤实验开始前，将经暂养驯化的健康活泼的实验鲫鱼，放入各自的实验水槽内适应2D。实验开始后，每天6次在规定的时间进行臭氧处理。并且每天换水1次，保持水质良好。6D实验结束后，对各组的实验鱼进行耗氧率测定，然后从尾静脉用抗凝注射器抽取1ML以上血样送检，并且解剖实验鱼，取出鳃丝组织，制作成水封片，在显微镜下进行观察。252关于纯氧实验的实验方法与步骤实验开始前，同样将经暂养驯化的健康活泼的实验鲫鱼，放入各自的实验尼龙袋内敞口适应2D，每个尼龙袋盛水约4L左右。纯氧充
13、气组，每天早上800换水并向尼龙袋中充满纯氧，立即密封袋口；空气充气组每天早上800换水并向尼龙袋中满空气，密封袋口；缺氧组，每天早上800和2000换水后，尽量排除所有空气，密封袋口。以换水后12H测得的每组水样的溶解氧为实验溶氧水平。6D实验结束后，测定每组鱼的耗氧率，并用抗凝注射器抽取实验鱼的血样送检。253耗氧率的测定与计算本实验通过水中溶解氧的变化来测定耗氧率。水中溶解氧的测定，一般用碘量法（GB748987）。以下12是碘量法的原理与步骤（1）用5000ML的广口瓶作代谢瓶，设3个平行瓶。将试验结束后的鲫鱼放入同温呼吸瓶中，每瓶放置1尾，将一玻璃导管的一端伸入呼吸瓶中，导管的另一端
14、外套乳胶管，便于实验前后取样。呼吸瓶口用乳胶手套密闭，将实验水体与外界隔开，呼吸瓶外包裹黑布，静止适应10MIN后每一平行呼吸瓶用虹吸法取出空白对照样1瓶，同温下培养，取样后记录水体积，用夹子夹紧取样管，以使代谢瓶内外没有任何气体交换，即刻开始计时。1H后再次用虹吸法每一平行呼吸瓶取1瓶水样，与前一水样一起滴定。最后用电子天平称鱼体重（至001G）。根据实验始末溶氧浓度变化计算耗氧率。（2）硫代硫酸钠标定用吸量管吸取1500毫升碘酸钾标准溶液，沿壁注入碘量瓶中，用少量蒸馏水冲洗瓶壁，加入1ML碱性碘化钾，再加入10ML的13（V/V）硫酸，再混匀，盖好瓶塞，放置2MIN，沿壁洗入110ML蒸馏
15、水，立即开始搅拌并用硫代硫酸钠溶液进行滴定，待测液呈淡黄色时加入34滴淀粉指示剂，继续滴至溶液蓝色刚消失。硫代硫酸钠的浓度为CV1/V2101（MOL/L）其中，V1为碘酸钾标准溶液用量，V2为硫代硫酸钠溶液用量。（3）溶氧的固定在水样中加入氯化锰及碱性碘化钾溶液，生成氢氧化锰沉淀。此时氢氧化锰性质极不稳定，迅速与水中溶解氧化合生成锰酸锰2MNCL24NAOH2MNOH24NACL2MNOH2O22H2MNO3H2MNO3十MNOH2MNMNO32H2O（4）加入浓硫酸使棕色沉淀（MNMNO3）与溶液中所加入的碘化钾发生反应，而析出碘，溶解氧越多，析出的碘也越多，溶液的颜色也就越深。2KIH2
16、SO42HIK2SO4MNMNO32H2SO42HI2MNSO4I23H2OI22NA2S2O32NAINA2S4O6（5）将水样从溶氧瓶转移到三角烧瓶中，以淀粉做指示剂，用标准溶液NA2S2O3滴定，计算出水样中溶解氧的含量。耗氧率的计算公式RODO0DOTV/WT式中RO为单位体重耗氧率MGGH1，DO0和DOT分别为实验开始和结束时水中的DO含量，V为实验水体积L，W为实验鲫鱼重量G，T为实验时间H。3结果31臭氧处理后的耗氧率变化在水温138下，测得臭氧处理组和对照组的耗氧率见表1，从表1结果来看，A组与B组间没有显著差异，但与对照组D组差异显著（P005），耗氧率上升了约12。而C组
17、的耗氧率比A、B组显著下降，与对照组D相比较，耗氧率降低了约13。13表1不同臭氧处理条件下的耗氧率比较TABLE1UNDERTHECONDITIONOFDIFFERENTOZONEPROCESSINGOXYGENCONSUMPTIONRATECOMPARED组别平均体重（G）耗氧率1（MG/GH）耗氧率2（MG/GH）耗氧率3（MG/GH）平均耗氧率（MG/GH）D组4480311007000800064007100066A组4762553008600780074007900050B组5550618007000830086008000070C组447548100670056006200055
18、32臭氧处理后的血液化验结果经不同时间的臭氧处理和正常处理后，鲫鱼的主要血液生理指标测定结果见表2。表中的白细胞数目（WBC）除了D组白细胞未检测出，表现为A、D、B组依次增多。血红蛋白（HGB）表现为为A、B、C、D组依次增多，且B、C两组差异不大。红细胞数目（RBC）表现未B、A、C、D组依次增多。后三项的MCV平均红细胞体积（FL）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）和平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）则均表现为A、C两组无明显差异，D组略低于A、C两组，而B组各值都明显大于其他组。此结果中的数据变化情况，可能是由于臭氧作用强度和溶氧浓度变化的综合结果，其原因还有待进一步研究。表2臭氧处理
19、后的主要血液生理指标TABLE2THEMAINBLOODPHYSIOLOGICALINDEXESAFTEROZONEPROCESS组别WBC白细胞数目109/LHGB血红蛋白G/LRBC红细胞数目1012/LMCV平均红细胞体积FLMCH平均红细胞血红蛋白含量PGMCHC平均红细胞血红蛋白浓度G/LD组178288138121840121401092745125336A组13475984810300901437138150935674B组20203711711092009218392512673369115C组无123715201014621180912554833臭氧处理对鳃丝组织的影响对照
20、组鲫鱼的鳃丝组织正常（见图1），鳃小片排列整齐，结构清晰，鳃丝轴上的黑色素细胞色浓，呈收缩状；B组经每次45分钟臭氧处理后，鳃小片组织结构尚比较清晰，但黑色素细胞已受一定程度的破坏，呈枝状扩散（见图2）；每次70分钟臭氧处理的C组，色素细胞已几乎被完全破坏而消失，鳃小片组织也有一定程度的受损，结构呈现模糊不清（见图3）。14图1D组的鳃丝显微结构（示正常鳃小片和色素）FIGURE1GROUPDFILAMENTSMICROSTRUCTUREOFNORMALGILLSSMALLPIECESANDPIGMENT图2B组的鳃丝显微结构（示散开的枝状色素）FIGURE2BGROUPOFFILAMENTS
21、MICROSTRUCTUREOFBRANCHSHAPESPREADTHEPIGMENT15图3C组的鳃丝显微结构（示受损的鳃小片）FIGURE3GROUPCFILAMENTSMICROSTRUCTUREANDDAMAGEDTHEGILLSOFSMALLPIECES34不同溶氧水平处理后鲫鱼的耗氧率变化在水温142下。纯氧A组水体中的溶解氧已达超饱和，高达2219MG/L；而空气B组溶解氧浓度为2852MG/L；缺氧C组溶解氧浓度仅为1670MG/L。6D后每组的耗氧率测定结果见表3。从结果看，A组与B组比较，耗氧率提高了约9，C组与B组比较，耗氧率也提高了约9。表3不同溶氧水平处理后鲫鱼的耗氧
22、率变化TABLE3CHANGESCARPAFTERDIFFERENTDISSOLVEDOXYGENLEVELPROCESSINGOFOXYGENRATE组别平均体重（G）耗氧率1（MG/GH）耗氧率2（MG/GH）平均耗氧率（MG/GH）A组31543101101001100050B组33374300940110100080C组34411801101101135不同溶氧水平处理后的血液生理指标经高溶氧、低溶氧和缺氧处理后，鲫鱼的主要血液生理指标测定结果见表4。表中前三项的白细胞数目（WBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞数目（RBC）均表现为高氧组和缺氧组显著高于低氧组，而后两项的平均红细胞血红
23、蛋白含量（MCH）和平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）则相反。对于白细胞数目（WBC），A组比B组高出约24，C组比B组高出约28。对于血红蛋白（HGB），A组比B组高出约43，C组比B组高出约35。对于红细胞数目（RBC），A组比B组高出约51，C组比B组高出约41。对于平均红细胞血红蛋白含量（MCH），A组比B组低出约5，C组比B组低出约4。对于平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC），A组比B组低出约5，C组比B组低出约8。16表4不同溶氧水平处理后的血液生理指标TABLE4BLOODPHYSIOLOGICALINDEXESAFTERDIFFERENTDISSOLVEDOXYGENLEVELP
24、ROCESSING组别WBC白细胞数目109/LHGB血红蛋白G/LRBC红细胞数目1012/LMCV平均红细胞体积FLMCH平均红细胞血红蛋白含量PGMCHC平均红细胞血红蛋白浓度G/LA组16361061511385701507B组1318741001381740536C组168910014114417094924讨论41臭氧对养殖水质的净化作用在研究臭氧的实验过程中，每天换一次水，通过观察各处理组的水质情况，可以发现两个现象第一，充入臭氧的A、B、C3个组的水面与桶壁交界处，都附着有一圈污物，且以每次70分钟臭氧的C组最多，45分钟的B组次之，20分钟的A组最少，充入空气的D组则无污物出
25、现；第二，D、A、B、C、四个组的水质依次变得更澄清，即D组的水质最差最浑浊，C组的水质最清。分析原因应该是养鱼水体中的有机颗粒物被氧化后而呈凝絮状，从而起到了澄清水质的效果。实验鱼生活的水质之所以每次换水后会逐渐变差，主要是由鱼的粪便、排泄物和体表粘液脱落等引起。鱼体表皮中富有单细胞的粘液腺，能不断分泌粘滑的液体，使体表形成粘液层，具润滑和保护鱼体少受损伤，减少皮肤的摩擦阻力，提高运动能力；清除附着在鱼体的细菌和污物等作用12。臭氧净化水质是利用臭氧在水中进行还原反应产生的中间物质单原子氧（O）和羟基（OH）。单原子氧（O）和羟基（OH）其氧化性几乎是在瞬间进行，速度比氯快300600倍，在
26、净化水质时，可以分解有机化合物13。臭氧可以依靠其强大的氧化作用而呈现杀菌作用，杀死繁殖型细菌、芽抱、病毒、真菌、原虫包囊等。它能破坏或分解病原菌的细胞壁,迅速扩散透人细胞内,氧化破坏细胞内部而使病原菌致死14。因此，实验水体中鱼的粪便及分泌物被臭氧氧化分解，使A、B、C三个臭氧充气组较D组而言，水质更清澈干净一些。并且净化水质的效果随臭氧作用时间的延长而更加明显。42臭氧对鲫鱼耗氧率及鳃丝组织的影响在研究臭氧对鲫鱼耗氧率的影响的实验中，A、B两组分别是以每次20分钟和45分钟为臭氧作用时间，两组实验鱼在6D实验后的耗氧率比对照组D组稍高。由于臭氧净化了水质，给实验鱼创造了一个更好的生活环境，
27、而多余的臭氧还原成氧，在一定程度上增加了水体中的溶氧量，这些都有利于鱼的生存，从而耗氧率有所增加。但是，由于C组每次臭氧处理70分钟，实验鱼的耗氧率不仅没有增加，反而相比对照组D组有所降低。这说明过长时间的臭氧作用，反而会降低鱼的耗氧率。原因就在于，臭氧作为强氧化剂，臭氧几乎能与任何生物组织反应15。当溶解与水体中的臭氧被实验鱼通过鱼类的呼吸，与鳃丝上的鳃小片组织细胞接触，就会导致组织损伤，从而严重影响呼吸机能16。图3结果证明，在过长时间臭氧作用下，实验鱼鳃丝组织中的色素细胞几乎被完全破坏，鳃小片组织遭受了一定程度的破坏。而45分钟组虽然色素细胞已经开始受到影响（图2），但鳃小片组织未受到严
28、重损害。所以，从本实验结果看臭氧处理时间以控制为不超过40分钟为最佳。43不同溶氧水平对鲫鱼耗氧率的影响17在研究纯氧的实验中，A组和C组分别是高溶氧水平和缺氧水平，它们与低氧B组比较，耗氧率都有显著性提高。由此可见，虽然说深度过饱和溶氧有时会引起鱼的气泡病17，但对于A组实验鱼，并没有观察到腹部膨大、突眼等气泡病症状。所以说A组溶解氧虽然已达超饱和，高达2219MG/L，却还不足以对实验鱼产生危害。而提高了养鱼水体中的溶解氧，利于实验鱼的生长，从而耗氧率有显著增加。缺氧组C组相对于低氧B组，耗氧率也有显著性提高，这因为实验鱼在缺氧环境，鱼体的第一个反应便是增加呼吸频率，增大呼吸幅度，提高交换
29、率以维持机体对氧的需求和能量供应之间的平衡，这是鱼对低氧反应的一种普遍的适应机制18。而6D的实验时间，实验鱼长期在以一种高频率和大幅度呼吸19，当他回到正常溶氧水平的水体时，不能立即回复正常，所以测得耗氧率有显著增加。如果在缺氧环境下，没有损坏鱼的组织，并在正常溶氧水平的水体养殖数天，耗氧率可能恢复正常。44高溶氧及缺氧对鲫鱼的血红球的影响由表5可以看出，缺氧组C组与空气充气组B组比较，红细胞和血红蛋白明显增多，这种情况的出现是由于实验鱼长期在低氧条件下生活，导致组织缺氧，血中促红细胞生成素水平升高，骨髓加速释放红细胞20，所以红细胞和血红蛋白明显增多。而高溶氧A组空气充气组B组比较，红细胞
30、和血红蛋白也明显增多，这种情况的出现实因为实验鱼在充足的溶氧环境下，生长速度快，代谢旺盛，导致红细胞繁殖增快21，从而血红蛋白增多。5小结本研究得到以下几点主要结果（1）臭氧对养殖水质有净化作用，并且随着作用时间越长，效果越明显。（2）适当的臭氧作用能提高鲫鱼的耗氧率。但臭氧作用时间过长，会对鱼的鳃丝组织造成损害，降低鱼的耗氧率。（3）高溶氧条件下，鲫鱼的红细胞、血红蛋白会有所增多。（4）纯氧可以帮助使水体获得高浓度的溶解氧，使鱼耗氧率得到一定程度的提升。根据资料，深度过饱和溶氧会引起气泡病，但在实验中2219MG/L的溶氧浓度还不足以对鱼造成负面作用。参考文献1周晟安,刘建萍水产养殖新的革命
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