1、本科毕业设计（20届）香鱼APOAI原核表达及鉴定所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录摘要（ABSTRACT）1引言12实验材料与方法221原料、仪器和试剂2211原料与试剂2212主要仪器4213主要试剂及其配制422实验方法4221引物设计4222PCR产物切胶纯化4223原核表达载体的克隆4224感受态的制备5225转化与筛选克隆5226质粒提取5227重组质粒的鉴定6228APOAI基因的原核表达和检测63结果631APOAI的PCR扩增632目的片段的酶切结果733PET22B（）质粒的双酶切734重组质粒的检测835APOAI的原核表达检测与纯化94讨论
2、95小结10参考文献11附录13摘要APOAI是高密度脂蛋白HDL的主要组成蛋白，它能与磷脂、多种血浆因子及细胞受体结合，可以激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶，起着促进细胞内胆固醇的移出、酯化、转移以及调节HDL代谢的作用。与哺乳类相比，多数鱼类利用脂类作为能量来源，因此，血浆脂蛋白及其载脂蛋白在鱼类生命活动中具有重要功能。鱼类血浆脂蛋白以HDL含量最为丰富，APOAI是鱼类的先天免疫的效应因子。目的原核表达重组APOAI，为其基因功能研究奠定基础。方法以香鱼为模型，获得目的基因，经纯化、酶切后克隆到原核表达载体PET22B中，转化到大肠杆菌BL21PLYSE菌株，并对表达条件进行优化，利用SDSP
3、AGE分析鉴定目的蛋白。结果构建了香鱼重组APOAI的原核表达载体，目的蛋白在大肠杆菌BL21PLYSE菌株中获得高表达。关键词APOAI；香鱼；原核表达ABSTRACTAPOAIISTHEMAJORCOMPONENTPROTEINOFHIGHDENSITYLIPOPROTEINHDL,ITNOTONLYCANCOMBINEWITHPHOSPHOLIPIDS,AVARIETYOFPLASMAFACTORANDCELLRECEPTOR,BUTALSOCANACTIVATELECITHINCHOLESTEROLACYLTRANSFERASEITPLAYSANIMPORTANTROLEINTHEPR
4、OMOTIONOFCELLULARCHOLESTEROLPLAYSOUT,ESTERIFICATION,TRANSFER,ANDTHEROLEOFREGULATINGHDLMETABOLISMCOMPAREDWITHMAMMALS,MOSTFISHUSELIPIDSASANENERGYSOURCE,THEREFORE,PLASMALIPOPROTEINANDAPOLIPOPROTEININFISHHASIMPORTANTFUNCTIONSINLIFEACTIVITIESAPOLIPOPROTEININHDLARETHEMOSTABUNDANTFISHPLASMALIPOPROTEINSAPOA
5、IISTHEFISHINNATEIMMUNEEFFECTOROBJECTIVEPROKARYOTICEXPRESSIONOFRECOMBINANTAPOAILAYSTHEFOUNDATIONFORGENEFUNCTIONSTUDIESMETHODSUSEAYUASAMODELTOOBTAINTHETARGETGENE,THEPURIFIEDPCRPRODUCTWASCLONEDINTOTHEPROKARYOTICEXPRESSIONVECTORPET22BANDTRANSFORMEDINTOECOLIBL21PLYSESTRAINSANDTHENEXPRESSIONCONDITIONSWERE
6、OPTIMIZEDUSINGSDSPAGEANALYSIS,THETARGETPROTEINWASIDENTIFIEDRESULTSTHERECOMBINANTAYUAPOAIINECOLISTRAINBL21PLYSEWASIDENTIFIEDTOBEHIGHLYEXPRESSEDKEYWORDSAPOAIAYUPROKARYOTICEXPRESSION11引言香鱼属胡瓜鱼目香鱼科香鱼属，为我国小型名贵经济鱼类。地方又名香油鱼、瓜鱼、细鳞鱼、海胎鱼、秋生子，日本人称为鲇鱼。是一种广盐性洄游鱼类，曾被列入“雁荡五珍”，在亚洲被誉为“鱼中珍品”。因其脊背上有一条满是香脂的腔道能散发出浓郁的芳香味
7、而得名。香鱼肉质细嫩多脂，清香可口，无鱼腥味，比一般鱼类口感好，尤其是凫溪香鱼干，早在清代已远近闻名。香鱼营养丰富，其肌肉粗蛋白中含人体必需氨基酸含量高达6885，要比其他淡水鱼高出许多。香鱼为滤食性鱼类，在自然条件下，鱼苗主要摄食浮游动物和贝类幼体；长大后以石砾上附生的硅藻、蓝藻及绿藻类为食。人工养殖香鱼，蚕蛹、螺肉、剁碎的鲜杂鱼虾及小麦粉、马铃薯、黄豆、米糠、青菜等均可作为饵料，也可使用香鱼专用饵料或鳗饵料。香鱼的分布范围很广，除我国外，日本、朝鲜也有分布。香鱼的人工养殖始于日本，中国的浙江省已有试验，河北省已养殖成功，台湾省则较为盛行。载脂蛋白是脂蛋白中唯一具有化学和免疫独立特性的主要蛋
8、白成分。APOAI是高密度脂蛋白中主要的载脂蛋白成分，占高密度脂蛋白胆固醇的6070，APOAI的测定可直接反映HDLCHOL的水平研究表明APOAI基因位于11号染色体Q2122区。完整的CDNA序列全长893BP，编码267个氨基酸构成的非成熟蛋白。APOAI主要在肝脏中合成，接着在细胞内切去N端的信号肽，信号肽由18个AA残基构成，生成成熟的载脂蛋白分泌进入血浆，在血浆中蛋白酶的作用下切去一个六肽形成由243个氨基酸构成的成熟载脂蛋白，成熟载脂蛋白的分子量在28KD左右。研究发现，APOAI在胆固醇逆转运中发挥重要作用，首先它能够与磷脂结合形成新生的HDL，在将胆固醇从细胞中转移到脂蛋白
9、上时，APOAI是胆固醇的接受体。SVIRIDOV等1研究发现APOAI能够促进各种细胞胆固醇的外流，还发现它与脂质结合后该作用还有所提高。APOAI的中央和C端序列在LCAT的激活过程中发挥关键的作用。LCAT可与前RHDL结合，结合能力依赖于其中心区段残基98132和N端残基28的暴露程度，并与胆固醇结合形成胆固醇酯。APOAI还能与一些血浆因子如PLTP、CETP、对氧磷酶PON等结合，PILTP能在各种脂蛋白间转移磷脂，并可与成熟的HDL作用产生前一HDL。另外，APOAI能与肝细胞膜表面的清道夫受体BISRBI，介导HDL中的胆固酵酯的转移。利用溴化氰裂解APOAI分子得到的片段进行
10、研究，发现APOAI分子C端及N端的A类螺旋是SRBI识别的位点2。另外，谭虹等3将单支、双支、3支病变组载脂蛋白利用酶比浊法、7600全自动生化分析仪检测APOAI水平结果显示随着病变程度的加重，载脂蛋白AI水平逐渐降低，载脂蛋白AI水平与冠状动脉粥样硬化严重程度有关，载脂蛋白是冠心病的相对独立危险因素，是一项有重要意义的预测指标。糖尿病是21世纪的常见病和多发病，严重威胁人们的健康。我国糖尿病的患病率正在快速增长，其中2型糖尿病占90以上。糖尿病会出现明显脂类代谢异常，并不仅仅只是糖代谢紊乱，大量国内外研究已证实46，血脂代谢异常是糖尿病患者出现血管并发症的重要危险因素。张健，成军等7对丙
11、型肝炎病毒阳性患者和健康者进行免疫比浊法、双试剂，得出HCV与APOAI及APOAII存在着密切联系，且影响其在血清中的代谢。鱼类属于冷血变温动物，WATANABE8研究发现鱼类对糖类利用能力有限，脂类是其主要的能量来源之一，除此之外，脂类在鱼体中还担任多种角色，如促进脂溶性维生素和类胡萝卜素的吸收等9，10。对APOAI的研究起步也比较晚，目前对于鱼类APOAI的研究较少，而对哺乳类等高等动物的研究相对比较多。本研究通过构建香鱼APOAI原核表达载体，并转入大肠杆菌BL21PLYSE进行诱导表达目的蛋白，为进一步基因功能研究奠定基础。22实验材料与方法21原料、仪器和试剂211原料与试剂1菌
12、株A大肠杆菌TG1菌株由本实验室保存B大肠杆菌BL21PLYSE由本实验室保存2质粒APET22B载体由本实验室保存3工具酶ARTAQDNA聚合酶TAKARA公司B各种限制性内切酶TAKARA公司CT4DNA连接酶TAKARA公司4主要化学试剂A100BPDNAMAKERTAKARA公司B1KBDNAMAKERTAKARA公司CGELEXTRACTIONKIT50DMEGA公司DDNALIGATIONKITVER2TAKARA公司EEB上海生物工程公司F胰蛋白胨和酵母提取物上海生物工程公司G琼脂粉上海生物工程公司H琼脂糖GENETECHI氨苄青霉素上海生物工程公司J卡那霉素上海生物工程公司KI
13、PTG上海生物工程公司L蛋白预染MARKER上海生物工程公司M溴酚蓝上海生物工程公司NTEMED上海生物工程公司OTRIS上海生物工程公司P甘油浙江中星化工试剂有限公司QDTT上海生物工程公司R马斯亮蓝R250上海生物工程公司SEDTA上海生物工程公司T甘氨酸上海生物工程公司ULOADINGBUFFERTAKARA公司VBINDINGBUFFERTAKARA公司WWASHBUFFERTAKARA公司XELUTIONBUFFERTAKARA公司35引物合成INVITROGEN公司合成6测序由INVITROGEN公司完成212主要仪器（1）台式离心机THERMOLYNE公司（2）细胞超净台苏州净化
14、设备有限公司（3）电子分析天平上海科达测试仪器厂（4）磁力加热搅拌器国华企业（5）琼脂糖凝胶电泳仪BIORAD（6）聚丙烯酰胺凝胶电泳仪BIORAD（7）恒温培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品（8）涡旋振荡器江苏海门市麒麟医用仪器厂（11）PCR仪MASTERCLERPERSONAL，EPPENDORF公司（13）凝胶成像系统UVP公司213主要试剂及其配制1菌体培养及保存所用试剂ALB液体培养基NACL05，酵母抽提物05，胰蛋白胨1，用NAOH调PH至74，在151BFIN（1034X105）高压蒸汽灭菌20MIN。BLB固体培养基LB液体培养基中加入琼脂至15，高压灭菌。C10甘油
15、加10ML甘油于适量水中，加水定容至100ML过压灭菌后于4保存，备用。2琼脂糖电泳缓冲液50XTAETRIS242G，冰乙酸571ML，05MOLLEDTA（PH80）100ML，加水定容至1L。3碱裂解法提质粒所用试剂溶液I葡萄糖50MMOLL，EDTA10MMOLL（PH80），TRISHCL25MMOLL（PH80）。溶液IINAOH02MOLL，SDS1，现用现配。溶液III取5MOLLNAAC60ML，115ML，混合后加水至100ML。4CACL2法制备新鲜的感受态细胞甘油CACL260MMOLLCACL15甘油。在适量水中溶解0882GCACL2H2O，加甘油终浓度为15，并定
16、容至100ML，高压除菌后保存于4备用。5蛋白表达纯化试剂IPTG保存液100MM500MGIPTG20溶于20ML蒸馏水，用滤膜进行无菌过滤，分装保存于20。6SDSPAGE凝胶电泳所用试剂30丙烯酰胺丙烯酰胺29G，N，N亚甲丙烯酰胺1G，溶于60ML水中，定容至100ML，滤纸过滤后使用。5TRIS甘氨酸电泳缓冲液151GTRIS碱，44G甘氨酸，5GSDS，加水至1000ML。15MMOLLTRISCL（PH88）在800ML水中溶解18671GTRIS，调PH88，定容至1000ML05MMOLLTRISCL（PH68）在800ML水中溶解12114GTRIS，调PH68，定容至10
17、00ML10SDS900ML水中溶解100G电泳级SDS，加热至68助溶，加入几滴浓盐酸调节PH至72，加水定4容至1L，分装备用。10过硫酸铵称取过硫酸铵2G，适量水溶解后，定容于至20ML，分装成1ML管，20保存备用。TEMED4避光保存。脱色液45甲醇，45水，10冰乙酸。考马斯亮蓝染液脱色液中加考马斯亮蓝R250或G250至025，滤纸过滤后使用。2XSDS凝胶加样缓冲液TRISHCL（05M，PH68，25ML），SDS（04G），甘油（2ML），巯基乙醇或DTT（02ML），溴酚蓝（1）22实验方法221引物设计根据已获得香鱼APOAI基因序列设计原核表达引物PAPOAI（）5C
18、CATATGCGTACCTTGCAGGCTGATGA3；PAPOAI（）5GGAATTCTTATGCCTTAATGGACTCGCT3（下划线为添加的限制性内切酶NDE和ECORI的识别序列）。222PCR产物切胶纯化以221中原核表达引物配对进行PCR扩增，PCR产物与10LAODINGBUFFER混合，并在1（W/V）琼脂糖凝胶中电泳（120V），EB染色后漂洗，紫外灯下观察，切下预期大小的目的片段，用EZNATMGELEXTRACTIONKIT（OMEGA）纯化，具体方法如下1手术刀切下含有目的片段的凝胶并置于EPPENDORF管中，加300LBINDINGBUFFER后置5560水浴10
19、MIN，每隔23MIN颠倒混匀一次，至凝胶完全溶解；2将混合液混匀后转入蓝管，10000G离心1MIN；3加300LBINDINGBUFFER，10000G离心1MIN；4弃滤液，加700LWASHBUFFER于蓝管中，10000G离心1MIN；5弃滤液，另加700LWASHBUFFER于蓝管中，10000G离心1MIN；6弃滤液，13000G离心2MIN，彻底去除蓝管中的WASHBUFFER残留；7加入30LELUTIONBUFFER于蓝管，室温静置1MIN，13000G离心1MIN，收集产物30保存。223原核表达载体的克隆1按（221、222）步骤获得含有目的基因的克隆。2采用EZNAP
20、LASMIDMINIKITI试剂盒（OMEGA）分别纯化质粒PET22B（）和PCR产物。3对纯化的质粒进行双酶切，反应体系如下纯化的质粒16L10K缓冲液2LBAMHI1LNDEI1L反应总体积20L37水浴2H4切胶纯化酶切后产物经1琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的条带，用切胶纯化试剂盒EZNATMGELEXTRACTIONKIT（OMEGA）纯化，步骤如前所述。55连接采用TAKARA公司的DNALIGATIONKITVER2，PET22B（）载体反应体系如下双酶切基因产物4LPET22B1LSOLUTIONI5L反应总体积10L16连接30MIN后，4过夜6将连接产物转化至TG1菌株，涂于
21、含氨苄青霉素（50G/ML）的LB培养基上，筛选所需的克隆，经PCR进一步确定。224感受态制备采用CACL2法制备感受态细胞，具体方法如下1接种80长期保存的大肠杆菌菌株到5MLLB（每升含10GTRYPTONE，5GYEASTEXTRACT，10GNACL，PH70）液体培养基中，37摇床，200RPM，培养过夜（12H左右）；2按1100比例取50L母液稀释到新鲜的5MLLB液体培养基中，继续37摇床培养，200RPM，培养2H；3取出菌液置冰上冷却10MIN，将冰冷的菌液1ML每管分装到15ML的EPPENDORF管，8000G离心1MIN，弃上清；4沉淀用200L预冷的01MOL/L
22、CACL2悬浮，冰浴30MIN后，8000G离心1MIN，弃上清；5沉淀再用100L01MOL/LCACL2重悬浮，冰浴放置524H备用。225转化和筛选克隆1将10L连接产物加到100L感受态细胞中，移液枪轻轻吹打混匀冰浴放置30MIN；2在42水浴条件下热激90S，立即转移到冰上冷却2MIN；3加入冰预冷的LB培养液总体积至1ML，37摇床低速（170180RPM）培养1H；4在预先均匀涂布XGAL和IPTG的LB平板上（液体LB培养基中添加15琼脂粉），取100L转化后的培养菌液，涂布于含氨卞青霉素（50G/ML），37培养箱培养过夜（1014H）；5筛选白色菌落置5ML含氨卞青霉素（5
23、0G/ML）的LB培养液，在37摇床，200RPM，培养812H。226质粒提取根据质粒在下游实验中用途不同，我们用不同的方法抽提质粒，其中用于检测和筛选阳性克隆采用碱裂法小量抽提质粒。用于双酶切的质粒采用EZNAPLASMIDMINIKITI试剂盒（OMEGA）精抽纯化。裂解法（粗提质粒）1取1ML菌液于15ML的EPPENDORF管中，8000G离心1MIN，弃去上清；2加入溶液I（50MMOL/L葡萄糖，10MMOL/LEDTA，25MMOL/LTRISCLPH80）100L，剧烈震荡使细胞悬浮；3加新配制的新鲜溶液II（02MOL/LNAOH，1SDS）200L，轻柔颠倒数次，待菌悬浮
24、液澄清；4加入150L溶液III（3MOL/LKAC，2MOL/LHAC），混匀后13000G离心10MIN；65将380L上清转移至新的EPPENDORF管中，加入异丙醇720L，颠倒数次13000G离心10MIN；6弃上清，沉淀经自然干燥后加50L无菌水溶解。227重组质粒的鉴定将碱裂法抽提的质粒与10上样缓冲液混匀后，1琼脂糖凝胶电泳，选择大小合适的重组质粒进行PCR检测，PCR检测体系如前。PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳分离。鉴定为目的重组质粒后，将目的菌株的菌液加10甘油混匀后置于80保存。228APOAI基因的原核表达和检测1采用EZNAPLASMIDMINIKITI试剂盒（OMEG
25、A）纯化目的质粒。2转化至BL21PLYSE菌株，涂于含氨苄青霉素（50G/ML）的LB培养基上，过夜培养（1014H）。3诱导挑选单个菌落接种于5MLLB培养液（含50G/ML氨苄青霉素），37摇床培养过夜。取50L按1100比例稀释接种LB培养液（含50G/ML氨苄青霉素）5ML中，2H后，取1ML作为对照，其余培养液中加入IPTG（终浓度为04MMOL/L），继续培养2H。4检测取1ML菌液于15ML的EPPENDORF管，8000G离心1MIN，菌体加100L2SDSPAGE上样缓冲液（50MMOL/LTRISHCLPH68，100MMOL/LDTT，2SDS，001溴酚蓝，20甘油）
26、，煮沸5MIN，10000G离10MIN后，取上清20L进行SDSPAGE电泳，用未诱导的菌体和BL21PLYSE菌体蛋白作对照，进行电泳。样品在进入分离胶前用80V，进入分离胶后加至95V。5染色与脱色电泳完成后，取出聚丙烯酰胺凝胶，切去浓缩胶，同时切一角作为方向标记，蒸馏水冲洗。用考马斯亮蓝R250（025COOMASSIESBRIGHTBLUER250）染色，室温下，染色30MIN后转至脱色液，漂洗至凝胶背景无颜色，蛋白条带清晰，观察是否表达。3结果31APOAI的PCR扩增结果设计原核表达引物并进行PCR扩增，经过在1琼脂糖凝胶上进行电泳、EB染色和漂洗后，能够在紫外灯下清晰地看到76
27、5BP左右的条带，与预期目的片段大小相符。7图1香鱼APOAI的PCR扩增M1KB的DNA标准分子对照；1APOAI的PCR产物32目的片段的酶切结果PCR产物采用EZNAPLASMIDMINIKITI试剂盒（OMEGA）纯化，分别用限制性内切酶NDE和BAMH进行酶切，酶切后产物经1琼脂糖凝胶电泳分离、EB染色和漂洗后，观察到电泳条带大小和预期相符。图2目的片段的双酶切M1KB的DNA标准分子对照；1经双酶切的目的片段33PET22B（）质粒的双酶切结果原核表达载体PET22B（）载体质粒采用EZNAPLASMIDMINIKITI试剂盒（OMEGA）纯化，分别用限制性内切酶NDE和BAMH进
28、行酶切，经电泳、EB染色和漂洗后进行观察，看到电泳条带大小和预期相符。8图3PET22B（）质粒的双酶切M1KB的DNA标准分子对照；1经双酶切的PET22B（）质粒34重组质粒的检测重组质粒进行琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图4，表明4号质粒为目的重组质粒，与预期大小（63KB）一致。再选择合适2、3、4号质粒进行PCR检测图5，结果显示，4号质粒PCR产物条带大小和预期（765BP）相符。经测序验证，与原序列相符。图4重组质粒的凝胶电泳M1KB的DNA标准分子对照1PET22BAPOAI1质粒；2PET22BAPOAI2质粒；3PET22BAPOAI3质粒；4PET22BAPOAI4质粒图5P
29、CR检测图M1KB的DNA标准分子对照；1PET22BAPOAI2质粒的PCR鉴定；92PET22BAPOAI3质粒的PCR鉴定；3PET22BAPOAI4质粒的PCR鉴定35APOAI的原核表达检测与纯化构建好的原核表达质粒PET22BAPOAI转化到大肠杆菌BL21PLYSE菌株中，菌株经诱导表达4H后，通过SDSPAGE电泳分离，用考马斯亮蓝R250染色、脱色、漂洗。观察到一条高表达的诱导蛋白带，分子量约在286KD左右，与预测蛋白的分子量大小一致，而对照组空质粒无目的大小蛋白的表达。说明我们成功构建了香鱼APOAI原核表达的载体并实现了目的蛋白的表达。图6APOAI原核表达产物的SDS
30、PAGE分析M蛋白质分子量标准，大小（KD）在图左标示；1PET22B（）转化的BL21PLYSE菌，经IPTG诱导的裂解物；2PET22BAPOAI转化的BL21PLYSE菌，未经IPTG诱导的裂解物；3PET22BAPOAI转化的BL21PLYSE菌，经IPTG诱导后的裂解物4讨论这次实验我们成功构建了香鱼APOAI的原核表达载体PET22BAPOAI，并通过转化到大肠杆菌BL21PLYSE菌株，经诱导表达后，通过SDSPAGE检测表明预期大小的目的蛋白大量表达。在哺乳类的研究中都发现APOAI基因在肝和肠中表达最高11。研究发现APOAI在禽类和鸟类的肾、脑、心脏等组织中的都有表达12，
31、并不仅仅局限在肝和肠中。在鱼类研究中发现差异较大，比如鲤鱼肠中没有发现APOAI基因的表达13，在很多鱼类中发现脑和皮肤中也有该基因的表达14,15，甚至有些鱼类心脏中的表达量较高16，这表明鱼类与高等动物以及不同鱼类之间APOAI的组织表达特征有差异，具有物种特异性和种间特异性。这可能与鱼类在自然界中所处的进化地位和生存环境更加复杂有关。香鱼APOAI基因在鱼类各组织包括肝、脾、肾、脑、心、鳃、肌肉、肠中均有表达，最主要的场所是肝，其次是肠、脑。香鱼APOAI基因在各组织中广泛存在说明APOAI可能对香鱼这种洄游性鱼类有更加重要的作用。目前关于鱼类APOAI相对较少，载脂蛋白的主要功能是在血
32、浆中与各种脂质结合形成脂蛋10白，转运并进行脂类的代谢。SINGH等17，18研究认为APOAI除了有脂质运输功能外，它还可能是鱼类免疫功能中的一种免疫蛋白。经过进一步的研究发现，香鱼血清中存在大量的APOAI，这与在哺乳类和其它鱼类中的研究结果相一致的1920,13。细胞胆固醇的移出可以通过扩散、特异性位点结合、非特异性位点结合3种方式。扩散途径是以胆固醇浓度差作为动力、胆固醇从细胞膜上脱离，通过扩散作用与球形HDL结合。这一过程中，APOAI不与细胞膜作用，但可以稳定HDL分子。胆固醇与球形HDL的作用取决于APOAI的不同类型、A螺旋的亲脂性及保留胆固醇的能力。特异性结合是指在前HDL中
33、，APOAI分子中的双性A螺旋并未完全与磷脂结合，而可以与细胞膜上特殊的脂表面或者特异性的蛋白受体作用，从而使细胞膜上胆固醇和磷脂同时溶解移出21。DAVIDSONWS等22利用人工合成APOAI肽段研究发现，APOAI能与细胞膜上双层磷脂发生短暂作用，破坏细胞膜上磷脂与胆固醇的结合，使胆固醇从细胞膜上解离的更容易，由于HDL与细胞膜的直接接触，可缩短胆固醇到达HDL的路径距离。这种结合不需要特异性位点的参与，称之为非特异性的结合。有研究表明，APOAI在维持内皮细胞形态、提高内皮细胞生存率、维持细胞膜的完整性方面发挥重要作用23。APOAI的双性螺旋结构对CA2及其载体有拮抗作用，导致脂质磷
34、脂酰丝氨酸扩散到细胞外面，从而使前凝血酶不能转变为凝血酶，抑制凝血酶的活化，保护细胞膜的结构。24APOAI可能是通过刺激内皮细胞中的PGI2合成酶增加PGI2的合成量，此外HDL拮抗LDL从而对内皮细胞起到保护的作用，此作用又与APOAI有关25。还有研究表明，APOAI具有抗细菌内毒素和抗病毒的作用。细菌内毒素脂多（LIPOPOLYSACCHARIDE，LPS）能够与机体单核吞噬细胞作用引起机体的非特异性免疫，引起内毒素血症的各种症状26，而APOAI能够与LPS结合从而中和LPS的毒性。HDL及HDL中的APOAI具有广泛的抗病毒活性，对DNA病毒、RNA病毒、有包膜或无包膜病毒都有拮抗
35、作用。APOAI的抗病毒活性与其分子中所具有的螺旋结构相关，MARTIN等27在对HIV病毒的研究中发现，APOAI中双性螺旋能够抑制HIV病毒的感染及其诱导细胞融合。免疫学研究28发现APOAI能够与CD4受体相互作用，减弱HIV病毒感染宿主细胞的能力。胡国芳等29人的研究也发现APOAI片段可以抑制单纯疱疹病毒对真核细胞的感染，保护细胞的正常生长。中性粒细胞是抵抗病原微生物的第一道防线，是在APR中最早被激活并到达炎症部位的细胞，它通过释放炎性介质和吞噬作用抵抗病原微生物。因为中性粒细胞释放的炎性介质会造成机体组织损伤，所以中性粒细胞功能必须严格调节。而APOAI是一类参与调节中性粒细胞功
36、能的介质，因为血清脂蛋白中APOAI能够中和LPS的毒性，减弱LPS对中性粒细胞的激活功能。5小结本文以香鱼APOAI为研究对象，采用分子生物学原核表达技术成功构建了香鱼APOAI的原核表达载体PET22BAPOAI并成功在原核宿主菌BL21PLYSE中表达。参考文献111SVIRIDOVD,FIDGENEFFLUXOFINTRACELLULARVERSUSPLASMAMEMBERANECHOLESTEROLINHEPG2CELLSDIFFERENTAVAILABILITYANDREGULATIONBYAPOLIPOPROTEINAIJJLIPIDRES,1995,369188718962WI
37、LLIAMSDL,THUAHNAIST,CONNELLYMA,ETALBINDINGANDCROSSLINKINGSTUDIESSHOWTHATSCAVENGERRECEPTORBIINTERACTSWITHMULTIPLESITESINAPOLIPOPROTEINAIANDIDENTIFYTHECLASSAAMPHIPATHICALPHAHELIXASARECOGNITIONMOTIFJJBIOLCHEM,2000,2752518897189043谭虹,金鑫载脂蛋白A1与冠状动脉粥样硬化性心脏病的关系J实用临床医学,2010,11527314莫蔚林糖尿病血脂异常与调脂治疗J安徽医学,2004
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40、IERSANDPLASMALEVELSINSICKANDHEALTHYFISHJFISHSHELLFISHIMMUNOLOGY2007,23119720911KARDASSISD,LACCOTRIPEM,TALIANIDISI,ETALTRANSCRIPTIONALREGULATIONOFTHEGENESINVOLVEDINLIPOPROTEINTRANSPORTS,THEROLEOFPROXIMALPROMOTERSANDLONGRANGEREGULATORYELEMENTSANDFACTORSINAPOLIPOPROTEINGENEREGULATIONJHYPERTENSION,1996,
41、27980100812FERRARIS,DRUSIANIE,CALANDRAS,ETALISOLATIONOFACDNACLONEFORCHICKINTESTINALAPOLIPOPROTEINSAIANDITSUSEFORDETECTINGAPOAIMRNAEXPRESSIONINSEVERALCHICKTISSUESJGENE,1986,42220921413CONCHAMI,SMITHVJ,CASTROK,ETALAPOLIPOPROTEINSAIANDAIIAREPOTENTIALLYIMPORTANTEFFECTORSOFINNATEIMMUNITYINTHETELEOSTFISHC
42、YPRINUSCARPIOJEURJBIOCHEM,2004,271142984299014CONCHAMI,MOLINAS,OYARZNC,ETALLOCALEXPRESSIONOFAPOLIPOPROTEINAIGENEANDAPOSSIBLEROLEFORHDLINPRIMARYDEFENCEINTHECARPSKINJFISHSHELLSHIMMUNOL,2003,14325927315KONDOH,MORINAGAK,MISAKIR,ETALCHARACTERIZATIONOFTHEPUFFERFISHTAKIFUGURUBRIPESAPOLIPOPROTEINMULTIGENEFA
43、MILYJGENE,2005,34625726616KIMAKY,CHOAYS,BANGIC,ETALISOLATIONANDCHARACTERIZATIONOFTHEAPOLIPOPROTEINMULTIGENEFAMILYINHEMIBARBUSMYLODONTELEOSTEICYPRINIFORMESJCOMPARATIVEBIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGY,PARTB,2009,1521384617SINGHIP,CHOPRAAK,COPPENHAVERDH,ETALLIPOPROTEINSACCOUNTFORPARTOFBROADNONSPECIFICANTIVIRA
44、LACTIVITYOFHUMANSERUMJANTIVIRALRES,1999,42321121818SRINIVASRV,BIRKEDALB,OWENSRJ,ETALANTIVIRALEFFECTSOFAPOLIPOPROTEINAIANDITSSYNTHETICAMPHIPATHICPEPTIDEANALOGSJVIROLOGY,1990,1761485719PAOLUCCIM,GUERRIEROG,BOTTEV,ETALAPOLIPOPROTEINEGENEEXPRESSIONCORRELATESWITHENDOGENOUSLIPIDNUTRITIONANDYOLKSYNCYTIALLA
45、YERLIPOPROTEINSYNTHESISDURINGFISHDEVELOPMENTJCELLTISSUERES,2000,300225126120KONDOH,KAWAZOEI,NAKAYAM,ETALTHENOVELSEQUENCESOFMAJORPLASMAAPOLIPOPROTEINSINTHEEELANGUILLAJAPONICAJBIOCHIMBIOPHYSACTA,2001,153113214221GILLOTTEKL,PHILLIPSMC,DAVIDSONWS,ETALREMOVALOFCELLULARCHOLESTEROLBYPREHDLINVOLVESPLASMAMEM
46、BRANEMICROSOLUBILIZATIONJJLIPIDRES,1998,39101918192822DAVIDSONWS,WILLIAMWM,HAZIETTT,ETALTHEROLEOFAPOLIPOPROTEINAIDOMAINSINLIPIDBINDINGJPNAS,1996,9324136051361023LIJ,JIANGL,LIUQHPROTECTIVEEFFECTOFAPOLIPOPROTEINAI,AII,CIANDCIIONENDOTHELIALCELLSINJURYINDUCEDBYLOWDENSITYLIPOPROTEINJCHINMEDJ,1998,1111788
47、124TYLEREM,SEGRETJP,EPANDRM,ETALRECIPROALEFFECTSOFAPOLIPOPROTEINANDLYTICPEPTIDEANALOGSONMENBRANCEJJBIOLCHM,1993,26829221122211825KLIMOVAN,GUREVICHVS,NIKIFOROVAAA,ETALANTIOXIDATIVEACTIVITYOFHIGHDENSITYLIPOPROTEINSINVIVOJATHEROSCLEROSIS,1993,1001131826杨东亮,叶嗣颖主编感染免疫学M湖北科学技术出版社,1998,1227MARTINI,DUBOISMC
48、,SAERMARKT,ETALAPOLIPOPROTEINAIINTERACTSWITHTHENTERMINALFUSOGENICDOMAINSOFSIVSIMIANIMMUNODEFICIENCYVIRUSGP32ANDHIVHUMANIMMUNODEFICIENCYVIRUSGP41IMPLICATIONSINVIRALENTRYJBIOCHENBIOPHYSRESCOMMUN,1992,18619510128PAINLE,KOSTINANEINTERACTIONOFHUMANAPOLIPOPROTEINAIANDHIV1ENVELOPEPROTEINSWITHTHENATIVEANDRECOMBINANTCD4RECEPTORJBULLEXPBIOLMED,2002,133434234329胡国芳,陈宝生,杨晓惠,等血浆载脂蛋白AI生理功能的研究AI及其裂片段对单纯疱疹病毒感染细胞的作用J中国医学科学院报,1994,16298103
