1、本科毕业设计（20_届）鱼类养殖网箱内两种寄生性纤毛虫研究所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言111研究目的及意义112研究历史、现状及趋势1121研究历史1122研究现状1123研究趋势22寄生性纤毛虫概述221纤毛虫特征222寄生性纤毛虫种类2221专性寄生种2222外共栖种2223兼性寄生种3224自由生活种33实验材料331材料332仪器333试剂34实验方法341采集342分离443培养444活体观察445蛋白银染色45结果与讨论551多核拟双棘虫PARABIROJIMIAMULTINUCLEATE5511形态描述5512讨论与比较652盾片异列虫A
2、NTEHOLOSTICHASCUTELLUM6521形态描述6522讨论与比较66结论11致谢错误未定义书签。参考文献12摘要随着集约化水产养殖的持续发展，由纤毛虫引发的鱼类寄生性疾病的发生率和危害性不断提高，造成了巨大的经济损失。本文利用活体观察和蛋白银染色技术对两种采自大黄鱼养殖网箱中的纤毛虫进行形态学研究。结果显示这两种纤毛虫是隶属于腹毛目的多核拟双棘虫及盾片异列虫，多核拟双棘虫的特征为虫体细长带状，口围带分成两部分，3根额棘毛，1根口棘毛，中腹棘毛复合体由5个棘毛对及55根棘毛组成，1列左缘棘毛，5列右缘棘毛，611根横棘毛，3列背部动基列，约50个大核，无额前棘毛及尾棘毛。盾片异列虫
3、的特征为虫体椭圆形，口围带连续，3根额棘毛，2根额前棘毛，1根口棘毛，中腹棘毛复合体由67对棘毛组成，左右缘棘毛各15根，8根横棘毛呈“U”字形排列，2根横前棘毛，3列背部动基列，约60个大核，无尾棘毛。关键词多核拟双棘虫；盾片异列虫；形态学；纤毛图式ABSTRACTWITHRAPIDDEVELOPMENTOFINTENSIVEAQUACULTURE,INCIDENCEANDPERNICIOUSNESSOFPARASITICDISEASESOFFISHCAUSEDBYTHECILIATESISCONSTANTLYIMPROVING,CAUSEMASSIVEECONOMICLOSSESINTHI
4、SARTICLE,TWOCILIATESWEREISOLATEDFROMPSEUDOSCIAENACROCEAFARMINGWATERSANDTHENMORPHOLOGICALLYSTUDIEDUSINGINVIVOANDPROTARGOLIMPREGNATIONMETHODSTHERESULTSSHOWEDTHATTHESETWOCILIATESAREPARABIROJIMIAMULTINUCLEATEANDANTEHOLOSTICHASCUTELLUM,THEYBELONGTOHYPOTRICHIDAPARABIROJIMIAMULTINUCLEATECHARACTERISTICSBODY
5、SLENDERANDBANDLIKE,ADORALZONEOFMEMBRANELLESBIPARTITE,THREEFRONTALCIRRI,ONEBUCCALCIRRUS,MIDVENTRALCOMPLEXCOMPOSEDOFABOUTFIVECIRRALPAIRSAND55CIRRI,ONELEFTANDFIVERIGHTMARGINALROWS,SIXTOELEVENTRANSVERSECIRRI,THREEDORSALKINETIES,ABOUT50MACRONUCLEAR,CAUDALCIRRIANDFRONTOTERMINALCIRRIABSENTANTEHOLOSTICHASCU
6、TELLUMCHARACTERISTICSOUTLINESHAPEUSUALLYELLIPSOID,ADORALZONEOFMEMBRANELLESCONTINUOUS,THREEFRONTALCIRRI,TWOFRONTOTERMINALCIRRI,ONEBUCCALCIRRUS,MIDVENTRALCOMPLEXCOMPOSEDOFSIXTOSEVENPAIRSOFCIRRI,BOTHLEFTANDRIGHTMARGINALROWSCONSISTOFCA15CIRRI,EIGHTTRANSVERSECIRRIARRANGEDINUSHAPEDROW,TWOPRETRANSVERSEVENT
7、RALCIRRI,THREEDORSALKINETIES,ABOUT50MACRONUCLEAR,CAUDALCIRRIABSENTKEYWORDSPARABIROJIMIAMULTINUCLEATEANTEHOLOSTICHASCUTELLUMMORPHOLOGYINFRACILIATURE11引言11研究目的及意义鱼类具有较高的营养价值、观赏价值和药用价值，是人民生活中不可缺少的一部分。早在旧石器时代中晚期，捕捞渔业此时原始人类就已在江河和海洋中捕捞鱼类、贝类等水生经济动物，称为渔猎1就已经出现，后随着渔业生产工具、技术和方法的不断改进和提高，养殖渔业才逐渐产生。由于渔业具有投资少、收效快
8、、效益高和不占用耕地等优点2，使其一跃成为第一产业，成为国民经济的重要组成部分。近年来，随着集约化水产养殖的发展3，鱼类养殖密度越来越大，最终导致各种养殖疾病接踵而至，造成了巨大的经济损失。目前，对鱼类疾病的研究主要集中在病毒性和细菌性疾病上，而对由原生动物引起的寄生性疾病往往被忽视。一般情况下，大多数寄生虫对鱼类并不会产生明显的危害，在稳定的水生态系统中，鱼类与寄生虫种群之间处于平衡状态，然而当环境与生态急剧改变时，鱼类就会因寄生虫大量侵入而暴发寄生虫病，给渔业生产带来巨大的经济损失4,5。纤毛虫是原生动物中种类最多的一大类群，其对鱼类的危害可概括为以下4个方面1机械性刺激及损伤可直接造成鱼
9、类死亡或由此引起继发性感染，带来不良的后果；2压挤与阻塞当一些寄生于鱼体敏感或要害部位的纤毛虫大量繁殖时，就会引起腔、管的阻塞与破裂，组织萎缩、坏死，造成生理机能丧失；3掠夺营养掠夺鱼体血液和其他组织及器官中的营养，使之营养不良，生长发育受阻；4毒素作用有些纤毛虫在寄生过程中会释放毒素、代谢产物及腺体分泌物，对鱼类产生一定的影响6。因而只有加快对寄生性纤毛虫的研究，加强科技成果在实际中的应用，才能使鱼类养殖业一直保持快速健康的发展，才能增加渔业效益，改善人民生活水平。12研究历史、现状及趋势121研究历史早在17世纪后期，列文虎克就已用自制的显微镜首次发现并用文字描述了各种不同的纤毛虫。但由于
10、研究手段的限制，直至20世纪5060年代，纤毛虫研究仍停留在“经典”时期，即通过活体观察获得虫体大小、外形、行为等方面的特征。随后纤毛虫的研究发生了翻天覆地的变化，20世纪6070年代是纤毛虫研究的一个突破性时期，在这一时期，纤毛虫研究从经典的建立在活体观察水平上的研究转入到应用现代技术银染技术、新的观察手段如免疫荧光技术、微分干涉技术、分子生物技术以及电镜技术等7对“纤毛图式”、超微结构以及分子生物学特征等进行揭示的研究上8。但大部分研究都围绕着淡水鱼类之寄生种类，而对海水养殖鱼类之寄生类群的研究由于种种原因基本上处于停滞或空白状态包括海水养殖开展比较普遍的日本及其它东南亚国家和地区在内，系
11、统工作则完全缺失。我国对于纤毛虫原生动物的研究起步较晚，且几乎仅限于淡水鱼类的危害类群。直到80年代初，随着海水养殖业的兴起，养殖动物的纤毛虫病才开始逐渐引起人们的关注。但由于研究历史短，加之我国在海洋类群上的研究力量相对较薄弱，故有关海洋寄生纤毛虫原生动物的研究至今仍处于缺乏深入和系统性的状态。目前，虽然我国对海水鱼类的瓣体虫、丽克虫、车轮虫、隐核虫、缘毛类及盾纤类纤毛虫病等的病原鉴定、生活史、危害及防治手段有了若干报道，但由于观察者经验和资料的限制，许多病原报道均不同程度地存在着错误、混乱或不实之处。122研究现状我国今天的寄生性纤毛虫原生动物研究较之国际水平还存在一定的差距，许多领域尚属
12、起步阶段，甚至完全处于空白状态，主要是由以下3个原因造成的1由寄生性纤毛虫原生动物所引起的鱼类病害通常表现为渐进性发生并且传播和发展较为缓慢，不同于病毒或原核类微生物所引起的病害那样表现有暴发性和迅速传播等特征，因此常常为人所忽视而低估其潜在的危害；2该类病原普遍个体微小且高度特化，形成了许多特有胞器如各种纤毛器、银线系、核器等，这些胞器大部分都无法观察直视既便使用最现代的观察工具，需借助多种现代技术进行研究，因而给病原鉴定和研究带来诸多限制；3我国长期以来对该类寄生类群的研究处于空白状态，而这项工作对于技术、经验、资料和研究的连续性的依赖又是如此之大，以致于在无研究背景的条件下难于开展研究9
13、。寄生性纤毛虫对养殖业来说是一种持续性威胁，而我国目前该领域研究的现状是参考资料严重缺乏，2养殖生产中对这类病原生物的调查鉴定、病害预防以至防治工作实际上处于一种无据可依、无章可循的状态。为了摆脱这种状况，更好地发展养殖业，养殖者不仅需要知道如何治疗纤毛虫病，同时也需熟悉纤毛虫的形态学特征、生活史以及与外界环境的相互关系，从而控制它们的生长发育，最终将其彻底消灭，使我国的养殖业健康发展。123研究趋势由于全球经济一体化的发展以及环境变化的影响，寄生性纤毛虫原生动物出现了新的情况，其中包括虫种分布的变化，区域优势种的变化，新种逐渐增多，某些纤毛虫病的流行范围不断扩大、流行强度不断增加。在这种情况
14、下仅使用传统方法对其进行研究难以达到理想效果。因此，更需要在新的基础知识及新的研究技术上有所创新。结合寄生性纤毛虫原生动物的研究历史与现状，相信在今后相当长的一段时间内，纤毛虫的形态结构、种类鉴定、繁殖方式、生态习性、传播途径及防治手段等将成为研究的重点。2寄生性纤毛虫概述21纤毛虫特征纤毛虫在分类学上隶属于原生动物亚界之纤毛门，是原生动物各门中特化程度最高也是最复杂的一大类群10，具有十分久远的进化和演化史，是地球上最古老的真核生物之一。迄今已知的纤毛虫约9000余种，命名者则超过15000种，它们在形态结构、生活方式、环境分布及其他生物学特征方面均表现出较大的多样性。其基本特征是1在其生活
15、史中至少在某一时期存在纤毛或纤毛器由纤毛进一步特化而成的具特殊功能的“小器官”作为运动和摄食胞器；2具两型核司营养的多倍体的大核和司生殖的二倍体的小核；3具有高度特化的细胞器如纤毛、食物泡、伸缩泡、胞口、胞咽、胞肛等；4无性生殖通常为横二分裂11，少数种类有出芽生殖；5有性生殖为独特的接合生殖即两个虫体暂时在口凹部分彼此接合，互换小核，进行核质交换，似受精作用12，极少数有配子生殖；6生活方式有自由生活、共生、共栖及寄生等多种类型13。22寄生性纤毛虫种类221专性寄生种在纤毛虫原生动物中，真正意义上的寄生种类仅为少数，它们可能往往并不表现出十分显著的宿主专一性，但危害性却很高14。如小瓜虫，
16、寄生于淡水鱼中的是多子小瓜虫，寄生于海水鱼中的是咸水小瓜虫，又称刺激隐核虫。上述两种小瓜虫都是专性寄生性纤毛虫类，分布很广，几乎遍及全世界，对宿主种类和年龄均无严格选择性15，主要寄生于鱼类的鳃、皮肤、口腔、鼻、眼角膜等处。症状为发病初期，体表可见少量的白色小点状囊泡，病鱼表现为烦躁不安，但摄食正常；随着病情的加重，白色小点状囊泡逐渐蔓延到全身，直至鳃及眼角膜等处；鱼体受刺激后体表分泌的粘液遍布全身，形成一层混浊的白色薄膜；鳃组织溃烂且呈暗红色；表皮糜烂、脱落；摄食量逐渐下降直至完全不摄食，鱼体体色发黑，形体消瘦，游泳缓慢。重者呼吸困难，窒息而亡16,17。222外共栖种许多危害性种类在严格意
17、义上应属于外共栖生活，但因其常存在于宿主的敏感或要害部位如鳃表、感官或运动器官表面而危及养殖动物的呼吸、运动、摄食以及其它生理活动，即以间接方式危及宿主。如车轮虫类、杯体虫等。车轮虫18主要以细菌、有机碎屑或宿主脱落的细胞和组织为食，附着于宿主体表或鳃表，严格上讲是一种共栖而非寄生关系，但将之列为寄生种类，是由于它可通过附着盘紧紧吸附在宿主组织表面，对宿主产生一定程度的损伤。尤其是当宿主的鳃组织因机械损伤或其他原因形成炎症灶时，其附着及机械刺激即会加重症状，从而对宿主产生明显的危害性和损伤。症状为病鱼因虫体寄生的刺激，引起组织发炎，分泌大量粘液，在体部、鳃部形成一层粘液层。鱼体体色发黑，形体消
18、瘦，游动缓慢，呼吸困难，以至死亡19。杯体虫主要以细菌和有机颗粒为食，常附着于宿主体表或鳃表，是一种共栖种类20，其少量寄生对宿主危害不大，但当水体中的有机质含量增多而换水量少时，虫体就会大量繁殖而引发鱼类疾病。症状为病鱼鳃部呈黄色或灰黑色且分泌大量粘液，鳍条破损，病鱼体色发黑，游动缓慢，最终因鳃部受压，窒息而亡21。3223兼性寄生种少数危害性种类属于兼性宿主种，即在通常情况下营完全的自由生活，但在特定的条件下如宿主因伤残而招致病原的侵入则会在宿主体内或表浅部位大量滋生，从而构成对养殖动物的直接危害。如盾纤毛虫22，属兼性寄生虫，一般情况下营自由生活，以悬浮的微小颗粒物质细菌、微藻、原虫等为
19、食，但在某些环境下，这些纤毛虫可以表现为寄生性，吞噬某些鱼类的细胞和组织残渣并在其组织内生长、繁殖。症状为感染初期病鱼皮肤颜色发白，出现白斑，粘液增多，病灶处外观表现为浮肿状；随着病情的发展，病鱼体色变暗、活力减弱、摄食量降低、生长减慢，严重感染个体的病灶处皮肤发生溃烂、出血。解剖可观察到病鱼多有腹水，肝脏充血，部分病鱼肝脏内可观察到有虫体存在。盾纤毛虫的大量寄生不仅能损害鱼鳃的正常功能，使病鱼呼吸困难，窒息而亡，还能引起各器官组织变性、坏死，使病鱼器官功能衰竭，加速病鱼死亡23。224自由生活种除上述几种纤毛虫外，还有一部分营自由生活的纤毛虫也被列为危害类群。主要原因是其普遍偏好富营养环境，
20、可在高污染水体内形成优势种群，因此常可加剧水质的恶化，或对水产养殖中的某些环节如饵料培养等产生破坏作用。3实验材料31材料宁波位于浙江沿海北部，具有丰富的渔业资源和良好的区位条件，是中国渔业最发达的城市之一。大黄鱼作为宁波养殖渔业中的一员，对宁波的水产养殖业具有重要的意义。大黄鱼隶属硬骨鱼纲，鲈形目，石首鱼科，黄鱼属，又名黄鱼、黄花鱼、石头鱼等，是我国重要的经济鱼类24,25，以体色金黄、味道鲜美而闻名26。但随着集约化水产养殖的发展，大黄鱼养殖疾病的发生率和危害性不断提高，已逐渐成为制约大黄鱼养殖业发展的重要因素之一，因而本实验以宁波市大黄鱼网箱养殖场网箱内的纤毛虫为实验材料，对其进行形态学
21、研究。32仪器不同口径的吸管、培养皿、载玻片、盖玻片、多孔凹玻片、胚胎皿、解剖镜、光学显微镜、微分干涉显微镜、加热板、眉毛笔。33试剂表1实验所需的各种试剂及配制试剂配制凡士林固定液BOUIN液1份冰醋酸CH3COOH，1份甲醛溶液HCHO，15份苦味酸NO23C6H2OH饱和升汞液氯化高汞HGCL2溶于水制成饱和溶液漂白液次氯酸钠NACLO次氯酸钾KCLO蛋白银显影液01G对苯二酚C6H6O2，5G亚硫酸钠NA2SO3，100ML蒸馏水定影液硫代硫酸钠NA2S2O3蛋白胶1份过滤蛋清加1份甘油C3H5OH3，放少许麝香草酚C10H14O，05保存脱水剂各种浓度的酒精透明剂二甲苯C6H4CH3
22、2树胶4实验方法41采集于2011年3月从宁波市大黄鱼网箱养殖场的网箱上刮取纤毛虫，并在采集同时认真地记录采集时间、4地点及主要生境特征如温度、盐度等等，经测量水温为12，盐度为25。42分离因采集后虫体处于一个非正常的、高度浓缩了的群落结构中，为避免所获种类消亡，应在数小时内对其进行分离处理。分离于解剖镜下进行，根据虫体的大小而选用不同口径的微吸管将所需虫体挑选至已备好的培养皿或多孔凹玻片内对于虫体数量不多时推荐使用后者。当用多孔凹玻片分离虫体时，为防止干涸，分离后的玻片应置于潮湿房内9。分离后应立即对分离的标本进行编号，通常采用的编号方法为年月日序号如20113151，同时还应在同一张记录
23、纸上记录采集人、采集地及主要生境特征如温度、盐度等等。如不能立刻分离，则建议加培养水粗培养采用的培养水为原位水，即采样时用洁净采样瓶在采样点采集的干净海水；纯培养及克隆培养采用的培养水为经过过滤、煮沸20MIN，冷却、充气30MIN的海水或清洁水至样品内至少等量加以稀释，并置于低于原水环境510的培养箱内保存但此保存期不应超过24H。分离后，从次日起应每日对所分离的虫体进行检查，以了解其存活情况，同时在必要时进行剔除杂质及其他混入生物、转移培养水体、补充饵料或进一步分离纯化等操作。分离后的原始水样应力求较长时间地保存，目的在于发现其他数量较少而尚未被发现的种类，故也应每日镜检12次，对此水样在
24、必要时应做稀释如高污染或过富水样或适当的降温处理如原来水体如此27。43培养本实验采用粗培养方式进行培养，即直接吸取原采集样入培养皿中，置于解剖镜下去除大型后生动物某些后生动物会捕食纤毛虫使所获种类消亡及多余的沉积物，加适量米粒或切开的小麦以致富细菌水较富时也可不加。通常可每日镜检12次，以清除某些快速繁殖而不欲保留的种类，并每日更新约半量的培养水28。44活体观察活体观察在纤毛虫形态学研究中占有重要的地位，以此可以快速地鉴定纤毛虫所属的大类群。通过活体观察可以获取纤毛虫活体细胞大小、外形、运动、纤毛器、伸缩泡、食物泡、内质颗粒及射出体等一些经银染后无法获得的分类学特征因为许多重要的形态学特征
25、在染色后难以发现或消失9。但活体观察对经验要求较高，且无法获得大多数纤毛器和纤毛图式等方面的细节，故纤毛虫形态的全面描述需通过活体观察与银染法两种方法的结合才能进行。具体步骤在解剖镜下用无毒的毛细吸管吸一小滴虫体液量尽可能小，以将盖玻片压至极限而水不至于从四边溢出为度；若液量过多可于解剖镜下边观察边吸走多余的水分，但应注意不可将虫体吸走，然后置于载玻片上，加盖玻片四周涂少许凡士林以避免直接压在虫体上；先在低倍镜10X物镜下测量应至少选取大、中、小三个不同个体以得到虫体变幅的信息，观察并记录虫体的大小、外形尤其应注意个体间的外形差异，同一个体之外形变化以及同一虫体之具体不同部位的变化特征、运动特
26、征主要包括虫体运动特征，纤毛器的运动特征，游泳的体位变化；然后于中倍镜20X物镜、40X物镜下观察轻压盖玻片至虫体略微变形但仍可运动，并记录纤毛及纤毛器长度，分布和排列特征等，伸缩泡位置/数目以及形成过程，排空间歇时间，有无收集管等、内质情况有无特殊的油球、空泡、结晶体、食物泡数目/分布特征等、色素体的有无及体色；最后可于油镜100X物镜下观察轻压盖玻片至虫体完全无法运动为止，此时应特别注意细胞的表膜结构、纤毛特征、射出体的有无/分布/形态、伸缩泡的形成及变化过程、食物泡和内质/表膜下颗粒分布特点等分类学特征29。活体观察采用的显微镜为光学显微镜，必要时也可采用微分干涉显微镜，需边观察边拍照。
27、45蛋白银染色蛋白银染色技术最早为一组织染色法，经过几十年来不断的改进，现已成为纤毛虫纤毛图式显示的最重要和最基本的方法。本方法对大部分纤毛虫的染色效果极佳，但对于咽膜类、肾形类及篮环目等类群则常常不够理想。此法主要用以显示虫体的皮层及内部结构，如纤毛下器、毛基体、核器及各种表膜下纤维5系统等，而银线系统则不被染色。优点为用时少、操作较简便、能稳定地得到较高质量的永久封片，缺点为对经验和操作技术依赖较大30。具体步骤9,29于解剖镜下进行1用微吸管将虫体从培养皿吸至含有BOUIN液主要用作指示剂及饱和升汞HGCL2的胚胎皿中，固定510MIN，此时可轻轻摇晃胚胎皿将虫体聚集在一起；2蒸馏水洗3
28、4次BOUIN液以水洗至无色为准，水洗时应用普通大口吸管环绕胚胎皿凹槽四周小心地滴入蒸馏水，以免冲散虫体；3确保虫体位于胚胎皿中心，若未置于中心则以最细微吸管小心将虫体“吹”至胚胎皿中心；4用微吸管吸取0102的次氯酸钠NACLO或次氯酸钾KCLO微量直接供至虫体处以漂白至“透明”约12MIN。可先在洁净的培养皿中滴入2滴漂白液，1滴加蒸馏水稀释，剩余的1滴不作任何处理，首先用稀释的漂白液漂白，若漂白不足则用未稀释的漂白液漂白；5蒸馏水洗24次以清洗完全为度，清洗方法同步骤2；6滴加蛋白银于胚胎皿中，将胚胎皿中的蛋白银浓度控制在约05，加盖后于90的加热板上加热3050MIN视不同种类的嗜染状
29、况及虫体大小而调整时间；7室温下用0102的显影液显影15MIN或更短；8镜检后用5的硫代硫酸钠NA2S2O3定影约5MIN；9蒸馏水洗一次此时应清洁虫体，将虫体转入已涂有等量蛋白胶的载玻片上，混匀，用眉毛笔调体位在必要时，如需腹面朝上等，除去余液，至加热板上烘片约10MIN；10常规脱水封片脱水本实验采用的脱水剂为酒精脱水能力强、穿透速度快，但会使标本明显收缩，从70酒精起809095100100，依次脱水，以上过程每步约25MIN，其中在无水酒精中每步应不少于5MIN，以确保彻底脱水水与二甲苯相遇会产生白雾，使标本混浊不清，不易观察，具体的脱水时间随标本大小及其所含的水分多少而定。透明本实
30、验采用的透明剂为二甲苯，无水酒精和二甲苯11的混合液可避免标本收缩及脱水不净的弊病二甲苯二甲苯，以上过程每步约25MIN。封片透明完毕后应立即取出标本，滴加适量树胶，盖上盖玻片。染色时应注意1虫体漂白时应掌握好时机，漂白过度则虫体不易甚至无法着色，过轻则虫体着色过重，结构不易观察；2加入的蛋白银应适量，量较少时可通过补加蛋白银或高温显影得到补救，量较多时则难以补救；3显影后往往数秒即可使虫体显色过度，因此应通过镜检把握好定影时机。5结果与讨论结合上述活体观察及蛋白银染色所获得的数据，查阅以往资料，发现总共分离得到两种纤毛虫，它们均隶属于多膜纲腹毛目，分别被称为多核拟双棘虫、盾片异列虫。51多核
31、拟双棘虫PARABIROJIMIAMULTINUCLEATE511形态描述虫体细长带状，易弯曲，活体大小通常约为30050M，长宽比为561；背腹扁平，厚幅比为32图1B。虫体最宽处位于体前的1/4处，向后逐渐变窄图1A,D和2A,B。口区约占体长的10。口围带AZM分成两部分，末端向后弯曲至右侧形成一个沿顶端右边缘的不显眼的沟。表膜薄且柔韧。皮质颗粒有两种类型类型无色细小，直径为02M，在背面稀疏排列图1C和2G；类型梭形，大小约为215M，在高倍镜下观察时呈浅灰色，分布稀疏并且数量少，因此从未将细胞染成任何颜色图1C和2F。细胞质不透明，无色，通常由于虫体中部含有直径为820M的食物泡和其
32、他内容物而导致虫体呈暗灰色或黑色图1A和2A,C，常含有大量直径为23M的光源反射球。约含有50个大核，长椭圆形，在活体中很难观察图1G和2H,I。6到12个球形小核，每个直径约为3M图1G和2I,K。在基质碎片间或培养皿底部不停顿地缓慢爬行运动，显得非常灵活。6口围带的两部分具有巨大的差异前部的口围带小膜基部明显的短于后部图1E,F和2E。前部的纤毛长约20M，但是后部的纤毛较短。口侧膜和口内膜的长度几乎相等，略微弯曲且明显交叉图1E,F。所有的棘毛相对较细，通常长约10M，每个棘毛基部由两列毛基粒组成；横棘毛长约15M。恒定的3根稍粗大的额棘毛，每个长约20M，与中腹棘毛对相连；单个口棘毛
33、位于波动膜交叉点附近图1E,F；中腹棘毛复合体由5个棘毛对和55个棘毛1个中腹棘毛列组成，并延伸到体长的65处；611根不显眼的横棘毛，略微超过虫体尾端边缘图1F和2A,K。1个左缘棘毛列LMR和5个右缘棘毛列RMR；右缘棘毛列从顶端右边缘倾斜到尾端左边缘；最左边的2个或3个右缘棘毛列向后缩短图1F,G。3个完整的背部动基列，背部纤毛长约5M图1G和2J。512讨论与比较过去拟双棘虫属PARABIROJIMIA是一个单种属，仅有相似拟双棘虫PSIMILS一个种。该种与相似拟双棘虫的不同之处在于大核的数目4370VS36，前端区域没有鸟喙状突起VS相似拟双棘虫的前端区域存在鸟喙状突起，恒定的5个
34、右缘棘毛列VS相似拟双棘虫中右缘棘毛列数为58个，腹棘毛数4469VS2745，口围带小膜数平均为524VS467，左缘棘毛数平均为767VS613表2,3图1A,F和4A,B。此外，多核拟双棘虫中含有相似拟双棘虫所缺少的两种类型的皮质颗粒31。根据活体形态如体形、大小、大核数目、细胞颜色等和纤毛图式的基本模式如1个左缘棘毛列和2个或2个以上的右缘棘毛列，发现多核拟双棘虫的形态与苔藓双棘虫BIROJIMIAMUSCORUM和土壤双棘虫BTERRICOLA这2种纤毛虫的形态相似32。但是，苔藓双棘虫与多核拟双棘虫的不同之处在于生境土壤VS海洋，具尾棘毛VS多核拟双棘虫无尾棘毛，中腹棘毛对数CA1
35、1VSCA5，组成中腹棘毛列的棘毛数CA7VSCA55，口围带小膜数2632VS4660，右缘棘毛列数2VS5，横棘毛数24VS611表3。同样地，多核拟双棘虫与土壤双棘虫的不同之处在于土壤双棘虫通常有26个右缘棘毛列VS多核拟双棘虫中右缘棘毛列数为恒定的5个，2根额前棘毛VS多核拟双棘虫无额前棘毛，27根尾棘毛VS多核拟双棘虫无尾棘毛，无中腹棘毛列VS多核拟双棘虫中中腹棘毛列由4469根棘毛组成，中腹棘毛对数CA13VSCA5及生境为土壤VS多核拟双棘虫的生境为海洋表3。52盾片异列虫ANTEHOLOSTICHASCUTELLUM521形态描述虫体高度柔韧，刺激时略微收缩，活体大小为5075
36、2030M，通常外形为椭圆形，长宽比为2251图3A,FH，背腹扁平，约31图3B,K。口区约占体长的2535。皮质颗粒可能是射出体球形且无色，直径约为1M，在背面不规则地分散图3C,O。在蛋白银染色标本中，观察到的23M长的刺状物是由这些颗粒射出的图3E,M,N。细胞质无色至浅灰色，含有少数颗粒2M和许多食物泡直径为5M。大约有60个椭圆形的大核，在活体中很难观察图3E,L,M。2个小核在一些标本中很容易就能辨认出来图3E,M。在基质中以相对快地速度爬行运动，无特别之处。纤毛图式如图3D所示。口围带平滑弯曲，由17或18片小膜组成，小膜纤毛长约8M。波动膜几乎平行，平直或稍弯曲图3D,L。3
37、根粗大的额棘毛FC,图3D。1根口棘毛BC接近波动膜的顶末端图3D。2根额前棘毛FTC位于口围带末端与右缘棘毛列RMR顶末端之间图3D。中腹棘毛复合体MVC由6或7对棘毛组成，并终止于细胞中部图3D。8根粗壮的横棘毛TC呈“U”字形排列图3D；2根横前棘毛PTC位于横棘毛与中腹棘毛列之间图3D。左缘棘毛列和右缘棘毛列都由15根棘毛组成图3D。背部动基列DK延伸至整个虫体，背部纤毛分布稀疏，在活体中长约3M图3E。522讨论与比较盾片异列虫首次被COHN于1866年作为盾片尖毛虫OXYTRICHASCUTELLUM描述。原始的描述内未包含关于纤毛图式和核器的数据，因为虫体内含有灰黑色的颗粒和许多
38、其他胞质内容物，从而在活体观察时，虫体通常不透明图4C,D。KAHL1932,1933为该种提供了一个简短但意义重大的描述当时该种被他称为盾片全列虫HOLOSTICHASCUTELLUM活体长为60120M，通常外形为椭圆形，拥有许多大核，2个明显的小核，3根略粗大的额棘7毛，中腹棘毛复合体由棘毛对组成，2根额前棘毛，7或8根横棘毛，无尾棘毛图4E,F。BERGER2003重新定义了全列虫属HOLOSTICHA33，并因该种具有连续的口围带及无尾棘毛将其移到了异列虫属ANTEHOLOSTICHA。根据活体特征，我们分离得到的有机体完全符合COHN1866和KAHL1932,1933的描述，因此
39、该鉴定毋庸置疑。ENTZ1884说明和描述了一个被他称为盾片全列虫的形态2个椭圆形的大核，每个大核伴随1个小核；711根极发达的横棘毛，呈月牙形排列；2个腹棘毛列从前端附近延伸到横棘毛右侧；1个伸缩泡位于虫体左侧中间图4H。BERGER2006指出，该种的形态与紧缩全列虫HOLOSTICHADIADEMATA34非常相似，因此它可能是ENTZ1884实际观察到的一个种群，而不是盾片异列虫。MANSFELD1923也描述了盾片全列虫的形态，有许多大核和810根横棘毛呈“J”字形排列。但是，根据MANSFELD的说明，该有机体比KAHL1932,1933种群有一个宽的口围带、许多缘棘毛和中腹棘毛对
40、图4G。因此，我们推断MANSFELD1923观察到的是另一个种群，而不是盾片异列虫。根据虫体大小、大核数目、纤毛图式的基本模式和海洋生境，发现两种异列虫与盾片异列虫相似沃伦异列虫AWARRENI和柔弱异列虫AMANCA。它们共有的特征是1个连续的口围带，1个中腹棘毛列且呈典型的ZIGZAG模式，明显粗大的额棘毛，无尾棘毛。但是，沃伦异列虫35与盾片异列虫的不同之处在于口围带小膜数2631VS1718，中腹棘毛对数79VS67，横棘毛数CA11VSCA8，左缘棘毛数2227VSCA14和右缘棘毛数2126VSCA15。另外，沃伦异列虫拥有直径大小为2M的皮质颗粒VSCA1M，椭圆形且中间凹陷V
41、S球形，在背部呈3列稀疏排列VS在背部随意分散表4,图4JL。BORROR和WICKLOW1983对盾片异列虫的形态作了一个详细的描述。标本说明了约有34片口围带小膜、30个右缘棘毛和34个左缘棘毛图4I。因此，它可能是BORROR和WICKLOW1983所观察到的沃伦异列虫的种群，而不是盾片异列虫的。柔弱异列虫36与盾片异列虫的区别是虫体的体形梭形VS椭圆形，皮质颗粒的排列不规则地排列成行VS随意分散，口围带小膜数，额棘毛数，额前棘毛数，中腹棘毛数，横棘毛数，左缘棘毛数和右缘棘毛数表4图4MO。砂隙异列虫ANTEHOLOSTICHAARENICOLA与盾片异列虫的相似之处在于虫体大小及形状、
42、海洋生境和一些形态特征如小膜数、额棘毛数、横棘毛数、左缘棘毛数及右缘棘毛数。但是，沙隙异列虫与盾片异列虫的明显区别是前者有2个大核，而后者则有4290个大核表4。WILBERT和SONG2005描述了来自南极乔治王岛的全列虫新种HOLOSTICHASP。不幸的是，只有少数经蛋白银染色的个体能被观察，没有来自活体观察的数据。尽管如此，该新种可能是盾片异列虫的一个种群，因为将二者比较发现它们具有相同数目的口围带小膜、额棘毛、额前棘毛、口棘毛和左缘棘毛，且中腹棘毛对数3或4VS6或7、右缘棘毛数17VS15、背部动基列数4VS3和大核数目30VS60相似表4图4PQ。8图1多核拟双棘虫AD及其经蛋白
43、银染色后的图形EG。A典型个体的腹面观；B侧面观；C背面观，显示了微小的皮质颗粒及无规则形的大颗粒箭头；D虫体形态的变化说明了虫体高度灵活的特性；E虫体顶端的腹面观纤毛图式；F,G腹面F及背面G所显示的纤毛图式，F中的箭头表示横棘毛，G中的短箭头表示小核。AZM口围带；BC口棘毛；DK背部动基列；E口内膜；FC额棘毛；FM顶端口围带小膜；LMC左缘棘毛；LMR左缘棘毛列；MA大核；MVC中腹棘毛；P口侧膜；RMC右缘棘毛；RMR右缘棘毛列；VM腹部口围带小膜；VR腹棘毛列。比例尺100M。图2多核拟双棘虫活体AD,F,G及其经蛋白银染色后E,HK的显微照片。A典型个体的腹面观；B一个细长个体；
44、C,D虫体顶端的腹面观，D中短箭头表示额棘毛；E口区的纤毛图式；F,G背面观，F中的短箭头表示梭形颗粒及G中的箭头表示微小的皮质颗粒；H腹面观的纤毛图式；I大核及小核短箭头；J背部动基列；K虫体的尾部，箭头表示横棘毛，短箭头表示小核。比例尺AC,H100M，D,E,J,K50M，F,G,I10M。9图3盾片异列虫活体AC,FK,O及其经蛋白银染色后D,E,LN的图形。A典型个体的腹面观；B,K侧面观；C背面观，显示了球形的皮质颗粒，呈不规则排列；D,E,L,M腹面观D,L,M及背面观E所示的纤毛图式，E中的短箭头表示小核；FJ显示体形的变化；N背面观，短箭头表示背部动基列，箭头表示射出体；O背
45、面观，显示了球形的皮质颗粒，呈不规则排列。AZM口围带；BC口棘毛；DK背部动基列；E口内膜；EX射出体；FC额棘毛；FTC额前棘毛；LMC左缘棘毛；MA大核；MVC中腹棘毛；P口侧膜；PTC横前棘毛；RMC右缘棘毛；TC横棘毛。比例尺25M。图4一些以前报道的物种形态。A,B相似拟双棘虫来自HUETAL,2002；CI盾片异列虫C,D来自COHN,1866；E来自KAHL,1933；F来自KAHL,1932；G来自MANSFELD,1923；H来自ENTZ,1884；I来自BORRORSCUTICOCILIATIDAJEUROPEANJOURNALOFPROTISTOLOGY,2007,43
46、10111423陈总会,肖宝华,黄志斌等海水养殖鱼类主要纤毛虫病及其防治方法J水产科技情报,2007,342949624张芹浙闽大黄鱼群体RAPD遗传学研究D浙江浙江大学,200525张祖兴,李明云大黄鱼种质资源研究进展J水产科学,2006,25737637826尹春跃对大黄鱼濒临绝迹的原因追述以及未来的努力J生物学教学,2000,2511454627齐桂兰,刘桂杰常见原生动物纤毛虫的采集、分离与培养J生物学教学,2008,337383928宋碧玉原生动物及其研究方法J生物学通报,2000,351141629宋微波,徐奎栋纤毛虫原生动物形态学研究的常用方法J海洋科学,1994,66930庞延斌
47、,顾福康,邹士法应用于腹毛类纤毛虫的一种改进的蛋白银染色方法J华东师范大学学报自然科学版,1983,4879331宋微波,A沃伦,胡晓钟中国黄渤海的自由生纤毛虫M北京科学出版社,200939339432施心路下毛目纤毛虫的系统修订尾柱亚目纤毛动物J动物分类学报,1999,24436137133王艳刚海洋纤毛虫的多样性研究盾纤类、膜口类及腹毛类D山东中国海洋大学,200934崔伏莲,刘炜炜,林晓凤等广东大亚湾七种腹毛类纤毛虫原生动物,纤毛门的形态学研究J动物分类学报,2009,34233533935李俐琼腹毛目纤毛虫的细胞发生学研究D山东中国海洋大学,200936姜佳枚,邵晨,李俐琼等青岛沿海七种腹毛类纤毛虫的形态学研究原生动物,纤毛门J动物分类学报,2008,331115119
