1、毕业论文文献综述生物工程弧菌分类及常用鉴定方法的研究进展摘要随着人们对于弧菌的认识需不断深入，必需对其建立一个稳定的实用的分类鉴定系统。常用的分类鉴定方法有表型特征分类鉴定、遗传型分类鉴定等，但他们都存在一定的弊端。本文就弧菌分类、分类鉴定的常用方法以及分类鉴定的新进展进行了综述。关键词弧菌溶藻弧菌16SRRNA分类鉴定弧菌属（VIBRIO）隶属于变形杆菌纲弧菌科，是菌体短小的革兰氏阴性菌，体长约0515微米，通常呈运动杆状、直或弯曲成杆状，嗜温，化能有机营养型，也可以进行兼性厌氧发酵，一般可以在海水琼脂及选择性培养基TCBS上生长，大多数氧化酶活性阳性1。弧菌在水生环境中分布广泛，与真核生物
2、（如鱼、虾、人等）有密切的关系。某些弧菌是重要的水产养殖动物的病原菌，有些还是人类的致病菌，严重的甚至致人死亡。然而，除了作为病原菌，弧菌在生态环境中也具有不可取代的作用。弧菌可以吸收溶解的有机物质，从而对水环境中的营养循环起作用；某些弧菌可以分解几丁质，增加了氨基糖的来源；还有的弧菌可以降解多元环芳香烃以及产抗生素等等。溶藻弧菌VIBRIOALGINOLYTICUS属于弧菌属，无芽孢、荚膜，单独存在或尾端相连，为嗜盐嗜温性、兼性厌氧的海生弧菌2。以前被认为是副溶血弧菌的生物型，1974年伯杰氏细菌鉴定手册中将它列为副溶血弧菌型，后证实两者的DNA中GC含量不同，1984版把它从副溶血弧菌中划
3、分出来，成为一个独立的种3。溶藻弧菌广泛分布于世界各地海水及河口处4，数量居海水类弧菌之首5，是鱼、虾、贝等海水养殖动物的条件致病菌。溶藻弧菌为嗜温菌，从夏季到冬季，由赤道向两极随着温度的降低其数量也明显减少6，其对养殖动物的致病性也多发生在夏季7。此外，溶藻弧菌对人的致病性也有大量报道,可引起人食物中毒，可经创面感染人体引起蜂窝组织炎、中耳炎，甚至引起败血症等肠道外感染8。1弧菌的分类从1854年，意大利医师FILIPPOPACINI发现第一种弧菌开始到2002年，弧菌种类已增加至47种，而且每年都有新的弧菌被发现及鉴定，弧菌属所包括的种类也会越来越多。2004年，THOMPSON等通过16
4、SRRNA，RECA与RPOA基因序列分析，将弧菌划分为4个科，即SALINIVIBRIOACEAE，ENTEROVIBRIOACEAE，PHOTOBACTERIACEAE，VIBRIONACEAE。VIBRIONACEAE只包含弧菌属这一个属，属中包括除了VFISCHERI群之外所有的63种弧菌。其中，通过对16SRRNA，23SRRNA，RECA，GYRB等进行序列分析及表型分析显示，VCHOLERAE和VMIMICUS应当列入属的行列，但是这两个却是弧菌属的成员。同时有人表示，弧菌属是一个独立的系统发育群，可以提升至科的行列来进行研究。像这样的问题仍有待进一步研究讨论9。随着弧菌数量不断
5、增多，人们对于弧菌的认识需不断深入，必需对其进行系统的分类鉴定。因此建立一个稳定的实用的分类鉴定系统是当务之急。2弧菌基因的分子鉴定核糖体RNA（RRNA）分子存在于所有细胞生物中，RRNA基因与细菌整个基因组的变化相比，有高度的保守性。其本身的进化就反映了生物系统发育历史，因此可以用来重现所有细胞生物间的进化关系10。另外，由于其在细菌染色体上存在多个拷贝，现已作为标记基因广泛应用于细菌分类学和细菌的分子流行病学研究中。分类学历史上5S，16S，23SRRNA基因都曾用于细菌包括弧菌的分类鉴定中，它们是系统发育研究的标志分子，被称为“分子计时器”11。其中16SRRNA基因序列的应用最普遍，
6、由于16SRRNA基因核苷酸序列总长度适宜，结构完整，利用16SRRNA基因分析，不仅速度快，而其精度更高，适于分析大量弧菌的种群变化规律研究12,13。将样本中16SRRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16SRRNA序列信息，再与16SRRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较，确定其在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类14。然而，16SRRNA基因在弧菌的分类鉴定中却存在一定的问题，我们可以借助于16SRRNA基因的测序及比对分析，将弧菌鉴定到属乃至科的水平，但鉴定至种的水平就存在一定难度，因为在弧菌科中，16SRRNA序列的相似性高达976以上，有些弧
7、菌种之间的相似度甚至接近10015,16。因此，我们必须寻找新的用于鉴定的标志分子来增强我们对于弧菌分类的认识。其他已被使用过的标志分子有HSP60，GYRB17,18，RECA19,20，RPOA，RPOB，ATPA，等等。3弧菌常用鉴定方法1970年，COLWELL提出了多项分类的概念，这一概念的提出极大推动了分类学的发展。多项分类鉴定技术主要围绕表型特征、遗传学特征这两方面的信息建立的9。31表型特征分类鉴定对于弧菌的比较传统的分类鉴定方法就是表特征鉴定法，其表性特征包括形态学特征21、生理生化特征22、抗生素的敏感性、噬菌体分型、血清学分析、蛋白质分析等。其中，生理生化特征测定法是经常
8、用来鉴定弧菌的实验方法，某些实验室把该方法当作早期弧菌鉴定的特别方法23。表型特征分类鉴定在早期的弧菌分类鉴定中起到了不可替代的作用。然而随着被发现的弧菌的越来越多，单纯靠表型特征分类鉴定已经越来越困难。这就为我们的进一步研究造成阻碍。32遗传型分类鉴定在过去的几十年中，出现了一系列基于弧菌的遗传信息而进行的分类鉴定技术，这些技术中常用的主要有DDHDNADNAHYBRIDIZATION，AFLP（AMPLIFIEDFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM），REPPCR（REPETITIVEEXTRAGENICPALINDROMEPCR），微阵列技术（MICROARRAYS），M
9、LSTMULTILOCUSSEQUENCETYPING等等24,25，而最为常用且可靠性也高的有DDH，AFLP，REPPCR。相比传统的表型特征，遗传型分类鉴定更可靠，但由于实验起来比较繁复，又不能通过因特网建立信息库，因此仅局限于世界上几个实验室在使用，实在不是既实用又可以普及的分类鉴定方法。4多基因位点序列分析法（MLSA，MULTILOCUSSEQUENCEANALYSIS）由于16SRRNA基因无法将弧菌鉴定至种或者株的水平，因此我们寻找了新的标志分子来增强我们对于弧菌系统发育和分类的认识26。然而，仅依靠单个基因并不能代表整个基因组的可比性，因为单一基因可能会因多种外界因素而受到影
10、响。2002年，细菌菌种定义复评特别委员会达成了一项共识，即至少要对存在于染色体上的多个位点中的五个基因进行分析，才能得到足够的信息将一株细菌划分至种的水平，这种方法即为MLSA9。近年来MLSA的出现给弧菌的分类鉴定提供了一种更方便更实用的方法。其相对方便快速，经济上也较节约，后续的序列比对分析等也都可以在互联网上免费完成。现在的一种趋势是对核心基因组中的多个管家基因进行测序及系统发育学分析等，以达到对弧菌分类鉴定的目的。通过实验不难看出，几个基因的综合分析会使分类鉴定更加准确27。参考文献1东秀珠,蔡妙英常见细菌系统鉴定手册M北京科学出版社20011061282STEFANH,HELMUT
11、W,KARINNB,ETALISOLATIONOFVIBRIOALGINOLYTICUSFROMSEAWATERAQUARIAJINTJHYGENVIRONHEALTH,2000,20316921753周洪彦,梁冬医学相关弧菌的分类及鉴定进展综述J中国食品卫生杂志,2002,247494KANEKOT,COLWELLRRECOLOGYOFVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSANDRELATEDORGANISMSINTHEATLANTICOCEANOFFSOUTHCAROLINAANDGEORGIAJAPPLMICROBIOL,1973,281009210175林业杰,陈亢川,陈拱立,等
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16、198628429622THOMPSONFL,KLOSEKEVIBRIOTHEFIRSTINTERNATIONALCONFERENCEONTHEBIOLOGYOFVIBRIOSJBACTERIOL2005,188134592459623马筱玲,陈学民,黄尊波细菌鉴定中鉴别试验的选择方法J陕西医学检验2000,1531224李琳,李槿年,余为一细菌分类鉴定方法的研究概况J安徽农业科学,2004,32354955125焦振泉,刘秀梅细菌分类鉴定的分子生物学方法研究进展J国外医学卫生学分册,1996,635636126LINKOUSDA,OLIVERJDPATHOGENISISOFVIBRIOVULNIFWUAMINIREVIEWJFEMSMICROBIOLLETTERS1999,1741620721327谢庶洁一簇海洋放线菌的MLSA分析及其DNA降解现象的研究D厦门大学,2009
