1、毕业论文文献综述生物工程弧菌分类鉴定的进展摘要弧菌是一类水生环境中广泛存在的革兰氏阴性菌，是很多生物体的致病菌。随着分子生物学的发展，弧菌分类鉴定的方法越来越多，也越来越深入，本文通过对现有的弧菌的分类鉴定方法进行罗列总结并提出了弧菌分类鉴定方法的发展方向。关键字弧菌；16SRRNA；MLSA；全基因组序列；序列分析；分类1弧菌简介弧菌是一类广泛分布于自然界，尤以水生为多的革兰氏阴性菌。弧菌科（VIBRIONASEAE）大多数为氧化酶阳性，有端鞭毛、动力阳性。弧菌属（VIBRIO）分解葡萄糖，产酸不产气，对弧菌抑制剂O/129（二氨基二异丙基喋啶）敏感。由意大利人FILIPPOPACINI发现
2、第一种弧菌以来，至今已超过74种弧菌被发现1。某些弧菌是人及水产动物的致病菌。如副溶血性弧菌（VIBRIOPARAHAEMOLYTICUS）、河弧菌VIBRIOFLUVIALIS等能引起食物中毒；鳗弧菌VIBRIOANGUILLARUM、鲑弧菌VIBRIOSALMONICIDA、哈维氏弧菌（VIBRIOHARVEYI）等是某些水产养殖动物的病原菌；霍乱弧菌（VIBRIOCHOLERAE）中的O1群古典生物型CLASSICALBIOTYPE，CVC、埃尔托生物型ELTORBIOTYPE，EVC和O139群VC能引起慢性腹泻疾病或造成局域性流行2。霍乱弧菌的潜伏期一般12天，短的数小时，长的56天
3、。霍乱弧菌干燥2H或加热55LOMIN即死亡，煮沸立即死亡3。弧菌的致病过程包括黏附、侵袭、体内增殖及产生毒素等，这与弧菌产生的毒力因子有关。目前发现的弧菌毒力因子有外毒素EXOTOXIN、蛋白酶PROTEASE、荚膜CAPSULE、载铁体SIDEROPHORE及外膜蛋白OUTERMEMBRANEPROTEIN，OMP等4。某些海洋弧菌（如VIBRIOPACINI）可产几丁质酶5，进而分解几丁质增加海洋中氨基糖的来源。还有的弧菌能产抗生素，降解多元环芳香烃以及为某些水生生物提供多不饱和脂肪酸。2弧菌的分类鉴定根据伯杰氏系统细菌学手册（第二版，2004年），弧菌属于变形菌纲，弧菌科有8个属，弧菌
4、属包括51个种。2003年，THOMPSON等通过16SRRNA序列和表型特征分析把弧菌分为3个科。2004年，THOMPSON等通过16SRRNA，RECA与RPOA基因序列分析把弧菌分为4个科（SALINIVIBRIOACEAE，ENTEROVIBRIOACEAE，PHOTOBACTERIACEAE，VIBRIONACEAE）6。其中VIBRIONACEAE只有一个含63种弧菌的弧菌属。微生物分类鉴定方法主要有4种在表型特征水平上，通过观察微生物的形态特征、运动性、酶反应、营养要求、生长条件、代谢特性、致病性、抗原性和生态学特性等进行鉴定的方法；在细胞组分水平上，对细胞壁、脂类、醌类和光合
5、色素等的鉴定；在蛋白质水平上，有氨基酸序列分析、凝胶电泳和各种免疫标记技术等；在核酸水平上，包括GCMOL值的测定，核酸分子杂交，16S或18SRRNA寡核苷酸序列分析，重要基因序列分析和全基因组测序等7。21表型特征分类鉴定目前主要使用增菌液和选择性培养基分离检测弧菌。根据巫结冰等人实验发现使用CV培养基（科玛嘉弧菌显色培养基）可同时对海水产品进行多种弧菌的检测8，另外也可以用无营养盐的海水双层琼脂平板法9及选择性培养基TCBS（硫代硫酸钠柠檬酸胆盐蔗糖培养基）进行检测1011。22分子水平上的分类鉴定在对弧菌的分类鉴定上，可采用API20E和BIOLOGGN等生理生化标准鉴定系统进行鉴定；
6、也可采用DNADNA杂交DNADNAHYBRIDIZATION,DDH12，RFLP（RANDOMFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM，微阵列技术（MICROARRAY），长度多态性AMPLIFIEDFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM，AFLP，基因外重复回文系列PCR（REPETITIVEEXTRAGENICPALINDROMEPCR，REPPCR）13，多位点酶电泳法MULTILOCUSENZYMEELECTROPHORESIS，MLEE，多位点序列分析（MULTILOCUSSEQUENCETYPING，MLST，多重PCR（MULTIPLEXPC）14等
7、在分子水平上进行鉴定。DDH在弧菌分类学中只有当DNADNA的相似性高于80时，才会被定义为相同的种，但是每次新实验都需要选择标准菌株。微阵列MICROARMY是指将许多特定的寡核苷酸探针有规律地排列固定于支持物如膜、硅片及玻片上，然后与待测的标记样品按碱基配对原理进行杂交，再通过检测系统对其进行扫描，进行基因的高通量、大规模、平行化、集约化的信息处理和功能研究15。MLEE于19世纪80年代开始被应用于细菌分型，是根据一个基因一种酶的学说，编码酶的染色体结构基因的多态性也表现为酶的多态性，通过对酶分子量和电荷的变异情况，推算其对应的基因位点的多态性，并经过多个酶基因的位点的综合分析，获得细菌
8、的基因型。MLST是通过对管家基因直接进行测序比较对细菌进行分型，该法具有分辨率高、序列数据明确可靠、数据重复性好、结果便于实验室之间交流比较、数据库构建和管理方便等优点16。MLEE检测的是整个编码基因的活性，而MLST分析时往往只对某个基因的一部分进行测序分析。MLSA（MULTILOCUSSEQUENCEANALYSIS）是在MLST基础上发展而来，通过对多个编码蛋白基因的测序鉴定弧菌。另外，用超级树（SUPERTREE）的方法也具有极高的可信度。AFLP是在RAPD和RFLP基础上发展起来的，起初使用放射性物质标记的引物，现在多使用荧光标记的引物。通过对基因组DNA双酶切后的限制性片段
9、进行选择性扩增，再对扩增片段电泳后形成的图谱进行比较，在基因组水平揭示细菌之间的多样性。AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记，具有覆盖面广、高保真性、高效性、高分辨率、DNA用量少、事先勿需知道序列任何信息、可在全基因组产生标记、标记的分离遵循孟德尔遗传规律等优点17。然而这种技术的普及性不是很好，仅限于世界上几个实验室在使用，而且实验室之间指纹带型的比较也是很困难的，成为一种通用的网上可用的电子分类学工具并不容易。REPPCR主要用于扩增基因组中高度重复序列的中间序列，WONG和LIN比较了RAPD、REPPCR与PFGE这三种方法，发现REPPCR具有最高的分辨能力。然而，这项技
10、术不仅只限于世界上几个实验室在使用，而且它也主要应用于对于VIBRIOALGINOLYTICUS，VIBRIOCHOLERAE，VIBRIOVULNIFICUS等菌的鉴定。另外，利用16SRRNA只能对弧菌精确地鉴定至科与属的水平，需结合其他标志分子有HSP60，GYRB，RECA，RPOA，RPOB，ATPA，DNAJ，LUX，TOXR181920等能更精确地鉴定出弧菌。因为弧菌科中16SRRNA的相似性高于976，有些种之间的的相似性甚至达到100。在霍乱弧菌PCR检测方面，CT、ZOT、ACE、SLT、TCP、HLY212223等不同毒素基因用于快速检测产毒素的霍乱弧菌；外膜蛋白基因OM
11、PW用以检测各种霍乱弧菌24。而郭春雷等人25对几株栖热菌属THERMUS的菌株和该属一些有效发表种进行了基于16SRRNA的部分区段的二级结构比较分析，利用内环、内环与发卡环之间碱基对数目以及发卡环的碱基数目区分种间差异，证明16SRRNA二级结构可以用来区分种一级的分类单位。2002年，细菌菌种定义复评特别委员会（ADHOCCOMMITTEEFORREEVALUATIONOFTHESPECIESDEFINITIONINBACTERIA）规定，至少要对其染色体上的五个基因进行分析才能将一株细菌划分至种的水平。总而言之，DDH，FAFLP，REPPCR，MLSA等比传统的表型特征分析更可靠，但
12、是并不能通过因特网建立使许多分类学家可用的信息。3弧菌分类鉴定的发展方向在现有的对弧菌鉴定的方法上，还需要做出很大的努力以期更精确更方便更高效地鉴定弧菌。寻找新的用于精确鉴定弧菌个体间差异的标志分子是一个很重要的方面。而16SRRNA的高级结构的研究极有可能对弧菌的精确鉴定带来新的里程碑。另外，全基因组序列的测定必然会对弧菌的精确分类鉴定带来全新的认识。参考文献1HOFFMANNM,BROWNEW,FENGPCETALPCRBASEDMETHODFORTARGETING16S23SRRNAINTERGENICSPACERREGIONSAMONGVIBRIOSPECIESJBMCMICROBIO
13、LOGY,2010,101902芮勇宇,许锐恒,阚飙等霍乱弧菌主要毒力和管家基因序列分析J中国公共卫生,2006,22131333梁栋,黄秀琴历史上危害严重的传染病病原体J生物学教学,2002,29454554吴后波,潘金培病原弧菌的致病机理J水生生物学报,2003,2744224265余长缨,韩宝芹,李静等海洋弧菌几丁质酶的产酶条件及分离纯化研究J高技术通讯2002,12970736THOMPSONFL,THOMPSONCC,DAWYNDTPETALPHYLOGENYANDMOLECULARIDENTIFICATIONOFVIBRIOSONTHEBASISOFMULTILOCUSSEQUEN
14、CEANALYSISJAPPLIEDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,2005,719510751157周德庆微生物学教程M第二版北京高等教育出版社,20023553568巫结冰,陈德云,胡伟宁等弧菌显色培养基进行多种弧菌分离鉴定的研究J中国卫生检验杂志,2007,178145114529谢群英,房文红,乔振国等海水蛭弧菌分离纯化方法初步研究J海洋渔业,2006,18321121610曹琛,黄金勇,李举鹏等TCBS培养基在虾病防治监测中的应用J水产科学,2003,226464711杜明,张洁TCBS琼脂平板在弧菌培养中的应用评估J医学检验进修杂志,1996,314112焦振全
15、,刘秀梅细菌分类鉴定的分子生物学方法研究进展J国外医学卫生学分册1996,23635636113金莉莉,董雪,王秋雨等副溶血性弧菌重复序列PCR分型研究J微生物学通报,2008,35338939414杜联峰,杨泽,余妍等霍乱弧菌多重PCR检测方法的建立及优化J现代预防医学,2010,371101102,11415刘毅,韩金祥,黄海南等膜微阵列技术的建立及检测细菌条件的优化J临床检验杂志,2003,21422122316王洪敏,柯昌文,潘武滨等2005年广东省临床分离猪链球菌的MLST分子分型研究J南方医科大学学报,2008,28814381441,144517刘静AFLP分子标记的发展及应用J
16、山东农业科学,2010,5101418PASCUALJ,MCARMENMACIN,ARAHALDRETALMULTILOCUSSEQUENCEANALYSISOFTHECENTRALCLADEOFTHEGENUSVIBRIOBYUSING16SRRNA,RECA,PYRH,RPOD,GYRB,RCTBANDTOXRGENESJINTERNATIONALJOURNALOFSYSTEMATICANDEVOLUTIONARYMICROBIOLOGY,2010,6015419THOMPSONFL,BRUNOGOMEZGIL,ANATERESARIBEIROVASCONCELOSETALMULTILOC
17、USSEQUENCEANALYSISREVEALSTHATVIBRIOHARVEYIANDVCAMPBELLIIFORMDISTINCTSPECIESJAPPLIEDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,2007,DOI101128/AEM000200720SERRANOW,AMANNR,RAMONROSSELLOMORAETALEVALUATIONOFTHEUSEOFMULTILOCUSSEQUENCEANALYSISMLSATORESOLVETAXONOMICCONFLICTSWITHINTHEGENUSJMARICHROMATIUMSYSTEMATICANDAPPLIEDM
18、ICROBIOLOGY,2010,33311612121SHIRAIH,NISHIBUCHIM,RAMAMURTHYTETA1POLYMERASECHAINREACTIONFORDETECTIONOFTHECHOLERAENTEROTOXINOPERONOFVIBRIOCHOLERAEJJCLINMICROBIOL,1991,29273022RAMAMURTHYT,POLA,BAGPKETA1DETECTIONOFCHOLERATOXINGENEINSTOOLSPECIMENSBYPOLYMERASECHAINREACTIONCOMPARISIONWITHBEADENZYMELINKEDIMM
19、UNOSORBENTASSAYANDCULTUREMETHODFORLABORATORYDIAGNOSISOFCHOLERAJJCLINMIEROBIOL,1993,313623DZIEJMANM,BAKONE,BOYDDETA1COMPARATIVEGENOMICANALYSISOFVIBRIOCHOLERAECHOLERAEGENESTHATCORRELATEWITHCHOLERAENDEMICANDPANDEMICDISEASEJPROCNATLACADSCIUSA,2002,316618124SWESWARN,RANJANKKN,SARMISHTHMETA1RAPIDMETHODFORSPECIESSPECIFICIDENTIFICATIONOFVIBRIOCHOLERAEUSINGPRIMEMTARGETEDTOTHEGENEOFOUTERMEMBRANEPROTEINOMPWJJCLINMICRO,2000,3814515125GUOCL,WANGT,PENGQETA1THEPHYLOTYPEOFTHERMUSFROMTHEREHAIGEOTHERMALAREA,TENGCHONG,CHINAJTHEJOUMALOFMICROBIOLOGY,2003,412152156
