1、1毕业论文文献综述生物技术四膜虫在毒理学中的研究摘要四膜虫TETRAHYMENA是毒理学研究的良好模式生物，本文回顾并总结了以四膜虫为生物模型的毒理学研究，对通过进行各种环境化学毒物胁迫下四膜虫的群体生长动力，形态结构，酶的活性、DNA的损伤以及基因的表达等特性的变化来研究毒物毒性进行了综述。关键词四膜虫；毒性评价；QSAR；DNA损伤1引言四膜虫TETRAHYMENA是原生生物门PROTISTA纤毛虫纲CILIOPHORA的一种单细胞真核生物，主要分布于淡水水域中。其显著特点是具有核双型现象NUCLEARDIMORPHISM1。然而一直以来四膜虫的社会认知度和关注度却远不如其他真核模式生物。
2、事实上它离我们并不遥远，只是因为它如针尖大小，不被我们注意。四膜虫为生命科学的研究作出了巨大的贡献。1989年切赫教授就是因在四膜虫中发现核酶而获得当年化学奖，而伊莉莎白布莱克本ELIZABETHHBLACKBURN、卡罗尔格雷德CAROLWGREIDER、杰克绍斯塔克JACKWSZOSTAK三位美国科学家能够在端粒和端粒酶保护染色体机理的研究领域取得巨大成就，并获得2009年诺贝尔生理学或医学奖，与四膜虫也是息息相关的。此外，作为先进的分子遗传学工具，四膜虫已建立起一系列成熟的基因重组及细胞转染等分子遗传学操作方法和技术，使得在嗜热四膜虫中进行基因敲除和插入、基因表达抑制和基因过表达等十分方
3、便快捷。四膜虫在自然界中分布广泛，在水域食物链系统中处于能量流动与物质循环的一个基础环节，直接暴露在水体中，对有毒物质反应敏感。其个体小、繁殖周期短，是第一种进行实验室无菌纯培养并实现细胞同步化的纤毛虫，再加上其在分子遗传学以及一些基础研究中的成就，它越来越受到毒理学与生态毒理学家的关注，并越来越多的被运用到相关领域的研究当中2,3,4。迄今为止，科学家已对四膜虫的诸多物种进行了多方面研究，本文概括总结了研究化学物质对四膜虫毒性的主要方法和内容。2研究方法与内容21群体生长动力研究在适宜条件下四膜虫生长符合典型的微生物生长曲线模型，当外源性有毒物质存在时，种群传代情况发生改变，据此可通过分析四
4、膜虫的动态生长曲线来指示其对所处生长环境中有毒物质的反应情况。目前普遍采用在普通光学显微镜下进行密度计数以及流式细胞仪计数。黄卫红等通过以嗜热四膜虫TETRAHYMENATHERMOPHILABF5为靶生物，在PPYS培养基和无机盐培养基中研究了生长稳2定期中的四膜虫暴露于50GL1、250GL1和L000GL1六氯苯的中短期生物毒性，得出在培养体系中营养物质的存在可降低及缓解六氯苯对四膜虫的生物毒性的结论5。在姚莹等进行的纳米ZNO对嗜热四膜虫的生态毒性研究中，用该法得出低浓度ZNO对嗜热四膜虫的增殖具有促进作用，其中L00MGL1处理组促进作用最明显6。王永兴等应用该方法通过实验验证了刺泡
5、发射实验方法的可行性，说明该试验是一种值得推荐的快速、简便、可靠的水生生物短期测试法7。22形态结构研究许多研究人员在计数实验之外还结合了超微结构分析研究，提供了形态变化、毒性物质作用部位以及生理变化的相关数据。如张蔚霞等在铁系纳米材料对四膜虫的安全效应试验中在偏光显微镜下观察到细胞内不同程度呈现了黑色颗粒物，而且纳米磁性FE3O4组和磁性铁氧化物及纳米沸石分子筛组装体组在四膜虫细胞体内出现了较多团聚体8。另外，NILSSON在关于锌离子浓度对四膜虫的毒性作用的实验中，利用电镜照片准确地显示了锌离子浓度梯度下四膜虫胞质内小型折射颗粒的数目、结合位点及与食物泡相融合等一系列结果9。MOUNTAS
6、SIF的实验中显示镉、铁、铝盐对梨形四膜虫的形态结构有所影响10。23细胞内大分子水平及酶活性研究关于化学胁迫下四膜虫的生理生化特性的改变包括胞内碳水化合物、蛋白质、核酸等生物大分子的合成及代谢被不同程度地抑制或激活，从而导致细胞内大分子水平的改变11,12。因此四膜虫体内代谢产物和指标的变化可以作为毒性效应指示的特殊标志。在诸如此类的实验当中，已有生物大分子与关键代谢酶及抗氧化系统、ATP含量、胞内PH值、氧气摄取量以及呼吸代谢反应的变化等作为生化标记物用于检测不同化学物质的毒性。同时，对更多有效生化指标的探索也在不断开展，已有一些特殊的蛋白（如钙调素、热激蛋白）与酶（琥珀酸脱氢酶13、超氧
7、化物歧化酶6）活性在以四膜虫为材料的试验中被报道14。24DNA的损伤的检测241单细胞凝胶电泳检测DNA损伤单细胞凝胶电泳SINGLECELLGELELECTROPHORESIS，SCGE又称彗星实验COMETASSAY，是由OSTLING等在1984年提出，之后经SINGH等进一步完善的一种敏感、经济、快速的检测单个细胞原发性DNA损伤的技术，通过检测核DNA断片的析出量（彗尾长度、拖尾率）显示核DNA损伤和细胞受损伤程度，其特点是可直接观察单个细胞内的DNA损害15,26。该方法广泛用于复合环境污染、DNA损伤与修复的检测、遗传毒理学、细胞凋亡机制的研究16。通过统计细胞损伤率等分析判断
8、被测物的毒性。在徐忠东等采用SCGE研究不同浓度重金属镉离子对四膜虫核DNA的损伤作用的研究中，结果显示重金属镉离子对四膜虫核DNA损伤具有明显的浓度效应16。谷康定等则从实验中得出四膜3虫SCGE从方法上完全可以与动物原代细胞和传代细胞互相替代的结论，但四膜虫单细胞凝胶电泳实验是后二者所不及的15。王丽等认为四膜虫作为生物材料应用于单细胞凝胶电泳实验，在遗传毒性检测、环境水质检测等方面具有较大的应用优势和广阔发展前景17。242流式细胞仪流式细胞术是利用荧光技术来检测DNA小片段，从而了解单细胞及其DNA的受损情况。此方法能够快速高效地检测单细胞的表型、细胞增殖、胞内蛋白及凋亡等，还可以定量
9、检测DNA含量，在细胞生物学等研究中应用广泛18,19。徐忠东等采用SCGE和流式细胞术两种快速而灵敏的检测方法联合检测，以四膜虫的细胞损伤率、彗尾长度、DNA损伤专用单位、拖尾率以及DNA相对荧光强度为指标，研究异喹啉、喹啉、吲哚、吡啶四种含氮杂环化合物引起四膜虫核DNA损伤而表现的毒性作用，结果显示四种化合物均表现出较强的毒性，毒性由强到弱依次为异喹啉、喹啉、吲哚、吡啶18。另外，他们应用相同技术进行了模拟叶绿素等合成的化合物四氮杂大环ZN、CO两种配合物在不同浓度条件下对四膜虫核DNA损伤作用，结果显示两种配合物均表现出一定毒性，四氮杂大环CO配合物的毒性大于四氮杂大环ZN配合物的毒性1
10、9。此外，流式细胞计数仪也可用作数目统计实验，结果以半抑制浓度IC50VALUES表示。所得结果被认为与传统计数法基本等价，但是后一种方法对所测试的毒性底物种类有更多限制，也更易受人为干扰。目前，已发展双色荧光染料标记的方法，其灵敏度和精确性更高。25利用定量构效关系QSAR评估毒性对工业生产中成千上万种化学物质进行逐一的毒性评估是非常困难的，仅靠实验无法有效地估计有毒化合物对四膜虫的生长影响。近年来SCHULTZ研究小组以四膜虫为生物模型，利用定量构效关系QUANTITATIVESTRUCTUREACTIVITYRELATIONSHIP，QSAR方法通过已知的化学物质毒性来预测其他化学品的潜
11、在毒性，并建立了一系列化学物质数据库，这才从某种程度上克服了这一难题24。一些QSAR方法，如COMFA、亚结构分析方法、HANSH分析方法和EVA等，已经在许多领域得到广泛应用21。刘红艳等采用比较分子力场分析COMPARATIVEMOLECULARFIELDANALYSIS，COMFA描述子表征了133种苯酚类化合物对梨形四膜虫的毒性，从133个化合物中随机选取113个作为训练集建立COMFA模型，揭示这些化合物对梨形四膜虫毒性的立体结构和电荷分布的量变规律，为预报化合物对梨形四膜虫的潜在毒性提供线索22。陈达等采用全息定量结构活性相关分析HOLOGRAPHICQSAR或HQSAR分析了3
12、0个酯类化合物对四膜虫的毒性与分子结构之间的关系，以及分子碎片大小和全息长度对QSAR模型的影响，HQSAR能快速简便的产生高统计质量和预测能力的QSAR模型21。26基因表达特性从分子水平探讨和研究重金属在生物体内的相互作用机制及生物体的响应机制，不仅为认识和4解决重金属的污染问题和毒性机理奠定基础，同时也是当前毒理学和生态毒理学发展的特点和趋势之一。目前，需要解决的关键问题是选择更为敏感和优良的模式物种、选择更有效和有针对性的分子标记及选择高灵敏度的基因表达实验方法。俞婷等在荧光定量PCR优化的基础上，利用该技术考察了不同浓度的重金属镉和铜对嗜热四膜虫金属硫蛋白基因MTT1诱导表达的变化规
13、律，结果表明镉离子对MTT1基因表达的诱导更灵敏，镉与铜同时诱导时MTT1基因的表达情况与镉单独诱导的类似，但阈值浓度减小，表明二者的联合毒性为协同作用23。3展望随着经济的不断发展，环境污染问题也更加严峻，加大对环境保护的投入，提高环境保护意识，加强环境监测尤为重要。在环境毒理学的研究中，四膜虫作为一种被广泛运用的生物模型，其多种多样的毒性反应从不同角度和层次给我们提供了许多有价值的毒理学信息25。尽管四膜虫对有毒物质的毒性反应往往因实验条件的不同而有所差异，而且还有许多机理问题尚未搞清楚，但是相信随着研究的不断深入，四膜虫这一生物模型在环境毒理学研究中将显示出它更大的优势。此外，还应充分认
14、识原生动物在生态系统中的重要性，不断改进和完善原生动物监测研究方法，特别是改进细胞水平毒性试验的研究，与理化检测相互补充、修正，对试验参数应用数学分析和计算机处理建立数学模型，以充分发挥原生动物在环境监测中的作用。为毒理学研究、合理利用自然资源、评价生态环境质量、恢复重建生态、保护生态环境等工作提供依据。参考文献1杨超,邸伟,张飞雄伊丽莎白布莱克本与端粒和端粒酶研究J遗传北京,2010,321132TWAGILIMANAL,BOHATIERJ,GROLIERECA,ETALANEWLOWCOSTMICROBIOTESTWITHTHEPROTOZOANSPIMSTOMUMTERESCULTURE
15、CONDITIONSANDASSESSMENTOFSENSITIVITYOFTHECILIATETO14PURECHEMICALSJECOTOXICOLENVIRONSAF,1998,4132312443傅诚杰,俞婷,缪炜,等四膜虫毒理学与生态毒理学研究中的优良模式生物J动物学杂志,2005,4011081134叶寒青,杨祥良,徐辉碧梨形四膜虫在环境毒理学研究中的应用J生物学杂志,2001,18531335黄卫红,赵天珍,赵柳青,等,六氯苯对原生动物四膜虫的生物毒性实验室研究J环境科学与技术,2006,291211136姚莹,杨柳燕,陈军,等纳米ZNO对嗜热四膜虫的生态毒性研究J环境科学研究,
16、2009,2278338377王永兴,吴庆龙,王晓蓉,等应用四膜虫刺泡发射试验方法评价金属离子的毒性J中国环境科学,1998,1854464498张蔚霞,曹吉林,孙群,等用嗜热四膜虫模型研究铁系纳米材料对环境生物体的安全效应J化学世界,2007634134459NILSSONJRHOWCYTOTOXICISZINCASTUDYONEFFECTSOFZINCONCELLPROLIFERATION,ENDOCYTOSIS,ANDFINESTRUCTUREOFTHECILIATETETRAHYMENAJACTAPROTOZOOL,2003,421192910MOUNTASSIFD,KABINEM,M
17、ANARR,ETALPHYSIOLOGICAL,MORPHOLOGICALANDMETABOLICCHANGESINTETRAHYMENAPYRIFORMISFORTHEINVIVOCYTOTOXICITYASSESSMENTOFMETALLICPOLLUTIONIMPACTONDHYDROXYBUTYRATEDEHYDROGENASEJECOLOGICALINDICATOR,2007,788289411SURENDARK,LALRANDBHATNAGARPTHEEFFECTSOFDIELDRINDIMETHOATEANDPERMETHRINONTETRAHYMENAPYRIFORMISJEN
18、VIRONPOLLUT,1989,5727528012ALCHALABIKAAANDALKHAYATBHATHEEFFECTSOFLINDANEONNULEICACID,PROTEINANDCARBOHYDRATECONTENTINTETRAHYMENAPYRIFORMISJENVIRONPOLLUT,1989,5728128713诸颖,冉铁生,李宇国,等多壁碳纳米管MWNTS对梨形四膜虫的生长促进作用J核技术,2007,30868969314SAUVANTNP,PEPIND,PICCINNIETETRAHYMENAPYRIFORMISATOOLFORTOXICOLOGICALSTUDIESJ
19、CHEMOSPHERE,1999,381631L66915谷康定,唐非,鲁志松,等单细胞凝胶电泳在真核微生物上的应用J华中科技大学学报医学版,2004,33213914216徐忠东四膜虫细胞凝胶电泳评价环境污染方法的研究J安徽教育学院学报,2007,256828517王丽,鲁志松,丁书茂,等四膜虫彗星实验在环境水质检测中的应用J环境科学与技术,2006,295313318徐忠东,施荣华,耿明,等含氮杂环化合物对四膜虫的毒性作用研究J中国农业大学学报,2008133576219徐忠东,魏兆军,施荣华,等流式细胞术分析四氮杂大环与ZNCO配合物对四膜虫的毒性作用J安徽农业科学,2008,36251
20、09261093220BCARDENAP,SCHULTZTWSTRUCTURETOXICITYRELATIONSHIPSFORPIMEPHALESANDTETRAHYMENAAMECHANISMOFACTIONAPPROACHJENVIRONTOXICOLCHEM,1997,1661311131721陈达,印春生,戴玄吏,等部分酯类化合物对四膜虫毒性的全息QSAR分析J环境科学与技术,2004,2713422刘红艳,刘树深部分苯酚化合物对梨形四膜虫毒性的三维定量构效关系J桂林工学院学报,2006,26453854223俞婷,缪炜,万明亮,等镉和铜对嗜热四膜虫金属硫蛋白基因的诱导表达J动物学报,2005,5161115112124顾云兰,陶建清,费正皓硝基芳烃对梨形四膜虫急性毒性的定量构效关系研究J化学研究与应用,2009,21223423825徐忠东,张雁,王伟,等原生动物在环境监测中的应用研究J合肥师范学院学报,2009,27695109626徐忠东,陶瑞松,耿明,等重金属CD2对四膜虫核DNA的损伤作用J安徽农业科学,2007,353410943
