1、毕业论文开题报告生物技术梅氏新贝尼登虫MUCIN基因异构体的鉴定一、选题的背景与意义梅氏新贝尼登虫NEOBENEDENIAMELLENI是世界上广泛分布的一类寄生虫，在许多种类的海水养殖鱼类体内均有发现，它们主要寄生在鱼类体表、鳃丝和鳍等部位，其分类位置为单殖目、分室科、新贝尼登虫属。寄生虫通过识别宿主体表分泌的黏液侵染宿主，以宿主体内血液或体表某些组织为食。受到感染的鱼体通过摩擦养殖网箱以制止皮肤搔痒，进而使自身皮肤大面积受伤糜烂，鳞片脱落，最终导致病鱼精神不定，拒食而亡杨文川等,2001LEONG,ETAL,2002黄艳平等,2003。相关文献报道称，梅氏新贝尼登虫病害经常在我国沿海地区爆
2、发，给水产养殖业带来巨大损失，养殖鱼类感染此寄生虫的数目已占一半以上，在某些地区甚至已达100杨文川等,2004。由此可见，对此类寄生虫的防治已迫在眉睫。目前针对梅氏新贝尼登虫的防治方法主要有三淡水加20106氟本尼考等抗菌素浸洗510MIN，绝大部分虫体变白脱落死亡，这也是本尼登虫病最安全、有效的防治方法，但缺点是操作繁琐、劳动强度较大；250106福尔马林海水增氧浸洗20MIN；用生石灰等泼洒或挂袋亦可防治。这些方法虽有一定疗效，但很难从根本上制止梅氏新贝尼登虫对鱼类的侵害，尤其是难以杀死虫卵，使疾病屡治屡发。深入研究梅氏新贝尼登虫寄生过程的分子机制，开发针对关键蛋白的抗体药物成为控制此种
3、疾病的关键。MUCIN基因是生命体广泛表达的一类基因，其编码的黏蛋白是一类高度糖基化蛋白（HWARDANDCAROLYN,2005），集中分布在呼吸道和消化道等组织的粘膜表面，行使润滑及保护的作用。蛋白骨架核心区域丝氨酸、苏氨酸残基上连接的大量寡糖链构成黏蛋白的基本结构，其中总分子量的一半以上由这些寡糖链占据。科学家对梅氏新贝尼登虫和鱼类体表分泌的黏液成分进行分析，发现其中都含有MUCIN基因家族编码的黏蛋白，EMMANUELROGER等研究证明它们在寄主的识别与入侵以及宿主的免疫反应中发挥着重要作用EMMANUELANDBENJAMIN,2008。目前，国内对MUCIN基因的研究才刚刚起步，
4、国外对MUCIN基因及其蛋白已经作了大量研究。初步对MUCIN基因序列的分析与比对证明，这类基因是由可变数目的重复序列组成VNTAVARIABLENUMBEROFTANDEMREPEATS，VNTRS，因此具有多种异构体。其所编码的黏蛋白在核心蛋白部位具有相应的特异性连续重复模体TANDEMREPEATS，TRS结构，它们也因此具有多态性（高峰等,2007）。推测这种多态性与寄主和宿主进化过程中的双向选择具有密切关系（GEORGIOS,ETAL,2001）。本课题对梅氏新贝尼登虫的RNA进行提取以获得其MUCIN基因的异构体CDNA序列，通过分析与比对来鉴定此基因的分子特征，为进一步探究梅氏新
5、贝尼登虫寄生过程中MUCIN基因发挥的作用和寻找防治此种病原虫疾病的新方法提供理论依据。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容本实验主要是从梅氏新贝尼登虫CDNA文库中获得MUCIN基因异构体CDNA全长序列，并进行序列分析比对及糖基化分析，最后利用实时荧光定量PCR分析梅氏新贝尼登虫不同发育阶段MUCIN基因的表达情况。拟解决的问题梅氏新贝尼登虫MUCIN基因异构体分子特征鉴定。三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1实验动物2007年8月采用咸淡水浸泡法，在浙江省宁波市象山黄避岙港湾水产养殖育苗中心养殖的大黄鱼PSEUDOSCIAENACROCEA体表分离梅氏新贝尼登虫成虫，经
6、系统寄生虫学的鉴定，暂养于海水中至肠道内含物排空后，用无菌双蒸水反复冲洗虫体后置于EPPENDOFF管中，70C冰箱保存备用。2总RNA提取利用RNAISO试剂提取健康香鱼肝脏组织总RNA1将100MG70保存的样品在液氮中研磨成粉末，然后加入1MLRNAISO组织以下为加入1MLTRIZOL试剂标准。2研磨后转入15MLEPPENDORF管中，剧烈振荡混匀，室温放置5MIN。4，12000RPM离心5MIN。3取上清，移至新的EP管中，加入1/5体积氯仿，用力振荡15S，充分混匀，室温放置23MIN。4，12000RPM离心10MIN。4底层为氯仿相，中层为蛋白相，上层是含RNA的无色水相。
7、将上清转入一新的离心管注意不要吸入蛋白层，加入05ML氯仿于上清，振荡混匀，室温放置23MIN。4，12000RPM离心10MIN。5将上清转入一新的离心管，加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10MIN。412000RPM离心10MIN，去上清。6加入DEPC水配制的体积分数75乙醇1ML，振摇，洗涤沉淀。412000RPM离心5MIN。重复步骤6一次，以彻底将盐份除净。7去上清，真空干燥，用DEPC水溶解。注意所有待用的非TRIS的试剂用01DEPC水溶液配制。离心管、枪头、研钵及玻璃器皿等用01DEPC水处理过夜后121高压灭菌20MIN。提取过程中要勤换手套及戴口罩，以免RNA
8、降解。8RNA样品OD值检测。取1LRNA溶液加入到69LDEPC处理水中，用紫外分光光度计测定230NM、260NM和280NM的OD值。RNA浓度OD260核酸稀释倍数40/1000G/L去除蛋白指标OD260/OD28018去除盐分指标OD260/OD230209RNA电泳检测。取5LRNA样品加4LDEPC处理水和1L10BUFFER凝胶电泳上样缓冲液，混匀后上样，进行电泳。10MRNA纯化采用OLIGOTEXDT30进行纯化。3构建寄生虫CDNA文库构建实验采用的载体为PBLUESCRIPTIISK，根据选择的ECORI和XHOI酶切位点和锚定引物。31CDNA第一链的合成（1）模板
9、RNA（POLYARNA）500G中加入不含RNA酶的灭菌水，使其总量达到108L。（2）65加热5MIN后，冰中放置5MIN（冷却。（3）在微量离心管中配制下列反应液。试剂体积/L51STSTRANDSYNTHESISBUFFER1STSTRANDDNTPMIXTURERNASEINHIBITOR20U/LOLIGODT18ANCHORPRIMER1G/L40121020（4）向3的反应液里加入2的热处理后的POLYARNA溶液（5G），轻轻混匀。（5）室温放置10MIN后，加入REVERSETRANSCRIPTAE（MMLV10L（全量为20L，轻轻混匀。（6）42反应1H。（7）反应结束
10、后置于冰中冷却2MIN。32CDNA第二链的合成（1）在CDNA第一链合成液（20L）中按下列顺序加入反应试剂，进行2NDSTRANDCDNA的合成反应（反应液总量为146L。试剂体积/L灭菌DEPC水52NDSTRANDSYNTHESISBUFFER2NDSTRANDDNTPMIXTURERNASEFREEH2OECOLIRNASEH/ECOLIDNALIGASEMIXTUREECOLIDNAPOLYMERASEI总体积可变304587522146（2）用移液枪轻轻混匀后16反应2H。（3）70加热10MIN后，室温放置5MIN。（4）加入4L的T4DNAPOLYMERASE后，轻轻搅拌。（
11、5）37反应10MIN。（6）向2NDSTRANDCDNA合成反应液（150L）中加入等量（150L）的苯酚/氯仿/异戊醇（25241）溶液。VORTEX搅拌510S。（7）室温下15,000RPM离心5MIN，液体分为二层。小心取出水相（上层）移至另一个新的微量离心管中注意切勿取出中间层。（8）向水相中加入等量（150L）的氯仿/异戊醇（241）溶液，VORTEX搅拌510S。（9）在室温下15,000RPM离心5MIN，液体分为二层。小心取出水相（上层）移至另一个新的微量离心管中。（10）加入1/10量（15L）的3MSODIUMACETATE、4L的DRGENTLEPRECIPITATI
12、ONCARRIER、225倍量的100乙醇。（11）均匀混合后立即进行15,000RPM、30MIN的离心室温下。（12）除去上清后用70的乙醇清洗。（13）干燥沉淀后，用125L的不含RNA酶的灭菌水溶解沉淀。33接头连接ADAPTORLIGATION向上述双链CDNA溶液125L中加入下列试剂，全量20L。试剂体积/L灭菌DEPC水10T4DNALIGASEBUFFERECORISMAIADAPTOR04G/LT4DNALIGASE350U/L总体积可变2352202轻轻混匀后，8过夜反应（16H以上。370保温30MIN后，室温放置5MIN。44下12000G离心15MIN，小心弃去上清
13、液，用70乙醇洗涤沉淀，4下12000G离心5MIN。34限制酶XHOI酶切反应1向ADAPTORLIGATION溶液20L中加入下列试剂，全量50L。试剂体积/L灭菌DEPC水XHOISUPPLEMENTXHOI50U/L总体积可变273502轻轻混匀后，37反应3H。35使用SPINCOLUMN除去短链CDNA以下的COLUMN处理可以除去400BP以下的短链CDNA。SPINCOLUMN的准备（1）反复上下颠倒悬浊COLUMN内的GEL。（2）先取下上盖后，慢慢取下下盖，COLUMN上下盖不要丢弃。（3）让COLUMN内的BUFFER自然流出（大约需要15MIN。（4）安装下盖，向COL
14、UMN中加入2ML的TEBUFFER后再盖上盖，反复上下颠倒悬浊GEL。（5）重复上述操作24。（6）取下COLUMN的上下盖，让COLUMN内的BUFFER自然流出。（7）将去盖的15MLMICROTUBE放置于FALCONTUBE中，然后将SPINCOLUMN插入FALCONTUBE中，将COLUMN的下端安装于FALCONTUBE中的15MLMICROTUBE内2，400G离心2MIN。（8）丢弃FALCONTUBE中的15MLMICROTUBE，向FALCONTUBE中放入新的去盖的15MLMICROTUBE，再将SPINCOLUMN的下端安装于FALCONTUBE中的15MLMICR
15、OTUBE内。（9）向XHOI酶切溶液（50L）中加入下列试剂，充分混合。试剂体积/LTEBUFFERTRNA10G/L401（10）将上述1的溶液向操作1中准备好的SPINCOLUMN中添加。请注意要添加在COLUMN中的GEL表面的中央位置，每次添加约10L，分数次慢慢添加。（11）400G离心2MIN。（12）COLUMN洗脱液约100L转移至新的15MLMICROTUBE中，加入等量（100L）的苯酚/氯仿/异戊醇（25241）溶液，剧烈振荡混匀。（13）室温下15,000RPM离心5MIN，液体分为二层，小心取出水相（上层）转移至另一个新的微量离心管中注意切勿取出中间层。（14）加入
16、等量（100L）的氯仿/异戊醇（241）溶液，剧烈振荡混匀。（15）室温下15,000RPM离心5MIN，液体分为二层，小心取出水相（上层）转移至另一个新的微量离心管中。（16）加入1/10量（10L）的SODIUMACETATE、4L的PRECIPITATIONCARRIER，225倍量的100乙醇，充分混匀。（17）室温下15,000RPM离心30MIN，除去上清，再用70乙醇清洗沉淀。（18）干燥沉淀后用15L的RNASEFREEH2O溶解沉淀。36连接到特定质粒载体载体结合反应（1）配制下列LIGATION反应液。试剂PURIFIEDCDNA10T4DNALIGASEBUFFERPBL
17、UESCRIPTIISKT4DNALIGASE350U/L体积/L15212（2）轻轻混合后12过夜反应。（3）向LIGATION反应液中加入80L的TEBUFFER，用等量100L）的苯酚/氯仿/异戊醇（25241）抽提1次，再用等量（100L）的氯仿/异戊醇（241抽提1次。（4）向上清中加入1/10量（10L）的3MSODIUMACETATEPH52）、4L的DRGENTLEPRECIPITATIONCARRIER，225倍量的100乙醇，充分混合。（5）室温15,000RPM离心30MIN，除去上清。（6）用70乙醇清洗沉淀。（7）干燥沉淀后，用20L的TEBUFFER溶解沉淀。（8）
18、20保存。37质粒转化（1）将80保存的DH10BELECTROCELLS于冰上融解。（2）将LIGATION溶液的一部分（0510L）加入至DH10BELECTROCELLS中，轻轻混匀。（3）将2的菌液迅速转移至冰上预冷的01CM冲击槽中，施加电压脉冲进行电击转化。LIGATION溶液宿主大肠杆菌机种冲击条件0510LDH10BECOLIPULSER（BIORAD公司）15KV,200，25F（4）向冲击槽内快速加入冰上预冷的SOC。（5）全量取出回收后，转移至培养TUBE中（FALCONTUBE等，37振荡培养1H（使用1ML的SOC培养基。（6）取部分5的培养液（1L或10L）涂布于L
19、B/AMP琼脂平板培养基上培养，剩余的培养液请于4保存。（7）37过夜培养。（8）计算菌落数，求取CDNAPRIMARYLIBRARY效率。（9）使用T7PROMOTERPRIMER及T3PROMOTERPRIMER进行COLONYPCR反应，确认本LIBRARY的INSERT分布情况。4PCR扩增、RACE及荧光定量PCR检测设计兼并引物，获取MUCIN基因异构体全长序列，若基因未获全长，可根据已获得的序列设计特异引物，进行末端扩增，从而获得MUCIN异构体的全长序列序列测定和分析采用ABIPRISMTM3770DNA自动测序仪双向测序，由华大基因公司测定。序列分析采用BLASTP分析软件H
20、TTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLAST/，多重序列比对采用DNAMAN软件，糖基化分析采用EXPASY软件HTTP/WWWEXPASYCH/，梅氏新贝尼登虫不同发育阶段MUCIN基因的表达情况由实时荧光定量PCR分析完成。（二）技术路线四、研究的总体安排与进度20109201010毕业论文选题201010201011进行文献查阅和资料收集，完成开题报告及任务书，制定具体研究计划和试验方案。20101120111获得梅氏新贝尼登虫MUCIN基因异构体全长CDNA序列，对其进行BLAST分析，比对分析和MUCIN基因异构体进化树构建2011120112数据和材料整理、分析。20112
21、20113开题答辩与综述。2011320115完成2篇外文翻译，论文撰写、提交并答辩。五、主要参考文献1曹红,东风,郑伟MUC1、MUC3在结石性胆囊炎和胆囊腺瘤样息肉粘膜组织中的表达及其意义J中国普外基础与临床杂志,200373793822高峰,郭洪斌,史鹏MUC1蛋白的研究进展J中国老年学杂志,20075101410153康美和MUC1基因,CA153与肺癌的临床研究进展J江西医药,2008,4321661684贾彦彬,张建祖MUC6基因的一个单核苷酸多态性与胃癌没有关联J包头医学院学报,2010,263135黎国伟急性白血病患者MUG1与WT1基因表达的临床意义J中国肿瘤临床,2005,
22、32148018036陈淑靖,白春学气道黏液中黏蛋白MUCSAC的研究进展J中华结核和呼吸杂志,2007,3064614637杜立阳青黛颗粒对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜MUC2和INOS基因表达的影响J世界华人消化杂志,2010,1899379418王超,秦宜德,王巍人MUC16基因启动子区域的初步分析J安徽医科大学学报,2009,4455335359汪荣泉人正常腺上皮组织中MUC6基因的表达J中国组织化学与细胞化学杂志,2001,102182010陈健食管癌中癌基因MUC4的变化及临床病理意义JDIASPATH,20041110811011杨静文,张伟生,吴立玲唾液和汨液中主要黏蛋白MUC5B
23、和MUC7协同互补功能J现代生物医学进展,梅氏新贝尼登虫成虫的分离与保存梅氏新贝尼登虫总RNA的提取构建寄生虫CDNA文库构建PCR扩增进行5RACE获得MUCIN基因异构体全长序列序列分析与比对糖基化分析REALTIMEPCR检测基因表达量变化设计MUCIN基因的兼并引物200882330233312汪荣泉胃癌及癌前病变组织中MUC6核粘蛋白的表达及其意义J第三军医大学学报,2001,23191213汪荣泉消化道癌患者胃肠道粘膜中MUC2和MUC3基因的表达J基础医学与临床,2000,205373914高文涛胰腺癌MUC4抗原多表位嵌合基因重组腺病毒载体的构建及其在COS7细胞的表达J南京医
24、科大学学报,2007,27121358136015李贵森MUC20基因串联重复片段多态性及其对IGA肾病的影响J中华医学杂志,2005,85191333133516ZENY,HARADAK,SASAKIM,ETA1LIPOP0IYSACCHARIDEINDUCESOVEREXPRESSIONOFMUC2ANDMUC5ACINCULTUREDBILIARYEPITHELIALCELLSPOSSIBLEKEYPHENOMENONOFHEPATOLITHIASISJAMJPATHOL,2002,16L41475148417SLOMIANYBL,SLOMIANYAIMPEDANCEOFHELICOBA
25、CTERPY1ORILIPOPOLYSACCHARIDEINTERFERENCEWITHGASTRICMUCINSYNTHESISBYPEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATEDRECEPTORGAMMAACTIVATIONINVOLVESPHOSPHATIDYLINOSITOL3KINASE/ERKPATHWAYJLUBMBLIFE,2003,5529710218SLOMIANYBL,SLOMIANYALEPTINMODULATESTHEDETRIMENTALEFECTOFPORPBYROMONASGINGIVALISLIPOPOLYSACCHARIDEINDUCEDCYT
26、OSOLICPHOSPH0LIPASEA2ACTIVATIONONSALIVARYMUCINSYNTHESISVIAERKSIGNALTRANSDUCTIONJINFLAMMOPHARMACOLOGY,2006,145425025519JUANPV,ROBERTLHTHESTRUCTUREANDASSEMBLYOFSECRETEDMUCINSJBIOLCHEM,1999,27431720MONIAUXN,ESCANDEF,PORCHETN,ETA1STRUETURALORGANIZATIONANDCLASSIFICATIONOFTHEHUMANMUCINGENESJFRONTBIOSCIENC
27、E,2001,619221DESSEYNJL,BUISINEMP,PORCHETN,ETA1EVOLUTIONARYHISTORYOFTHE1LP15HUMANMUCINGENEFAMILYJMOLEVOL,1998,461101222TURNERBS,BHASKARKR,HADZOPOULOUCLADARASM,ETA1CYSTEINERICHREGIONSOFPIGGASTRICMUCINCONTAINVONWILLEBRANDFACTORANDCYSTINEKNOTDOMAINSATTHECARBOXYLTERMINALJBIOCHIMBIOPHYSACTA,L999,144717792
28、23WICKSTRTIMC,DAVIESJR,ERIKSENGV,ETA1MUC5BISAMAJORGELFORMING,OLIGOMERICMUCINFROMHUMANSALIVARYGLAND,RESPIRATORYTRACTANDENDOCERVIXIDENTIFICATIONOFGLYCOFORMSANDCTERMINALCLEAVAGEJBIOCHEM,1998,334PT368569324LINDHL,GLANTZPO,CARLSTEDTI,ETA1ADSORPTIONOFMUC5BANDTHEROLEOFMUCINSINEARLYSALIVARYFILMFORMATIONJCOL
29、LOIDSANDSURFACESBIOINTERFACES,2002,25213914625HABTEHH,MALLAS,DEBEERC,ETA1THEROLEOFCRUDEHUMANSALIVAANDPURIFIEDSALIVARYMUC5BANDMUC7MUCINSINTHEINHIBITIONOFHUMANIMMUNODEFICIENCYVIRUSTYPE1INANINHIBITIONASSAYJVIROLJ,2006,3249926SHIMINLI,BOBEKLAFUNCTIONALANALYSISOFHUMANMUC7MUCINGENE5FLANKINGREGIONINLUNGEPI
30、THELIALCELLSJAMERICANJOURNALOFRESPIRATORYCELLANDMOLECULARBIOLOGY,2006,35559360127INTINIG,AGUIRREA,BOBEKLAEFICACYOFHUMANSALIVARYMUCINMUC7DERIVEDPEPTIDEANDHISTATIN5INAMURINEMODELOFCANDIDIASISJINTJANTIMICROBAG,2003,22659460028GURURAJATL,LEVINEJH,TRANDT,ETA1CANDIDACIDALACTIVITYPROMPTEDBYNTERMINUSHISTATI
31、NLIKEDOMAINOFHUMANSALIVARYMUCINMUC7JBIOCHIMICAETBIOPHYSICAACTA,1999,1431110711929SOARESRV,LIUB,OPPENHEIMFG,ETA1STRUCTURALCHARACTERISATIONOFCYSTEINESINABACTERIALBINDINGMOTIFOFHUMANSALIVARYMUCINMG2JARCHIVESOFORALBIOLOGY,2002,47859159730INTINIG,AGUIRREA,BOBEKLAEFICACYOFHUMANSALIVARYMUCINMUC7DERIVEDPEPT
32、IDEANDHISTATIN5INAMURINEMODELOFCANDIDIASISJINTJANTIMICROBAG,2003,22659460031WEIGX,BOBEKLAINVITROSYNERGICANTIFUNGALEFECTOFMUC712MERWITHHISTATIN512MEROFMICONAZOLEJJANTIMICROBCHEMOTH,2004,53575075832KOV6TABM,TOUSSAINTMJM,GRUYSE,ETA1EVALUATIONOFGOOSESERUMAMYLOIDAACUTEPHASERESPONSEBYENZYMELINKEDIMMUNOSOR
33、BENTASSAYJACTAVETHUNG,2007,55334935733EMMANUELROGER,BENJAMINGOURBALEXPRESSIONANALYSISOFHIGHLYPOLYMORPHICMUCINPROTEINSSMPOMUCFROMTHEPARASITESCHISTOSOMAMANSONIJMOLECULARBIOCHEMICALPARASITOLOGY2008,157121722734ISAACCERVANTESSANDOVAL,JOSEDEJESUSSERRANOLUNAMUCINSINTHEHOSTDEFENCEAGAINSTNAEGLERIAFOWLERIANDMUCINOLYTICACTIVITYASAPOSSIBLEMEANSOFEVASIONJMICROBIOLOGY2008,15413895390435GEORGIOST,SALLYJ,HICKS,ETA1THEROLEOFMUCINSINHOSTPARASITEINTERACTIONSPARTIIHELMINTHPARASITESJTRENDSINPARASITOLOGY,2001,173130135
