1、毕业论文开题报告生物技术三疣梭子蟹蜕皮周期中MIH基因的表达一、选题的背景与意义于近些年捕捞过度，梭子蟹自然资源也正日益减少，为满足市场需求和适当保护资源，近年来沿海很多地方已开展人工养殖，人工养殖的三疣梭子蟹与其它的甲壳类动物一样，存在性早熟和的问题。国内外研究者对三疣梭子蟹内分泌系统研究已趋于热点，但是还不能有效的解决三疣梭子蟹养殖中普遍出现的性早熟和蜕皮未遂等难题（刘昌杰，1996，1999）。这些问题的发生可能与甲壳类动物蜕皮机制有关（姚俊杰等，2006）。在甲壳动物个体发育过程中，存在蜕皮现象，即蜕去旧的外骨骼并长出新的外骨骼的过程。蜕皮是甲壳动物生长和发育的标志特征，它贯穿甲壳动物
2、个体发育的始终，它受神经系统和内分泌系统共同调节。蜕皮周期可分为蜕皮MOLT或ECDYSIS、蜕皮后POSTMOLT或METECDYSIS、蜕皮间期INTERMOLT或ANECDYSIS和蜕皮前期PREMOLT或PROECDYSIS对于甲壳动物,根据DRACH和TCHERNIGOVTZEFF（1967）的标准可把蜕皮周期进一步划分为蜕壳前期PROEEDYSISSTAGE，即D期，D0D4、蜕壳期MOLTSTAGE，即E期、软壳期SOFTSHELLEDSTAGE，即A期、薄壳期PAPERSHELLSTAGE，即B期、硬壳期HARDSTAGE，即C期，C1C45个时相。甲壳动物的个体发育伴随有周期
3、性的蜕皮过程，该过程受Y器官分泌的蜕皮激素和蜕皮抑制激素MOLTINHIBITINGHORMONE，MIH的正负调控。经生化鉴定，MIH属于甲壳动物高血糖激素CRUSTACEANHYPERGLYCEMICHORMONE，CHH家族神经肽。CHH家族成员除了CHH、MIH外，还包括性腺抑制激素GONADINHIBITINGHORMONE，GIH和大颚器官抑制激素MANDIBULARORGANINHIBITINGHORMONE，MOIH。MIH在眼柄X器官的表达量最高，其次在脑，而在其他组织中几乎没有表达。蜕皮抑制激素基因在甲壳动物的生长、发育和繁殖调控中起着重要作用，其重组蛋白的表达有助于详细研
4、究蜕皮抑制激素基因在甲壳动物中的调节机制。近年来一些研究结果表明，蜕皮周期是由一个非常复杂的系统来调控的。NAKATSUIIANDSONOBE2003，2004在对美洲螯虾PROCAMBARUSCLARKII的MIH研究中发现，蜕皮周期中MIH的水平与蜕皮激素的水平并非呈现绝对的负相关。在整个蜕皮周期中，MIH水平只在蜕皮前期减少。另外，蜕皮周期不仅与MIH的水平有关，还与Y器官对MIH的应答性的大小有密切联系。顾志敏等（1991）发现切除眼柄可以缩短蜕皮周期，促进蜕皮发身。OKUMURA等2005）对日本囊对虾的研究表明，通过在蜕皮间期注射具有生物活性的重组MIH蛋白之后，日本囊对虾的蜕皮间
5、期由（9004）D延长到（9505）D，并且血淋巴中蜕皮激素的含量从（194109）NG下降至（128039）NG。这一结果表明，MIH可以延长日本囊对虾的蜕皮间期，从而对日本囊对虾的蜕皮调控产生抑制作用。LEE（2007）对红陆蟹（GECARCINUSLATERALIS）的研究同样表明，经原核表达的MIH蛋白能对蜕皮过程产生抑制作用，从而对其蜕皮调控产生影响。KARAJLEE等（1998）用NORTHENBLOT方法对可口美青蟹蜕皮周期中MIHMRNA水平变化进行了测定分析，发现在蜕皮前期MIH的MRNA水平逐渐降低，蜕皮以后MIH的水平突然升高，在蜕皮期间持续升高，这在MRNA水平证实了M
6、IH的生理功能。另外对与三疣梭子蟹蜕皮周期中的MIH表达水平与蜕皮周期各个时期关系从未报道。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1样品采集，主要对三疣梭子蟹蜕皮周期中各个时期的MIH样品采集。2对三疣梭子蟹MIH基因的MRNA提取以及定量反转录成CDNA。3设计三疣梭子蟹MIH的CDNA特异性引物，对公布的甲壳类动物18SRNA的CDNA序列的比对分析，设计一对兼并引物扩增一段保守的CDNA片段作为内参。4REALTIMEPCR分析蜕皮周期中各个时期与MIH水平变化的关系。拟解决的关建技术和难点1、三疣梭子蟹蜕皮周期中各个时期的样品采集。2、得到高质量的眼柄X器窦腺复合体RNA。3、通过实验得
7、到蜕皮周期中各个时期MIH表达量，以及相对的变化趋势。三、研究的方法与技术路线四、研究的总体安排与进度201010毕业论文选题；提取眼柄X器窦腺复合体RNA采集蜕皮周期中各个时期的眼柄X器窦腺复合体反转录成CDNA设计特异性引物以及18SRNA兼并引物REALTIMEPCR分析201010201011进行文献查阅和资料收集，完成开题报告及任务书，制定具体研究计划和试验方案；201012开题答辩与综述；201012201102各方面实验的进行；201102201103数据处理和材料整理、分析；201103201105完成2篇外文文献翻译、论文撰写、提交并答辩。四、参考文献1顾志敏，何林岗切除单侧
8、眼柄对中华绒螯蟹蜕壳、生长、成熟的影响J淡水渔业，1991，510132刘昌杰，侯艳丽，王纬等虾池养殖三疣梭子蟹当年性早熟初报J齐鲁渔业，1996，16（6）19203邱高峰,张爱萍,楼允东等锯缘青蟹蜕皮抑制激素CDNA的分子克隆及其表达分析J水产学报，2003，27（3）2072124姚俊杰，赵云龙甲壳动物蜕皮的调节机制研究进展J水利渔业，2006，26（6）8105朱冬发，沈建明，杨济芬等三疣梭子蟹蜕皮抑制激素CDNA的克隆与序列分析J动物学报，2008，54（6）111211186元一舟,朱冬发,杨济芬等甲壳动物蜕皮抑制激素调控机制的研究进展动物学杂志J,2010,4521651707郭
9、豫杰，周开亚，马长艳中华绒熬蟹蜕皮抑制激素1（ERSM1H1）GST融合白在大肠杆菌中的表达J中国水产科学，2004，01（21）1231278朱小明，李少菁甲壳动物幼体蜕皮的调控J水产学报，2001，25（4）56599赵红霞甲壳动物蜕皮调控研究及蜕壳素的使用J广东饲料，2006，15（1）15415910SPAZIANIE,WATSONRD,MATTSONMP,ETALECDYSTERIODBIOSYNTHESISINTHECRUSTACEANYORGANANDCONTROLBYANEYESTALKNEUROPEPTIDEJEXPZOOL,1989,252327128211CHANGES,
10、PRESTWICHGD,BRUCEMJAMINACIDSEQUENCEOFAPEPTIDEWITHBOTHMOLTINHIBITINGANDHYPERGLYCEMICACTIVITIESINTHELOBSTERHOMARUSAMERICANUSJBIOCHEMBIOPHYSRESCOMM,1990,171281882612DRACHP,TCHERNIGCSURLAMETHODEDEDETERMINATIONDESSTADESDINTERMUEEOSINAPPLICATIONGENERALEAUXCRUSTACESJVIEETMILIEU,SERIEA,BIOLOGIEMARINE,1967,1
11、859561013KELLERR,CRUSTACEANNEUROPEPTIDESSTRUCTURES,FUNCTIONSANDCOMPARATIVEASPECTSJEXPERIENTIAL,1992,4243944814KUMURAT,HIRAT,KATAYAMAH,ETALINVIVOEFFECTSOFARECOMBINANTMOLTINHIBITINGHORMONEONMOLTINTERVALANDHEMOLYMPHECDYSTEROIDLEVELINTHEKURUMAPRAWN,MARSUPENAEUSJAPONICUSZOOLOGICALSCIENCEJ,2005,2231732015
12、LEEKJ,KIMHWMOLTINHIBITINGHORMONEFROMTHETROPICALLANDCRAB,GECARCINUSLATERALIS,CLONING,TISSUEEXPRESSION,ANDEXPRESSIONOFBIOLOGICALLYACTIVERECOMBINANTPEPTIDEINYEASTJGENCOMPENDOCRINOL,2007,150350551316NAKATSUJI,T,SONOBE,HMEASUREMENTOFMOLTINHIBITINGHORMONETITERINHEMOLYMPHOFTHEAMERICANCRAYFISH,PROCAMBARUSCL
13、ARKII,BYTIMERESOLVEDFLUOROIMMUNASSAYJZOOLSCI,2003,20999100117HIRAT,KATAYAMAH,TOMINAGASCLONINGANDCHARACTERIZATIONOFAMOLTINHIBITINGHORMONELIKEPEPTIDEFROMTHEPRAWNMARSUPENAEUSJAPONICUSJPEPTIDES,2005,2625926818HIRAT,NISHIMURAT,SONOBEH,ETALEXPRESSIONOFRECOMBINANTMOLTINHIBITINGHORMONEOFTHEKURUMAPRAWNPENAEU
14、SJAPONICUSINESCHERICHIACOLIJBIOSCIBIOTECHNOLBIOCHEM1999,631576158119HIRAT,WATANABET,NAGASAWAH,ETALMOLECULARCLONINGOFAMOLTINHIBITINGHORMONEFROMTHEKURUMAPRAWNPENAEUSJAPONICUSJBIOLOGICALSCIENCE,1997,1478578920SKINNER,DMMOLTINGANDREGENERATIONINBLISS,DOE,MANTEL,LHEDSJ,THEBIOLOGYOFCRUSTACEAACADEMICPRESS,N
15、EWYORK,1985PP4314621SPAZIANIE,WATSONRD,MATTSONMP,ETALECDYSTERIODBIOSYNTHESISINTHECRUSTACEANYORGANANDCONTROLBYANEYESTALKNEUROPEPTIDEJEXPZOOL,1989,252327128222UMPHREY,HR,LEE,KJ,WATSON,RD,ETALMOLECULARCLONINGOFACDNAENCODINGMOLTINHIBITINGHORMONEOFTHECRAB,CANCERMAGISTERJMOLECELLENDCRINOLO,1998,1361451492
16、3WEBSTER,SG,AMINACIDSEQUENCEOFPUTATIVEMOLTINHIBITINGHORMONEFROMTHECRABCARCINUSMAENASJPROCBIOLSCI,1991,24424725224WEIDEMANNW,GROMOLLJ,KELLERRCLONINGANDSEQUENCEANALYSISOFCDNAFORPRECURSOROFACRUSTACEANHYPERGLYCEMICHORMONEJFEBSLETT,1989,25701313425YANGWJ,AIDAK,NAGASAWAH,AMINACIDSEQUENCESOFAHYPERGLYCEMICHORMONEANDITSRELATEDPEPTIDESFROMTHEKURUMAPRAWN,PENAEUSJAPONICUSJAQUACULTURE,1995,13520521226YANGWJ,AIDAK,TERAUCHIA,ETALAMINACIDSEQUENCEOFAPEPTIDEWITHMOLTINIHIBITINGACTIVITYFROMTHEKURUMAPRAWNPENAEUSJAPONICUSJPEPTIDES,1996,17197202
