1、i 本科毕业论文 （ 20 届） 食品科学与工程 桑叶中不同提取物抑菌作用的研究 摘 要 本论文研究了桑叶 （ Mulberry） 对金黄色葡萄球菌 （ Staphylococcus aureus）、ii 大肠杆菌（ E.coli）、枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis） 的抑菌效果。实验从观察供试菌种的生长情况、抑菌圈直径长度、桑叶提取物最低抑菌浓度（ MIC）这几个方面来进行研究。通过滤纸片 扩散 法观察 5 种 提取物 （浓缩液、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、剩余相） 对金黄色葡萄球菌 （ Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（ E.coli）、枯草芽孢
2、杆菌（ Bacillus subtilis） 的抑菌效果，并测定其抑菌圈直径。实验结果表明：桑叶提取液对供试金黄色葡萄球菌 （ Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（ E.coli）、枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）都 有明显的抑菌效果 ，抑菌强度为：正丁醇相乙酸乙酯相浓缩液石油醚相剩余相。 并且 ，用正丁醇相对其三种供试菌种进行 最低抑菌浓度 （ MIC）的测定，分别为 ：金黄色葡萄球菌 （ Staphylococcus aureus） 0.510-2（ g 浸膏 /mL） ，大肠杆菌（ E.coli）1.010-2（ g 浸膏 /mL） ，枯草芽孢杆菌
3、（ Bacillus subtilis） 0. 510-2（ g 浸膏 /mL） 。 本文又对桑叶各提取物中黄酮类化合物进行了含量测定，显示桑叶提取物中黄酮类化合物含量与提取物对供试菌种的抑制作用存在着一定正相关性。桑叶提取物中所含黄酮类化合物越高，抑菌效果越好。 关键词： 桑叶；黄酮；抑菌；提取液； MIC；分级萃取 ABSTRACT In this study,we analyzed the inhibitory effect of the Mulberry leaves on Staphylococcus aureus, E.coli and Bacillus subtilis. The
4、 experiment researched the iii growth, length of inhibition zone diameter and MIC.We observed five extract (concentrated liquid, petroleum ether, ethyl acetate, butanol phase, and the remaining phase) which effected on the inhibitory of Staphylococcus aureus, E.coli and Bacillus subtilis by filter p
5、aper diffusion method, and recorded results. The results showed that: mulberry extract was effective in controlling Staphylococcus aureus, E.coli and Bacillus subtilis, the antibacterial activity was: butanol phase acetic acid Ethyl phase concentrate petroleum ether remaining phase. Besides, with bu
6、tanol relative to the seven tested strains MIC determination, were: Staphylococcus aureus 0.5 10-2 (g / mL), E.coli 1.010-2 (g / mL)and Bacillus subtilis 0.5 10-2 (g / mL). Flavonoids content in different fractions were determined .The results showed that the relationship between flavonoid content a
7、nd antibacterial avtivity was a certain positive correlation. Keywords: mulberry; flavonoids; antibacterial; extract; MIC; grade extraction I 目 录 1 前言 . 1 2 材料 . 2 2.1 材料、试剂与仪器 . 2 2.2 供试菌种 . 2 2.3 培养基 . 2 2.4 主要实验设备 . 2 3 实验方法 . 3 3.1 原料的处理 . 3 3.2 培 养基的配制 . 3 3.3 桑叶提取液的制备 . 3 3.4 供试菌种的配制 . 3 3.5 菌
8、悬液的制备 . 3 3.6 滤纸片扩散法 . 4 3.7 标准曲线的绘制 . 4 3.8 桑叶提取物中黄酮含量的测定 . 5 3.9 桑叶提取液最低抑菌浓度（ MIC）的测定 . 5 4 结果与分析 . 5 4.1 桑叶乙醇提取液对供试微生物的抑制作用 . 5 4.2 桑叶提取液对供试微生物的抑制效果 . 7 4.2.1 桑叶提取的抑菌圈直径大小 . 7 4.2.2 标准曲线 . 8 4.2.3 桑叶提取液中黄酮类 化合物含量的测定 . 8 4.3 桑叶正丁醇提取液最低抑菌浓度（ MIC） . 8 5 总结 . 8 参考文献 . 10 致 谢 .错误 !未定义书签。 附录 1 文献综述 .错误
9、 !未定义书签。 附录 2 外文翻译 .错误 !未定义书签。 1 1 前言 桑叶（ Mulberry）原产于我国和朝鲜 。如今在全球大约有 16 种，现分布于北温带、亚洲热带和非洲热带及美洲地区。我国就约有 11 种，分布于全国大部分地区，以江苏、浙江等南方养蚕地区产量较大 1。我国是世界上最大的桑树种植国，桑树在我国已有 4000 多年的历史，主要有白桑（ Morus alba）、华桑(M.cathayana)、山桑 (M.diabolica)、蒙桑 (M.Mongolic)等 10 多个品种。 2 桑叶是桑科植物 桑 的干燥叶，又有别名为家桑、荆桑、桑椹树、黄桑等，其品质优越，资源丰富，一
10、般在初霜后采收。桑叶可以用来养蚕，也是防沙固沙的植物，同时也可以用于药理，在我国是一味常见的中药药材，中医又称之为 “ 铁扇子 ” 3。桑叶自古以来就被人认为有疏散风热，清肺润燥，平抑肝阳，清肝明目，凉血止血的功效 4-5。经现代的药理理论和临床试验证明，桑叶对降血糖、降血脂、降胆固醇有明显疗效；还可解痉、抗溃疡 6、镇咳 7、清楚自由基，抗衰老 8、抗病毒、抗炎 9、抗菌、抗凝血 10，并对丝虫病有预防作用 11，改善 消化系统、心血管系统 12的功能。 桑叶具有抑菌作用，主要是由于酚类物质破坏了细胞壁及细胞膜的完整性，导致微生物细胞释放胞内成分，引起膜的电子传递、营养吸收、核苷酸合成及AT
11、P活性等功能障碍，从而抑制微生物的生长。桑叶中含有多种酚类化合物，主要是黄酮类化合物，如槲皮素、芸香苷等 13。桑叶水抽提液浓度（ 31mg/mL）体外有抗钩端螺旋体作用，桑叶中的植物防御素有抗微生物作用。 桑叶除了在药理上具有应用价值外，还在化妆品方面作为原料。 近年来的研究证明，桑叶有良好的护肤美容作用 14，特别是对脸部的痤疮、 褐色斑都有比较好的疗效。对改善和调节皮肤组织的新陈代谢，特别是抑制色素沉着的发生和发展均具有良好的作用。此外，用桑叶沐浴也是很好的美容浴方。它性凉滋润，护肤而不脱脂，对皮肤粗糙的人是绝佳的选择。 用桑叶混合而成的饲料具有很多优点，并在畜牧业上的应用日趋广泛。给鸡
12、喂桑叶饲料可改善其肉质、香味、和口感 15。此外。严冰等 16研究表明反刍动物对桑叶有很高的消化率。 因此桑叶是一类具有较高开发价值的物质，它既可防治疫病，又能促进生长，还可节约饲料，提高效益，可谓是一举数得。 根据桑叶的抑菌性质，本论文对其2 从观 察 供试菌种的生长情况、抑菌圈直径长度、桑叶 正丁醇 提取物最低抑菌浓度（ MIC） 以及提取液中黄酮含量对抑菌作用的正相关性 这几个方面进行 了 研究 分析。 2 实验主要仪器与材料 2.1 试剂与仪器 桑叶（ Mulberry） (购于药房中 )； 分液漏斗、酒精灯、电磁炉、烧杯、锥形瓶、玻璃棒、涂布棒、接种环、三角瓶、试管 。 本实验采用的
13、主要试剂见表 1。 表 1 主要实验试剂 Tab 1 Main Reagents 试剂名称 等级 产地 乙醇（ 95%） 分析纯 溧阳市光源工贸有限公司 石油醚 分析纯 杭州高晶精细化工有限公 司 乙酸乙酯 分析纯 天津市博迪化工有限公司 正丁醇 分析纯 上海试剂四厂昆山分厂 芦丁 标准物 上海国药集团 2.2 供试菌种 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（自备）。 2.3 培养基 营养肉汤培养基（生化试剂 BR）、 营养琼脂（生化试剂 BR、国药集团化学试剂有限公司） 2.4 主要实验设备 HH-4 数显恒温水浴锅（金坛市城西春兰实验仪器厂）、 PL203 电子精密天平（梅特勒一托利仪器
14、有限公司）、 RE-52A 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅 、 紫外可见分光光度计 。 3 3 实验方法 3.1 原料的处理 把桑叶 （ Mulberry）粉碎，过 100 目筛，放入干燥器中备用。 3.2 培养基的配制 营养肉汤培养基的配制：牛肉膏 3g，蛋白胨 5g， NaCl 5g，水 1000mL，加热溶解后分装三角瓶内， 121 灭菌 20min，备用 营养琼脂培养基的配制：取 19g 的营养琼脂于 900mL 的蒸馏水中。加热溶解后分装锥形瓶内，塞上盖子，用报纸包好，于高压灭菌锅内灭菌（ 121 ， 15min）后，倒于灭菌好的培养皿内（ 20mL/个）
15、，冷却，备用。 3.3 桑叶提取液的制备 取粉碎好的样品 15g，加入 65%乙醇 450mL，置于温度为 80 的恒温水浴锅中，其间要不断的搅拌，提取 1h，过滤，滤液冷藏备用。 将 上述 取得的滤液倒入旋转蒸发仪中浓缩至无乙醇，取浓缩液（样品 1）。 桑叶提取液浓缩后（样品 1）使用极性不同的有机溶剂经行 分级 萃取。其步骤为： 石油醚萃取，分两层。上层为石油醚层浓缩后为石油醚相（样品 2），下层为水相。水相浓缩后再用水饱和乙酸乙酯萃取，上层为水饱和乙酸乙酯层旋转浓缩后为水饱和乙酸乙酯相（样品 3），下层为水相。水相旋转浓缩后再用正丁醇萃取，上层萃取液弄旋转蒸发后为正丁醇相（样品 4），下
16、层旋转浓缩后 浓缩为剩余相（样品 5）。（每次萃取之后的旋转浓缩是为了排除之后在试验中石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对供试菌抑菌作用的影响，因此，每次都要浓缩至无有机溶剂为止 。另外，旋转蒸发仪在 50， 40 转 /min 下使用 ）。操作流程见图 1。 3.4 供试菌种的配制 将所有供试菌种接种于相对应的培养皿上平板培养，每种培养五皿。置于30 的恒温培养箱内培养 24h。每种菌株选取一皿供测试用，其余备用。 3.5 菌悬液的制备 用 摇瓶法制备，步骤为： 接种环挑取一环菌体或孢子放入装有 50mL 的肉汤培养基三角瓶中摇匀 ， 置于 30恒温培养箱中培养 24h 后取出使用，然后用 无菌生理盐
17、水 稀释成 10-1、 10-2、 10-3、 10-4 等不同浓度梯度的菌悬液 ， 各吸取 2mL分别加入已灭菌冷却的平面培养基中涂布均匀后与 30恒温培养箱中培 养 24h，4 根据观察菌种生长情况选取适宜的菌悬液浓度，备用。 17 取浓缩液（样品 1） 石油醚萃取 浓缩 石油醚相（样品 2） 剩余相 1 水饱和乙酸乙酯萃取 浓缩 乙酸乙酯相（样品 3） 剩余相 2 正丁醇萃取 浓缩 正丁醇相（样品 4） 剩余相 3（样品 5） 图 1 萃取流程图 Fig 1 Extraction flow chart 3.6 滤纸片扩散法 18 用无菌吸管吸取每种菌悬液 0.2mL 加入到上述配制好的平
18、板中，用无菌涂布棒均匀涂布。 （ 1）用无菌镊子将已灭菌的小圆 滤纸片分别浸入装有各种提取物溶液的烧杯中浸湿； （ 2）取出滤纸片时保证过滤片所含提取物溶液量基本一致，并在烧杯内壁滤去多余提取物溶液。经行无菌操作，将滤纸片贴放在平皿上； （ 3）将上述贴好滤纸片的含菌平板倒置放于 30 温室中， 24h 后取出观察抑菌圈得大小，并记录结果。 3.7 标准曲线的绘制 用 NaNO2 - A l (NO3 )3比色法，制作以芦丁为黄酮的标准曲线 19，具体制作5 方法为：准确称取芦丁（黄酮标准品）标准样 品 0.025 g置于三角瓶中，用 30%乙醇定容至 250mL，得到 0.1mg/mL芦丁标
19、准 溶液。分别吸取芦丁对照样品 1.0mL，1.5mL， 2 ml， 2.5mL， 3.0 mL， 3.5mL置于三角瓶中，加入 5%的 NaNO20.5 mL，摇匀，放置 6min后加入 10%Al（ NO3） 3溶液 0.5mL，摇匀放置 6min后加入 4%NaOH溶液 4mL，而后将各个不同稀释度的标准溶液用紫外 可见分光光度计在 500nm处进行测定芦丁的吸光值。 3.8 桑叶提取物中黄酮含量的测定 取 3.3 中已经制备好的五种样品液各 1mL 于试管中，稀释 10 倍，备用。 分别取上述已稀释好的样品液 1mL 于分光光度计中测定分光光度值，记录结果。对 照 3.7 所 制作的标
20、准曲线查出芦丁浓度。所得结果乘以稀释倍（ 10）数即为桑叶提取液的黄酮类化合物含量。 桑叶提取物黄酮类化合物含量芦丁浓度 稀释倍数（ 10 倍） 3.9 桑 叶 提取液最低抑菌浓度（ MIC）的测定 称取正丁醇萃取浓缩后所得的正丁醇相浸膏，用无菌水溶解，并过滤，制备成浓度为 4.010-2g 浸膏 /mL 的原始样品溶液。采用二倍稀释法 20制备不同浓度梯度的样品溶液。其步骤为：准备 4 支已灭菌的试管，编号，每管各加入无菌水5mL，在 1 号管内加入 5mL 4.010-2g 浸膏 /mL 的样品液，混匀后吸 取 5mL 到 2号管，混匀后再吸取 5mL 到 3 号管，依次类推至 4 号管，
21、得到待测样品的浓度分别为 1 号管 2.010-2g 浸膏 /mL； 2 号管 1.010-2g 浸膏 /mL； 3 号管 0.510-2g 浸膏 /mL； 4 号管 0.2510-2g 浸膏 /mL。 采用琼脂平板稀释法，每个平皿中分别加入上述已制备好的 4 中不同浓度的待测样品 2mL，并加入 18mL，约 45 左右的已灭菌的营养琼脂培养基，混匀、待凝固后，每皿加入 0.2mL（ 3.0106cfu/mL）菌悬液， 3 组平行，均匀涂布 ，静置 20min 后，置 30 培养箱中培养 24h 后， 记录结果。 4 结果与分析 4.1 桑叶乙醇提取液对供试微生物的抑制作用 各种提取物对供试的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌都有抑菌作用。 实验现象表明 ：金黄色葡萄球菌 、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌 周围 的 抑菌圈界限比较明显，有清晰的抑菌圈出现，肉眼容易观察。可见抑菌效果图 2 和图 3。 6 图 2 乙酸乙酯相萃取物抑制大肠杆菌效果图 Fig 2 Ethyl acetate inhibit the effects of E.coli 图 3 乙酸乙酯相萃取物抑制金黄色葡萄球菌效果图 Fig 3 Ethyl acetate inhibit the effects of Staphylococcus aureus
