1、 1 本科毕业论文外文翻译 译文： 2 -戊基吡啶在大豆分离蛋白 风味 中的作用 来源： JAOCS， Vol.74， 1997,no.12 W.L.Boatright A.D.Crum Animal Science Department， University of Kentucky， Lexington， Kentucky 40546-0215 摘要： 用带有三种不同极性固定相毛细管柱的气相色谱 /嗅觉分析法来鉴定 2 种商业大豆分离蛋白（ SPI）的 总脂质 。利用 气相色谱 /质量光谱法分离脂质，并结合 Kovats 索引来鉴定风味化合 物，得到能区分各种化合物的质量光谱。用化合物在三
2、个固定相上的停 留时间、 气味强度和与标准物对比后得到的风味描述来代替用质量光谱来区分各种化合物。被检测到的 主要风味化合物有 2-甲基丁酸甲酯、己醛、丁酸和 2-戊基吡啶。后续的 感官评定表明在 2种 SPI(0.28和 1.01 ppm)中，即使低含量 (0.000012ppm)的 2-戊基吡啶也是产生令人厌恶风味（在水中有刺激喉咙和青草味）的主要 成分 。它在 2 种 SPI 中的含量分别是其气味阈值的23,333 和 84,167倍。而 己醛的在 2中 SPI中的含量是其风味阈值 112 和 201倍，2 -戊基呋喃 在 2中 SPI中的含量是其风味阈值 433和 592倍，这说明这两
3、种化合物对 SPI风味的影响作用较小。 关键词： 风味分析、嗅觉分析、 2-戊基吡啶、大豆分离蛋白。 大豆蛋白产品的风味（经常被描述为有豆腥味，强烈的苦味，刺激咽喉的味道和辛辣味），是限制大豆蛋白在人类食品中应用的 最难以 克服的问题。 烃类 、不饱和脂肪酸、胺类和乙醇、氧化卵磷脂（ PC）、石碳酸、异黄酮 、 皂角苷都被认为是产生大豆产品有不良风味的原因。 利用 气相层析 /质谱分析法（ GC/MS） 顶空进样， 来分析未被加热或已加热的大豆分离蛋白（ SPI），检测出了具有挥发性的化合物。这种方法定性地提供了易挥发性化合物的阈值范围。但是产生大豆产品不良风味的 具体 化合物并没有被分辨出来
4、。同样的， 也 没有确切的证据证明水解大豆蛋白得到的挥发性化合物，对大豆产品的风味起作用。 研究产生大豆蛋白苦味 /涩味的这些难挥发性的化合物的关键在于用乙醇溶2 液或己醛和乙醇的混合液来提取这些化合物。 Honing et al（ 13）用加热的 95%的乙醇和乙醇、乙烷共沸物来从脱脂大豆中分离和萃取这些化合物。连续的分馏实验得到一种能产生了强烈的苦味的混合物，但在这部分混合物中得到的化合物（包括大豆异黄酮）并没有产生苦涩的风味。研究者表明产生这种令人不愉快风味的化合物含量较少且并没有被分离检测。 Araieral.（ 12）发现了七种与大豆风味相关的 酚酸 。 Rackiseral.（ 1
5、4）和 Maga、Lorenz（ 15）后来的研究表明 大豆中 的 酚酸的阈值接近 40-90ppm。但是，实验过程的改善实际上只是减少了 SPI中这些 酚 酸的含量，结果并没有对 SPI的苦味和收敛味有很大的改善。 用 70%的酒精提取大豆蛋白中产生的令人不愉快风味的化合物，这项调查表明大豆皂甙和大豆异黄酮对整个大豆产品的苦味和收敛味起 作用，其中 A 类皂甙的作用最大。这项调查提供了多种大豆皂角苷和异黄酮的阈值和在水中的风味特点。在整个 SPI中皂角苷的含量是 0.76%，其中大约 1/6是 A类大豆皂角苷。由于 A类皂角苷在大豆产品中的含量大约是它本身风味阈值的 1000倍，所以 A类皂
6、角苷对大豆蛋白产生苦涩味其主要作用。 在悬浮水溶液中存在的氧化磷酸盐被认为当它的风味阈值是 0.006%有增强苦味的作用。由于脱脂的大豆粉含有大约 0.08%的氧化磷酸盐（是阈值的 13倍），这就有可能增加了大豆产品的苦涩味。但是， Honingetal.（ 13） 发现从脱脂大豆粉中分离出来的磷脂没有产生这种风味。 大豆蛋白除了有强烈的苦味和收敛味之外，还能产生 “豆腥味 ”，产生这种风味的化合物被认为是脂肪氧化酶和脂肪氧化产物，包括低分子量的酸、乙醇、醛类、酮类和呋喃。与大豆蛋白产品有关的挥发性醛类、酮类等化合物的含量通常是样品在顶端空隙中的十亿分之一。在被加热或未被加热的 SPI中检测到
7、的挥发性醛类，乙醛和乙醇的含量最高。 Sessa 和 Rackis（ 20）表明大豆中的豆腥味主要是由 2-戊基呋喃、 3-顺式庚醛和 1-丙酮产生。而这些化合物中，只有 2-戊基呋喃在后来通过顶空实验中被检测到。 这 项最新的研究主要是检测从 SPI 中提取出的总脂肪并检测哪种化合物对大豆产品的风味影响最主要。确定从 SPI中分离得到的化合物的数量以及确定它们在水中的阈值与确定 SPI风味相关新有重要作用。 3 材料和方法 材料：从 Archer Daniels Midland 公司得到的 SPI，像 Pro Fam 970一样设计（用不同的编码条来区分样品 A 和 B）。丁酸、 2-甲基丁
8、酸甲酯和醛从 Sigma Chemical公司得到。 Lancaster Synthesis研究公司提供 2-戊基吡啶。 Bedoukian研究公司捐赠 2-戊基呋喃。 脂质分离。用前面提到过的 Bligh（ 23， 24）和 Dyer（ 22）改善后的方法来从 SPI中提取脂质。每 2克 SPI提取两次，每次用 20ml氯仿 /醇 /水的混合液（体积比 5： 10： 4）。 用旋转蒸发器在 50 ， 0.7kg/cm2真空度下提取脂质，然后用流动的干燥氮气流来去除最后几毫升溶剂得到干燥物。最后将样品放在 300L 的二氯甲烯中并保存在 -15 下。整个提取过程，样品只和用甲醇 /氯仿（体积比
9、为 2： 1）和氯仿溶液漂洗过的玻璃瓶或不黏锅接触。为了检查确定化合物在提取过程中的稳定性，需要反复地添加丁基羟基甲苯和二丁 基，使最后的提取的脂质含有大约250ppm的抗氧化剂（根据 SPI含有 4%的脂质）。用不含 SPI的重复提取物作为对照。 气液色谱，嗅觉和质量光谱法。对 SPI中产生的令人不愉快的化合物的分析采用配备有氢气气体色谱检测仪以及用于数据分析的 Intelligent Interface970 模型的自动气体色谱仪 Perkin-Elmer（ Norwalk， CT）来完成。而嗅觉鉴定，把大约 25mg，与 SPI相一致的，提取得到的脂质加入到注射器里面，连续喷射 30秒。
10、注射器衬里（在 210 下）用硅烷化的玻璃包裹，每个样品使用后都 要更换衬里。气体出口可以采用 0.25m宽度的 Hewlett-Packard（ Palo Alto， CA） HP-1圆柱毛细管（ 30m0.25mm），或 0.25m宽度的 SE-54毛细管（ 30m0.25mm），或者用一个 DB-225型号的毛细管（ 30m0.25mm）和一个 0.25m宽度的 O.S.-2系统的DB-225 圆柱形毛细管分流。分流器出口的 1/3 直接与 FID 检测器相连（保持温度在 250 ），另外 2/3链接到嗅觉部位。氦气在圆柱中的流速是 1.0mL/min，提取的气体在分流器中运动速度是 4
11、.0 mL/min。 Kovats 表明从 FID 的应答可见被检测的风味都是 C10 或 C7-C25 的链烷烃。在被检测风味和 FID应答之间没有可预见的延误。 气体 -脂质套色板质量光谱法在 Hewlett-Packard 的 G1800GCD 模型系统4 （ Wilmington， DE）中完成，这个系统配备有电子离子化侦探仪和 G1030A模型化学控制器，还有一系列圆柱形毛细管用来嗅闻。在所有 GC 系统中管柱的温度要在 40 下保持 5min，然后以 3 /min的速度上升到 150 ，接着以 20 /min的速度上升到 230 。运动速度为 1.0 mL/min的高纯度的氦气作为
12、载体。用 EDI来检测质量范围在 35-175m/z 之间的物质。离子化的电压是 70eV。化合物以一个特征离子为基础确保从任何邻近的溶液中能充分得到相关的化合物来进行定量分析。这些特征离子有： 2-戊基吡啶， 2-戊基呋喃，己醛，丁酸和 2-甲基丁酸甲酯。这些离子的表现都是相一致的。脂质化合物之间可以通过质量光谱、悬浮停留时间、以及嗅觉反应来进行鉴别。 尺寸排斥套色板（ SEC）。 SEC 在用 100%的氯仿作为流动相的 Sephadex LH-20系统（ Pharmacia， Piscataway， NJ）中 使用。这个过程的完成需要一个带有在紫外线覆盖下的与 1.090cm 玻璃管柱相
13、连的 100L 的注射圈的型号为2150LKB 的高压液相色谱泵。将型号为 160 的 Beckman 模型的吸光值设置为254nm 处测定吸光峰值。化合物的移动的速度是 0.8 mL/min。用 -胡萝卜素（ 537MW）、三苯基磷酸盐（ 326MW），和 2-戊基吡啶（ 149MW）（图 1）来标定分子量。每天的 SEC 都在变化，圆柱管用三苯基磷酸盐来校准。 高压液相色谱（ HPLC）。将 100mg 提取得到的脂质放在含有氯仿的硅固相暗盒提取器中，并有 5mL氯仿流过暗盒。样品用 4mL 的 15%的甲醇连续洗涤，5 并在氯仿中收集，然后在 50 的氮流下干燥，最后再搁置在 100L2
14、0%溶于己烷的异丙基乙醇中。 HPLC 的分离在配备有两个 HPXL模型泵、一个型号为 805压力单元模 型、一个镍钼铁合金制成的 HPLC 控制器、一个紫外线设置在 260nm处的镍钼铁合金制成的 UV-D 模型和一个 50L 的注射环的 Rainin Gradient HPLC 模型中完成。脂质的分离在带有一个 5m硅化的 Dynamax Microsorb 管柱中进行。脂质的流速为 1.0mL/min 使溶液梯度从开始的占己醛中的体积含量为1.5% IPA经过 20min到达 6%IPA。 风味阈值评价。一个年龄在 24到 54岁之间由 10个女性和 2个男性组成的12 人专门小组，首先
15、让他们通过开放式小组讨论和个人评价熟悉各种化合物的典型 风味和气味。这样做是为了给每个成员建立对各种化合物的相同描述和确定参加的成员是否有能力进行化合物评价。每种化合物的评价都是在水中进行且含量与在 SPI中的含量相一致，但是除了 2-戊基吡啶，因为这种令人厌恶的风味，最原始的评价水平只有 0.05ppm。如果超过 85%的小组人员不能检测出原始浓度中的化合物，那么对这种化合物没有必要做进一步的研究。只有当在安全水平下基本上能被认知的化合物才能做感官评价。用来进行个人感官评定的空间需要配备有个人操作台和样品传送门来使空间与准备室隔开。 为了检测化合物的风味阈值，给评价小 组成员准备从 Barn
16、stead Nanopure 4-Module系统中得到的样品水溶液，并且装在 1.5盎司的玻璃瓶中。每个评价员对在十个因素条件下逐渐增加浓度的不同化合物进行评价，每个浓度评价六次。然后采用 PROC NLIN 来为每个评价人员提供阈值数据分析，再用最新的方法分析每种化合物各自适应的非线性衰退模型。为了给每个评价人员计算可检测性的风味阈值，每个化合物在每个浓度的正确应答比例都要计算出来。如果一个评价员对于给定浓度的应答率正确率是 50%，那么就认为这中特征化合物对着个评价员来说是可检测阈值。将个 人计算得到的风味阈值用几何计算方法来得到小组的风味阈值。 结论和讨论 这个调查研究用 GC、 MS
17、 和嗅觉系统这些技术对从 SPI 中提取的挥发性脂质进行评价。这种技术已经被用来对其他食物的成分分析，但还没有发表有关于大豆蛋白产品成分的任何数据。由于使用嗅觉检测，所以这种这种方法的使用范6 围被限制。对大豆蛋白产品风味有影响的化合物主要通过原始接收器来感知。同样，沸腾点温度低于溶液的样品（二氯甲烷， 40 ）和那些不容易被固定相截留的样品都不能被检测不出来。尽管如此，通过对化合物变动范围进行分析的合适方法的考虑，并结合 GC、 MS、嗅觉这些技术可提供一个可以被认知的结果。 为了使用 GC/MS/嗅觉技术实现对 SPI中提取的脂质进行评价，对两种不同生产日期的商业 SPI进行定量萃取。这些
18、分离物的组成与先前调查的商业分离物相似。这些分离物在干燥的条件下称量得到包含了 3.9%-4.1%的脂质。从各种大豆产品中提取的总脂质用 GC/嗅觉结合 GC/MS技术来分析。用嗅觉检测出的化合物与采用 Kovat 索引给出的在固定相的质量光谱相关联。在 Kovats 索引中还有 1500多种的化合物没有被检测到。这种分析方法使每个样品在不同极（ HP-1，SE-54， DB-225）的三个不同固定相中都重复做两次下重复两次。表一列出了截然不同的检测到的风味，以及他们的相关强度，和他们的 Kovat索引。在表一中描述的清楚的风味区别以及它们的相关强度，和在 SPI中检测到的相似。在不同的固定相
19、之间得到的结果没有必然的联系。比如说，蘑菇的风味在 HP-1和 SE-54管柱中能被检测到，但在 DB-225管柱中不能被检测到。产生蘑菇风味不是由于含有 3-庚醇，但这种化合物通常与大豆产品有联系。清漆味、豆腥味和烧焦的风味可以在 DB-225圆柱中被检测到但是不能在另外两种固定相检测出中。这些 矛盾有可能是由于风味太温和，也有可能是由于在没有极性的管柱与中等或高极性的管柱之间的停留时间不同。这些所有被检测到的风味强度中等或强烈的化合物都没有注重管柱的使用。 7 通过联系 Kovat索引，在三个固定相的中观察到的风味与鉴定得到的化合物相似，并在表 2中列出。有的到与 Kovat索引中提到的质
20、量光谱相一致的一些化合物没有检测到，这可能是由于循环的漂洗原因。而有时候的到大量重复的质量光谱，可能是由于文件中缺少相关联的质量光谱或是检测得到质量光谱的材料不充分。以前化合物根据它们的质量光谱 暂时地加以区分，而现在它们的停留时间可以被作为更可靠的区分标准， Kovat索引、风味强度和风味描述都可以用 GC/嗅觉技术和 GC/MS来确定。这些被检测到的化合物在最后脂质分离中的浓度与在分离过程中添加抗氧化剂后得到的浓度相等。这表明在分离过程中并没有发生氧化作用而是脂质的含量下降。 8 由于微量的化合物也能对风味产生巨大的影响，这就需要保证对大豆产品的风味产生极大作用的化合物没有变成一些复杂混合
21、脂质暴露出来，这些脂质主要是卵磷脂， 210 下存在于 GC 注射器中。为了使可能产生的工艺加工产物减少到 最少，使波长小的化合物（小于等于 350Daltons，洗脱超过48min）在易溶于油脂的 Sephadex LH-20（表一）上形成凝胶透过从而与波长大的化合物（如卵磷脂，波长为 760）分离。波长小于 350 的化合物可以被GC/嗅觉技术和 GC/MS技术分离鉴定。每一种风味物质都可以用这种方法鉴定得到。峰值在 96min 的分离物是最主要的产物（波长为 126）。由于在氧存在的条件下，加热氨和 2， 4-葵二烯醛可以形成 2-戊基吡啶（式子一），所以我们要采取预防措施来保证 2-戊
22、基吡啶在 GC喷射器中没有形成。从 SPI中提 取的总脂质先用硅固相分解，再用 100%的氯仿漂洗提取非极性脂质，最后用溶于氯仿的 15%的甲醇冲洗中间极性的化合物。整个过程用流动甲醇漂洗的 2-戊基吡啶最为标准。得到的这部分脂质然后放在普通相的 HPLC中，再用 GC/MS收集和分析，得到与作为标准的 2-戊基吡啶有相一致的停留时间的化合物。部分从 SPI 中提取的脂质会含有 2-戊基吡啶，它的量与最原始总脂质中含量一样。这表明 2-戊基吡啶并不是 GC 分析过程中的产物。另外在溶液洗涤过的玻璃杯和不黏锅容器中做出合适的空白，在残余的乙基酯中存在的 2-戊基吡啶表明它也不是在提 取过程氯仿、
23、甲醇、水的产物。这个地数量的原因可能是乙基酯的低提取率。 在从 SPI 中得到的风味化合物被鉴定后，溶解于在水中，对它们的气味特征进行评价。 2-戊基呋喃在评价过程中被认为是大豆产品产生豆腥味的主要物质（但是并没有在 GC/MS 中检测到）。表三给出了各种化合物的风味描述、阈值和在 SPI 中的主要含量。由于一些化合物的风味阈值比它们在 SPI9 中的含量要高，所以像 2-甲基丁酸甲酯这样的化合物没有进一步做感官特征研究的需要。这部分研究的主要目的在于检测令人产生不愉快风味的化合物的浓度是在 SPI中的 1/10。（也就 是 10%的商业 SPI溶液可以检测出强烈的令人不愉快的味道）。 在两种
24、 SPI 样品主要成分中， 2-戊基吡啶的含量比它的阈值高的原因是23333和 84167。此外，当它在水中含量为 0.05ppm时，它的气味特征极其令人反感，被评价小组成员描述成刺激喉咙的和夹带鱼腥臭的青草味。对比来看，在 SPI 中 2-戊基呋喃的浓度比它的风味评价阈值高出 433-592 倍，己醛的浓度比它评价的风味阈值高出 112-201 倍。因此，不管是 2-戊基呋喃还是己醛都对 10%浓度的 SPI的风味产生极大的作用。 在 SPI 中检测到的其他吡 啶类化合物主要有 2-甲基吡啶、 2-甲基 -6-丙基吡啶、和 2-甲基 -5丁基吡啶。这些化合物被检测出来含量低于 2-戊基吡啶，
25、但对风味的影响却很大。这些在大豆产品中含有的吡啶类化合物先前没有被报道过。 己醛和 2-戊基呋喃的风味阈值和它们溶解在水中评价得到的风味阈值相接近。而 2-戊基吡啶的风味阈值（ 0.000012ppm）大约比报道的评价风味阈值（ 0.0006ppm）低 50 倍。而且它的风味特征，被 Butteryetal 描述为油腻的，这与我们评价小组得到的刺激喉咙的味道有很大的差别。这些调查研究表明了，当 2-戊基吡啶 被吞咽时，会同时引起口腔区域和嗅觉上皮的感官反应。10 2-戊基呋喃的浓度在阈值之上时的风味相对来说是温和的。这大概就是为什么用嗅觉不能清楚地分辨风味的原因。 报告指出 2-戊基吡啶通常存
26、在于焙烤或烧烤的肉类食品中。 Butteryetal在焙烤的羊肉脂肪中发现了 14中烷基吡啶类化合物。其中最主要的是 2-戊基吡啶。他们认为羊脂与羊肉常常产生令人不愉快的的风味与这些烷基吡啶有关。同样的，烤牛肉和烤鸡肉中也存在着 2-戊基吡啶。但这些研究并没有提供数据。 形成 2-戊基吡啶的一个可能机制是 2， 4-葵二烯醛（在 SPI中含量大约 是0.022-0.036ppm）和氨反应（方程一）。 Bains 和 Mlotkiewica 提出吡啶类化合物的形成决定于氨的利用率，并发现比起其他动物的肉，羊肉中含有较高的氨基酸浓度和较低的糖类。他们认为较高的蛋白质成分和相对较少的糖成分使氨与蛋白
27、质反应的概率高于美拉德反应。在美拉德反应中，氨基酸分解后的氮更多是合成一些吡嗪类乎化合物，这些化合物能产生令人愉快的风味。后来牛肉脂肪和焦糖的反应表明产生了 2-丁基吡啶和 2-戊基吡啶。与含有糖类的反应系统能产生令人愉快的味道相比，这个反应产生了令人不满意的风味。另外含有 氨基酸和鸡蛋的卵磷脂反应也可以产生 2-戊基吡啶。而且与半胱氨酸混合产生的 2-戊基吡啶比与甘氨酸和赖氨酸混合反应产生的量多20-100 倍。氨可以认为是半胱氨酸的分解产物。同样，甘氨酸、赖氨酸和核糖的混合可以产生比与半胱氨酸混合后更多的烷基吡啶，这表明氨不是使氮进入吡嗪中的主要媒介。这个反应系统还需要的条件就是加热（ 200 4h或者是 140 2h）。 一些风味化合物已经被鉴别并在表一中列出，还有一些风味化合物还没有被鉴别出来。而这些已经被发现的风味化合物会作进一步研究。当然，由于强烈 2-戊基吡啶会产生令人不愉快 的风味特征，所以应该减少它在 SPI 中的出现来改善 SPI的风味显得极其重要。 感谢 该项目所需的部分资金由美国肯塔基州大豆促进委员会提供。通过肯塔基州农业实验站的批准出版。
