1、 本科毕业设计 （ 20_ _届） 生物工程 紫色稻生理生化特性研究 摘 要 本 文 以宁波 市余姚河姆渡稻作生物技术有限公司基地种植 的 2 个 水稻品种（紫色稻及其亲本） 为材料，研究 了 不同 类型水稻 品种 的 内在生理生化特性 ，如苯丙氨酸解氨酶（ PAL）、多酚氧化酶（ PPO）、过氧化氢酶（ CAT）、 超氧化物歧化酶（ SOD） 的活性及叶绿素含量等 。 结果表明 紫色水稻叶绿素含量要略高于其亲本，而 苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶、 超氧化物歧化酶 的活性测定表明 从普通杂交水稻突变而来的紫叶水稻除 PAL 活性外， 其它酶活性比普通杂交水稻要高。 关键词： 水稻 ；
2、 生理生化特性；叶色突变体 ABSTRACT In this study, two cultivars of rice（ purple rice and its parent） from Yuyao Hemudu Ningbo were used to investigate the effect on the physiological and biochemical characteristics (including phenylalanine ammonia lyase (PAL), polyphenol oxidase (PPO), catalase (CAT), peroxidas
3、e (POD) activity and chlorophyll content, etc.) of different cultivar. The results showed that the chlorophyll content of the purple rice to be slightly higher than its parent, and for PAL, PPO, CAT, SOD, the purple leaf- mutant, which derived from the mutation of the ordinary hybrid rice, higher th
4、an the normal hybrid rice, in addition to PAL. Key words: Rice; physiological and biochemical characteristics; leaf- mutantI 目 录 1 前言 . 1 1.1 水稻叶色突变体简介 . 1 1.2 水稻叶色突变体的分子机制 . 1 1.2.1 叶绿素生物合成和降解途径中的基因突变 . 1 1.2.2 血红素一光敏色素生色生物途径中基因突变 . 1 1.2.3 与光合系统无直接关系基因突变 . 2 1.3 水稻紫叶突变体的研究进展 . 2 2 材料和方法 . 2 2.1 材料
5、与仪器 . 2 2.1.1 材料 . 2 2.1.2 仪器 . 2 2.1.3 试剂 . 3 2.1.4 其他用品 . 3 2.1.5 主要试剂配制 . 3 2.2 实验方法 . 4 2.2.1 样品预处理 . 4 2.2.2 主要生理生化特性测定 . 4 3 结果与分析 . 7 3.1 苯丙氨酸解氨酶（ PAL）活性评价 . 7 3.2 多酚氧化酶（ PPO）活 性评价 . 8 3.3 过氧化氢酶（ CAT）活性评价 . 9 3.4 超氧化物歧化酶活性（ SOD）活性评价 . 9 3.5 叶绿素含量分析 . 10 4 结论 .11 参考文献 .11 1 1 前言 水稻是最重要的粮食作物之一，
6、水稻是我国最主要的粮食作物，居全国三大粮食作物之首；世界有 1/3 以上的人口以之为主食，如何有效提高水稻产量，已经成为水稻栽培和育种急 需解决的重大课题。通过生物中各种变异，可以筛选出更高品质的动植物新品种 1。 1.1 水稻叶色突变体简介 叶色突变的主要是叶色表型发生了变异，目前分类方法有很多， Gustaftsson根据苗期叶色表型将其分为 5 个主要类型：白化、黄化、浅绿、条纹和斑点。而Awan 等将叶色突变体进一步分为白化、黄化、浅绿、白翠、绿白、黄绿、绿黄和条纹 8 种类型。正常叶色是植物长期进化的结果，而叶色突变通常影响突变体的光合速率，往往会导致植物发育迟缓、竞争力下降，及造成
7、作物减产，严重时，甚至导致植株死亡。 叶色突变是水稻中较常见 的一种突变类型，在水稻功能基因组研究、植物光合作用的生理生化机制研究和遗传育种应用等方面具有无可替代的价值 2。在育种中，叶色突变不仅可以作为标记性状，简化良种繁育和杂交种生产，提高杂交种种子纯度，而且常绿突变体还可为高光效育种提供优良的种质资源；另外，叶色突变体也是光合作用、光形态建成、激素生理、质 -核基因互作以及信号传导途径等水稻光合系统结构、功能及其调控机理研究的理想材料 3。 1.2 水稻叶色突变体的分子机制 水稻叶色突变是生理和遗传共同作用的结果，它的分子机制较为复杂。 Nilon比较了理化诱变 剂诱发单位叶绿素合成缺陷
8、突变体和幼苗生长突变体的频率，认为约有 700 个位点与叶绿素突变有关 2。总的来说，叶色突变就是在一定的环境因素影响下，从而直接或间接的影响叶绿素的合成代谢，最终产生叶色突变的表型。 根据对叶色突变体的研究，目前，对其发生机制主要归纳为以下几点。 1.2.1 叶绿素生物合成和降解途径中的基因突变 绿色植物和某些藻类的叶绿素形成从谷氨酰 tRNA 开始，至叶绿素 a、 b 合成结束 4。叶绿素的生物合成是一个十分复杂的酶促反应过程，其中涉及到的任何一个基因发生突变，都可能会导致叶绿素的合成受到 阻碍，从而显现出不同程度的叶色变异。黄化、浅绿、斑点是由于叶绿素合成镁的鳌合形成部位受阻，如水稻 的
9、 斑马叶 5。 1.2.2 血红素一光敏色素生色生物途径中基因突变 叶绿素生物合成与血红素生物合成是四毗咯生物合成途径的两个分支，原叶琳 Ix 与 Mg2+鳌合产生镁原叶琳 Ix，与 Fe2+鳌合形成血红素，血红素经一系列反应最终形成光敏色素生色团。叶绿素合成速率受细胞内血红素含量影响，若血红素一光敏色素生色团途径受阻、细胞内血红素含量上升，过剩的血红素将反馈抑制叶绿素合成，引起突变体叶色变异 6。 2 1.2.3 与光合 系统无直接关系基因突变 光合系统以外基因变异亦可以引起叶色表型变异，但突变机制尚未得到明确的解释。如质 -核信号传导途径受阻，大量研究表明，细胞核与质体之间存在着一个信号通
10、路，通过这一信号传导，核基因产物可以调控质体基因的转录和翻译，质体的代谢及发育状态也能够影响编码质体蛋白质的类核基因的表达 3。 1.3 水稻紫叶突变体的研究进展 紫叶突变体作为叶色突变体的一种，它的性状识别明显，受环境影响小，遗传性状较稳定。因此，其在水稻分类、遗传研究和育种实践上都有很大的作用。紫叶突变性状大多是由于花青素含量的大量增 加而引起的紫叶突变基因作为标记基因导入不育系实现了杂交水稻种子纯度的室内鉴定，简化了杂交水稻育种的流程 7。 通过紫叶表型不但可以测定种子纯度，还可以在苗期剔除受外源花粉污染的种子和假杂种，并且在良种繁育和杂交育种上有广阔的应用前景。若能将品质和利用价值结合
11、选育出一种品质优良的紫叶突变体，将具有重要意义 8。 对一些紫叶突变体的基因定位、遗传及光合生理特性的研究表明，水稻紫色叶突变体的遗传是由一对或几对隐性的核基因控制的，且它叶色变紫是逐步的。刚长出的新叶片表现为正常的绿色，随后从叶尖向下叶色逐渐的变为 紫色，穗部的也表现出相同的叶色变化规律 9。 总之，对紫色叶色的标记不仅实现了既可简便、经济、快速确定种子纯度，为种子质量预警，又可在制、繁种标一记辅助去杂，并在生产中能一定程度地自动剔除假杂种，在两系杂交水稻的生产应用中的市场应用前景极其广阔。 目前还没见有对紫叶水稻植株的生理生化特性研究，本文以宁波余姚河姆渡水稻基地的 2 个水稻品种（紫色稻
12、及其亲本）为材料，研究了不同品种对内在生理生化特性（ 包括 苯丙氨酸解氨酶（ PAL）、多酚氧化酶（ PPO）、过氧化氢酶（ CAT）、过氧化物酶（ POD）的活性及叶绿素含量等 ）的影响，以期能够为紫色稻的栽培技术研究提供一定的基础性数据。 2 材料和方法 2.1 材料与仪器 2.1.1 材料 实验材料分别采自 宁波余姚河姆渡水稻基地的 2 个水稻品种（紫色稻及其亲本）， 各对照样品均取自同一采收时间，样品均鉴定无误 。 2.1.2 仪器 本研究所采用的主要仪器和设备如表 1 所示。 表 1 主要仪器和设备 名称型号 制造商或产地 电子 分析 天平 PB203-N 梅特勒托利多仪器有限公司
13、3 电子精密天平 PL-203 梅特勒托利多仪器有限公司 冰箱 海尔公司 紫外可见分光光度计 上海棱光技术有限 公司 高速冷冻离心机 Eppendorf 公司 数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司 PH 计 梅特勒托利仪器公司 2.1.3 试剂 表 2 主要药品和试剂 试剂 类型 规格 生产厂家 磷酸氢二钠 分析纯 国药集团上海化学试剂厂 磷酸二氢钠 分析纯 国药集团上海化学试剂厂 甲硫氨酸 分析纯 上海试一化学试剂有限公司 氮蓝四唑 分析纯 北京恒业中远化工有限公司 EDTA-Na2 分析纯 上海生物工程有限公司 核黄素 分析纯 上海朗瑞精细化学品公司 续表 2 试剂 类型 规格 生产厂家
14、邻苯二 酚 分析纯 上海三鹰化学试剂有限公司 聚乙烯吡咯烷酮 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 硫酸铵 分析纯 上海市奉贤奉城试剂厂 苯丙氨酸 分析纯 上海试一化学试剂有限公司 2.1.4 其他用品 研钵、具塞刻度试管、 10mL、 100mL、 1L 容量瓶、刻度吸管、 50mL 三角瓶、100mL 量筒、 100mL 吸量筒、 10mL 刻度试管、 10mL、 100mL、 1L 烧杯、酸式滴定管、蒸馏水、手术剪刀、一次性手套、一次性橡胶手套。 2.1.5 主要试剂配制 0.1mol/L 高锰酸钾标准液：称取高锰酸钾 3.1605g， 用新煮沸冷却蒸馏水配制成 1000mL，再用 0.1m
15、ol/L 草酸钠溶液标定。 0.1mol/LH2O2：市售 30%H2O2 大约等于 17.6mol/L，取 30%H2O2 溶液 5.68mL，稀释至 1000mL，用标准 0.1mol/L 高锰酸钾溶液（在酸性条件下）进行标定。 0.1mol/L 草酸钠溶液：称取已烘干至恒重的草酸钠 11.1667g，用蒸馏水溶解后，定容至 1000mL。 0.02mol/L 苯丙氨酸溶液： 称取 3.3038g 苯丙氨酸， 用 0.1mol/LpH8.8 硼酸缓冲液 定容至 1000mL。 0.1mol/L 邻苯 二酚溶液： 称取 1.1011g 邻苯二酚， 用蒸馏水定容至 100mL。 130mmol
16、/L 甲硫氨酸溶液：称取 1.9389g 甲硫氨酸用磷酸缓冲液溶解定容至4 100mL。 750mol/L 氮蓝四唑溶液：称取 0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至 100mL，避光保存。 100mol/LEDTA-Na2 溶液：称取 0.03721gEDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000mL。 20mol/L 核黄素溶液：称取 0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至 1000mL，避光保存。 2.2 实验方法 2.2.1 样品预处理 将新鲜 水稻植株 洗净后晾干水分，剪下叶、茎、 籽粒 ， 置于 -40 冰箱分装保存 。 2.2.2 主要生理生化特性测定 2.2.2.1 苯丙氨酸解
17、氨酶（ PAL）活力测定 苯丙氨酸解氨酶（ phenylatanine ammonialyase， PAL， E.c4.3.1.5）是 )催化L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，是连接初级代谢和苯丙烷类代谢， 催化苯丙烷类 代谢途径第一步反应的酶，也是这个途径的关键酶和限速酶，对植物具有非常重要的生理意义 10。它催化 L-苯丙氨酸的脱氨反应，释放氨而形成肉桂酸。根据产物反式肉桂酸在波长 290nm 光密度下的变化，可以测定该酶的活性。 苯丙氨酸解氨酶活性（酶单位 /g 鲜重） =A*V/（ 0.01*a*W*t） 式中： A 为反应时间内吸光度的变化值； V 为酶提取液总量（ mL）； t 为反
18、应时间（ h）； W 为样品鲜重（ g）； a 为 测定时酶液用量（ mL）； 以每小时在 290nm处吸光度变化 0.01 所需酶量定义为一个酶活性单位 。 本次测定参考相关文献进行操作 11-15。 酶液制备：取 预处理过的 待测植物样 1g 置于钵 ，加入 0.5g 聚乙烯吡咯烷酮（ PVP）和 少量石英砂，并 加 10mL 含 5mmol/L 的巯基乙醇 并 预冷的硼酸缓冲液冰 浴研磨。研磨后置于离心管 中 ，用 10ml 预冷的 硼酸缓冲液洗涤研钵两次，一并倒入离心管， 在 4 下 10000r/min 离心 15min，上清液即为粗酶液。 酶活性测定：取 4 支 10mL 试管（
19、3 支测定管， 1 支对照管），分别加入 0.02mol/L L-苯丙氨酸 1.0mL（对照管不加，代之为蒸馏水），硼酸缓冲液 2.0mL，酶液 1.0mL，总体积 4.0mL。摇匀后置 于 30 恒温水浴保温 0.5h 后 ，加 0.2mL 6mol/L HCL 终止 ， 用对照管调零 后 ， 立即用紫外分不光光度计 在 290nm 处检测测定管反应液的吸光值 （以上实验均做 3 个平行 ） 。 2.2.2.2 多酚氧化酶（ PPO）活力测定 多酚氧化酶（ Polyphenol oxidase， PPO）是植物体内普遍存在的一种非线粒体内的末端氧化酶，它包括单酚氧化酶（酪氨酸酶（ tyros
20、inase）， EC.1.10.3.2）、双氧化酶（儿茶酚氧化酶（ catechol oxidase）， EC.1.10.3.2）、漆酶（ laccase，EC.1.10.3.1）；它可以把酚类物质如单酚、邻苯二酚、邻苯三酚、对苯二酚等氧化为相应的醌类物质 16。多酚氧化酶活性可以用用比色法测量产物的形成，常用的 底物如儿茶酚（邻苯二酚）和 3,4-二羟苯丙氨酸。 常用邻苯二酚（儿茶酚）5 通过比色法测量产物的形成，以此来测定多酚氧化酶的活力。 本次测定参考 朱广廉 等 16叙述 的 测定方法进行。 多酚氧化酶 活力（ 0.01A*min-1） =A*D/（ 0.01*W*t*a） 式中： A
21、 为反应时间内吸光度的变化值； D 为稀释倍数，即提取的总酶液为反应系统内酶液体积的倍数； t 为反应时间（ min）； W 为样品鲜重（ g）； a 为 测定时酶液用量（ mL） ；以每 min 内 A525 值变化 0.01 为 1 个酶活力单位 。 酶液制备 11-15：称取 已经过预处理的样 品 2g 置于研钵中，加入 0.5g 聚乙烯吡咯烷酮和 预冷的 5mL 0.1mol/L pH6.5 磷酸缓冲液，再加入少量石英砂磨成匀浆，倒入离心管，用 5ml 磷酸缓冲液洗涤研钵两次一并倒入离心管，然后加入30%饱和度硫酸铵， 10000rpm/min 离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达 60%
22、饱和度， 15000rpm/min 离心收集沉淀。将所得沉淀重新溶于 10mL 0.01mol/L pH6.5磷酸缓冲液即为酶液，以上操作均在 4 下进行。 酶活力的测定：在试管中加入 2.0mL 0.05mol/L pH5.5 磷酸缓冲液， 1.0mL 0.1ml/L 邻苯二酚， 1.0mL 酶液，摇匀后迅速于 525nm 波长处测定吸光值，然后倒入试管中，放入 37 恒温水浴中保温 10min，加入三氯乙酸终止反应，离心取上清 液 。于 525nm 波长处测定吸光值（以上实验均做 3 个平行）。 2.2.2.3 过氧化氢酶（ CAT）活力测定 过氧化氢酶（ CAT）是一种血红蛋白酶 ，它能
23、催化过氧化氢分解为水和分子氧 ，达到清除细胞内过氧化氢的目的，此过程中 过氧化氢既是氧化剂又是还原剂。可根据 H2O2 的消耗量或 O2 的生成量测定该酶活力大小。 测定过氧化氢酶的方法有测压法、滴定法以及分光 光度法等。 酶活性用每 g 鲜重样品 1min 内 OD 变化值表示： 过氧化氢酶活性（ A*g-1*min-1） =A*V/（ 0.01*W*a*t） 式中： A 为反应时间内吸光度的变化值； V 为酶提取液总量（ mL）； t 为反应时间（ min）； W 为样品鲜重（ g）； a 为测定时酶液用量（ mL） ；将每分钟 OD的减少 0.01 定义为一个酶活力单位 。 酶液提取 1
24、1-15：取样品 2g 加入已预冷的 0.1mol/L 磷酸缓冲溶液（ pH7.0） 5ml，研磨成匀浆，转移至离心管中；再用用该缓冲液 5ml 冲洗研钵两次，并将冲洗液转入离心管中； 15000r/min 离心 15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液，以上操作均在 4 下进行。 活性测定：在 4mL 反应体系中，包括 0.3%H2O21mL， H2O2.9mL，最后加入0.1mL 酶液，启动反应，测定 240nm 处的 OD 值减低速度（以上实验均做 3 个平行） 。 2.2.2.4 超氧化物歧化酶（ SOD）活力测定 超氧化物歧化酶（ superoxide dismutase， SOD）
25、是一种清除超氧阴离子自由6 基，普遍存在于动植物体内。由于超氧自由基（ O2 ）为不稳定自由基，寿命极短，测定 SOD 活性一般为间接方法。核黄素在有氧条件 下能产生超氧自由基负离子 O2 ，当加入 NBT 后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成甲腙，它是一种蓝色物质，在 560nm 波长下有最大吸收。当加入 SOD 时，可以使超氧自由基与 H+结合生成 H2O2 和 O2，从而抑制了 NBT 光还原的进行，使蓝色甲腙生成速度减慢。据此可以计算酶活性大小。 SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原的 50为一个酶活性单位表示，按下式计算 SOD 活性。 SOD 总活性（ A0 As） *Vt/
26、（ A0*0.5*W*V1） 式中： A0 为照光对照管的吸光度； As 为样品测定管的吸光度； Vt 为样品液总体积（ mL）； V1 为测定时样品用量（ mL）； W 为样鲜重（ g）。 酶液提取：称取水稻 样品 12g 于预冷的研钵中， 加入 5mL 预冷的50mmol/L(pH7.8)磷酸缓冲液 ， 0.5gPVP 在冰浴上研磨成浆，加缓冲液最终定容至10mL 容量瓶中。取 5mL 提取液于 4 下 10000r/min 离心 15min，上清液即为 SOD粗提液。 活 性测定 11-15：在 4mL 反应体系中，包括 0.3%H2O21mL、 0.2%愈创木酚 1.0mL，pH7.0
27、 磷酸缓冲液 1.7mL，最后加入 0.3mL 酶液，记录 470nmLOD 增加速度。将每分钟 OD 增加 量定义为 1 个酶活力单位 （以上实验均做 3 个平行） 。 显色反应： 取 5mL 试管（要求透明度好） 7 支， 3 支为测定管，另 3 支为对照管，还有一支空白对照。按表 3 加入各种溶液。 表 3 各试剂加入量 试剂 测定管用量 （ mL） 空白 和 对照管用量 （ mL） 0.05mol/L 磷酸缓冲液 1.5 1.5 130mmol/LMet 溶液 0.3 0.3 750mol/L NBT 溶液 0.3 0.3 100mol/L EDTA-Na2 溶液 0.3 0.3 100mol/L 核黄素 0.3 0.3 酶液 0.05 0.05（缓冲液） 蒸馏水 0.25 0.25 总体积 3.0 3.0 混匀后将空白管置暗处，其他各管于 4000lx 日光下反应 20min（要求各管受光情况一致 ， 温度高时间缩短，温度低时间延长 ）。 2.2.2.5 叶绿素含量测定 高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素（光合色素）吸收的。叶绿体色素由叶绿素 a、叶绿素 b、胡萝卜素和叶黄素组成。 叶绿素不溶于水，
