1、毕业论文 文客久久 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 基于线粒体中日白姑鱼分类地位研究 学 院： 学生姓名： 专 业： 农业资源与环境 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 毕业论文 文客久久 目录 中文摘要 1 英文摘要 2 1.前言 3 1.1 白姑鱼形态特征与分布 3 1.2 研究方法及意义 3 2.材料与方法 5 2.1 实验材料 5 2.2 基因组 DNA 的提取 5 2.3 PCR 扩增 6 2.4 PCR 产物的纯化 6 2.5 测序 6 2.6 数据分析 7 3.结果 7 3.1 碱基组成 7 3.2 单倍型及核苷酸多态度 8 3.3 遗传距离及 NJ 系统树 9 4.讨论
2、 15 致谢 16 参考文献 17 毕业论文 文客久久 基于线粒体中日白姑鱼分类地位研究 摘要 本文通过对白姑鱼分布区 4 个群体共 90 个个体的线粒体 DNA 控制区序列和部分个体细胞色素 b 序列进行测定和分析，来探讨中、日白姑鱼之间的亲缘关系和遗传多样性。在 东海、青岛近海、广州近海及日本有明海 90 个个体中共检测得到 78 个单倍型，得到 479bp 的线粒体控制区目的片段。 控制区序列富含 A 和 T 碱基， A+T 平均含量达到 65.2%， 而 G 碱基相对缺乏，平均仅为 14.1%，这说明控制区在碱基的组成上具有明显的偏向性。 在控制区序列和细胞色素 b 序列上， NJ 系
3、统树均显示存在中日两个完全隔离的地理分支 ，中日群体间无共享单倍型 ，成对的 FST值清楚地表明白姑鱼中日群体间有显著的遗传分化 。中国群体的核苷酸多态度明显高于日本群体。基于线粒体控制区序列得到 中、日白姑鱼群体的平均遗传距离为 0.0239，而基于 Cytb 基因得到中、日白姑鱼群体的平均遗传距离为 0.0127。中性检验和核苷酸不配对分布表明白姑鱼中日两支都经历了群体扩张，基于控制区序列和基于 Cytb 基因的分子方差分析结果和 FST 值显示中国群体间的遗传分化情况有所差异，可能是因为 Cytb 基因的进化比控制区基因慢， Cytb 基因的遗传分化稍滞后于线粒体控制区基因。 本研究为进
4、一步深入探讨白姑鱼中日组群的遗传分化提供了有力依据， 研究结果可作为更新世晚期冰期历史事件的一个佐证 ，同时可以 为 对白姑鱼资源采取适当措施予以增殖、保护、合理利用 提供了基础资料 ，从而在维护渔业可持续发展上具有重要意义。 关键词 白姑鱼 线粒体 DNA 遗传分化 线粒体控制区 Cytb 基因 毕业论文 文客久久 Study in genetic variation between Chinese and Japanese populations Argyrosomus argentatus based on mitochondrial DNA Abstract Ninety indivi
5、duals of Pennahia argentata were sampled from 4 localities to evaluate the genetic variation between Chinese and Japanese Argyrosomus argentatus based on mitochondrial DNA cytochrome b gene and control region sequences. The 90 individuals from the east China sea, Qingdao, Guangzhou, and Ariake Sound
6、 in Japan,were examined with a 479bp segment of mtDNA control region and 78 haplotypes. There was a bias of the content of A and T in the control region, coming up to 65.2%.The content of nucleotide G was the lowest, at average of only 14.1%. The neighbor joining tree showed there were two totally s
7、eparated clades,one in the Chinese coastal waters and the other in the Japanese coastal waters, and the pairwise FST value clearly showed that the genetic variation was mainly occurred between the Chinese and Japanese groups, and These clades may have been isolated and diverged during Pleistocene lo
8、w sea levels.Nucleotide diversity was much higher in the Chinese clade than that in the Japanese clade. The average genetic distance of P.argentata in China and Japan based on mitochondrial DNA control region sequences is 0.0239, while based on cytochrome b gene is 0.0127.The demographic history of
9、the two clades was examined using neutrality tests and mismatch analyses indicated Pleistocene population expansion in both clades.Molecular variance analyses and pairwise F ST based on control region and Cytb gene revealed some differences between the Chinese populations maybe because of the slower
10、 evolution speed than control region.This research for the paper furtherly set a strong basis on investigating the genetic structure and differentiation of different wild populations of P.argentata in China and Japan. Whats more, the result can be used as a proof of the historical events in the late
11、 pleistocene ice age, and at the same time it offers messages to take appropriate measures to reproduce, protect the white croaker, and thus to maintain the fishery a sustainable development. Keywords Pennahia argentata mitochondrial DNA Genetic variation mtDNA control region cytochrome b gene 毕业论文
12、文客久久 基于线粒体中日白姑鱼分类地位研究 1 前言 1.1 白姑鱼形态特征与分布 白姑鱼 (Pennahia argentata)，又称 白姑子、百米子、白梅、白花鱼， 隶属于鲈形目(Perciformes)、石首鱼科 (Sciaenidae)、白姑鱼属 (Pennahia)，为西北太平洋所特有的暖温性底层鱼类 1，分布于日本本州岛东北部至中国广东海域 2， 属于重要经济鱼类。白姑鱼 栖息于热带海洋沿岸泥沙质底部，深度 10-60 米，生殖季节结群向近海洄游。大部分 2 龄性成熟（少数1 龄），绝对生殖力为 2.3 万 -19.0 万粒。 产卵期 56 月，产浮性卵，产卵地点在近岸 3。 白
13、姑鱼肉厚而细嫩， 体延长， 侧扁。吻圆钝，吻褶完整，不分叶。口大，前位。上颚长于下颚。颏孔 6 个，细小，中央颏孔和内测颏孔呈四方形排列，外侧颏孔存在，无颏须。鳃盖上方有一大黑斑块。体被栉鳞，背鳍和臀鳍基部具 1 行鳞鞘。背鳍基部长且连续，起点在胸鳍基部上方，鳍棘部和鳍条部之间有一深凹，具 11 鳍棘、 2527 鳍条。臀鳍 2 鳍棘、 7 鳍条，第二鳍棘长，与眼径约等长。尾鳍楔形。背鳍鳍棘部都无黑斑。背鳍鳍条部及臀鳍基部有一行鳞。侧线发达，前部浅弧形，后部平直，伸达尾鳍末端。鳔大，圆筒形，端侧不向外突出成侧囊，后端尖细鳔侧具粗壮侧肢约 25 对，侧肢仅具腹分 支，五背分支。两侧及腹面银白色
14、4。 1.2 研究方法及意义 遗传多样性是生物多样性的重要组成部分。广义地讲，遗传多样性就是 地球上所有 生物所携带遗传信息的总和；狭义上，则指种内不同群体和个体间的遗传多态性的程度，或称遗传变异 5。 它是物种多样性和生态系统多样性的基础，是生命进化和物种分化的基础，更是评价自然生物资源的重要依据。遗传多样性的大小及群体遗传结构，与一个物种的进化潜力及抵御不良环境的能力紧密关联 6。遗传多样性的减少会降低一个物种对环境变化的适应能力，降低群体中变异的丰度，导致渔业资源的崩溃， 甚至导致物种的灭绝。对鱼类遗传多样性的保护关系到水产生物多样性的保护，从而关系到渔业资源的良性持续利用，是渔业健康发
15、展的关键。 鱼类的线粒体基因组 (mtDNA)与其他脊椎动物的 mtDNA 一样，是线粒体含有的多拷贝、单一、小型、双链、双环的 DNA 分子。基因组具有结构简单、母系遗传、进化速率快、几乎不发生重组、提取方法简单，结果重复性高等特点。因此作为一种重要的分子遗传标记，而被广泛应用于鱼类的系统发育、生物地理学和保护生物学研究。 细胞色素 b(简称 Cytb) 基因和控制区是研究最多，最适合于种内群体遗传结构研 究的片段。 Cytb 基因是 mtDNA 上结构和功能被了解得最清楚的蛋白质编码基因，进化速度适中，适于研究种内到种间乃至更高分类阶元间的系统发育关系， 是探讨种间和种内遗传分化程度上的良
16、好指标，被认为是解决系统发育问题最可信的标记之一 7。控制区又称为 D-loop，是线粒体的非编码区，被认为是线粒体中进化速度最快的区域，常用于群体遗传研究。它以其较高的突变积累对于研究物种内的遗传分化具有重要价值。对控制区结构功能的研究将有助于了解 DNA 的复制、转录的机制和进化的规律。 早期鱼类线粒体 DNA控制区变异的检测采用 较为普遍的是限制性内切酶片段长度多态性 (RFLP)和扩增片段长度多态性 (AFLP)，它是根据不同群体或个体基因组的限制性内切酶的酶毕业论文 文客久久 切位点碱基发生变异，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，比较不同群体或个体的
17、DNA 水平的差异 (即多态性 )，从而可以确立群体的进化和分类关系。目前，对鱼类控制区变异研究大多数集中于 DNA 序列分析。 DNA 序列分析是通过测定控制区全序列或部分序列片段，直接比较不同群体或个体同源核酸的核苷酸排列顺序，并推断类群间的系统演化关系及群体遗传变异， DNA 序列 方法的结果最为可靠、最为直接，对近缘种或远缘种均适合。 早在 20 世纪 80 年代，人们就开始了对线粒体基因组全序列的研究。从 1981 年 Anderson等对人线粒体基因组全序列的测定开始，到现在己有几百种生物的线粒体基因组全序列被测定出来并上传至 NCBI 核酸数据库，另外大量线粒体部分片段序列也己被
18、上传到 NCBI 生物信息中心 8。到目前为止， NCBI 核酸数据库共收录了约 600 种鱼类的线粒体基因组全序列，其中包括圆口鱼类 2 种，软骨鱼类 10 种，腔棘鱼类 2 种，肺鱼类 3 种，辐鳍鱼类 500 余种。 鱼类线粒体 DNA 研究是 80 年代中期兴起的一项分子生物学研究技术，该技术在鱼类系统学中得到了很好的应用。 国内研究者对鱼类 mtDNA 的研究起步较晚，对其酶切图谱、基因定位 9、片段克隆 10和结构分析 11已有一些研究，而且更多在于 mtDNA 限制性内切酶酶谱分析，涉及到应用于鱼类种群遗传结构研究报道少。 随着测序技术的逐渐成熟和生物信息学的发展，线粒体基因组已
19、经成为系统学研究的一种重要手段。越来越多的鱼类线粒体基因组被成功测序，由最初的对其结构的研究到分子系统学及种群遗传学上的研究成功地将不同进化速率的基因片段结合，避免了单个 基因由于自身特点引起的弊端目前，线粒体基因组全序列也越来越多的被应用于鱼类种内不同群体间分化程度的研究 12。 AFLP 技术由于其方法简单、成本较低、无需制备探针和进行分子杂交以及结果可靠、信息量大等优点而被广泛应用，近年来广泛应用于鱼类遗传多样性的研究中。 Jin 等利用 AFLP技术对分布在日本、韩国海域的尖头银鱼 (Salanx ariakensis)的种群遗传结构和基因流状况进行了研究，认为在对马海峡形成以后，日本
20、、韩国尖头银鱼群体间未发生基因交流 13。王志勇等 14利用 AFLP 技术对中国沿海真鲷 群体的遗传多样性进行了分析，结果表明真鲷北部湾群体的遗传变异最小，而且其与威海群体间的遗传差异显著，两者属于相互独立的不同亚种群。佟广香等 15对 5 个野生哲罗鱼 (Huchotaimen)群 体进行了 AFLP 分析，结果表明哲罗鱼各群体的遗传多样性均偏低，群体间基因交流较少，遗传分化程度大，哲罗鱼资源量的减少已影响了其种群遗传多样性。 白姑鱼 为近海暖温海域的中下层鱼类， 属海洋经济鱼类之一，在我国沿海产量并不多。近年来，过度捕捞、海洋污染及海洋生态系统的衰退等因素造成了白姑鱼资源的逐年减少 16
21、。据悉，东海 的白姑鱼的年产量己从历史最高的 20000 吨降至 2000 年 的 22 吨 17，足可见其正面临资源量的锐减。白姑鱼作为一种资源量正在减少的经济鱼类，基于遗传学层面对其分类地位进行研究具有重大的意义：其一，为进一步深入探讨白姑鱼中日组群的遗传分化提供了有力依据 ； 其二， 研究结果可作为更新世晚期冰期历史事件的一个佐证 ；其三 ，为 对白姑鱼资源采取适当措施予以增殖、保护、合理利用 提供了基础资料 ，从而在维护渔业可持续发展上具有重要意义。 2 材料与方法 2.1 实验材料 毕业论文 文客久久 本实验共用白姑鱼样本 90 尾，分别采自我国东海、青岛近海、广 州近海及日本有明海
22、，各群体样本的采集数量、时间见表 2-1，采集地点的地理位置见图 2-1。样品取肌肉置于 95%乙醇溶液中固定，在 20oC 条件下保存备用。 表 2-1 白姑鱼样本信息 Tab.2-1 Sample information of white croaker 图 2-1 采样地点分布图 Fig. 2-1 Map of sampling geographical sites 2.2 基因组 DNA 的提取 按酚 /氯仿抽提法从样品肌肉组织中提取基因组 DNA的详细方法和步骤如下 ： （ 1） 取样品肌肉 100 mg左右放入 1.5ml离心管并剪碎， 加入 650L STE（ 10mmol/L
23、TriS-Cl，pH 8.0； 0.1mol/L EDTA， pH 8.0； 1%m/v SDS） ，于振荡器上震荡均匀。 （ 2） 加 蛋白酶 K（ 20g/L） 15L，终浓度 0.5g/L， 颠倒混匀，于 50 烘箱内孵育过夜（8小时）。 （ 3）烘箱内取出后待其降至室温：加 650L（ pH 8.0）平衡酚，温和颠倒混匀至乳浊（ 10min）。离心（ 12000rpm， 10min），小心吸取上清液至另一干净离心管。 群体 Population 采集时间（年 /月） Date 样本数（尾） Number 青岛， QD 2003/3 15 广州， GZ 2004/4 7 东海， ES 2
24、004/5 49 有明海， AS 2005/3 19 毕业论文 文客久久 （ 4）加等体积苯酚 /氯仿 /异戊醇（ 25： 24： 1），颠倒混匀 10min，离心（ 10min），小心吸取上清液至另一干净离心管。 （ 5）加等体积氯仿 /异戊醇（ 24： 1）， 颠倒混匀 10min，离心 10min，小心吸取上清液至另一干净离心管。加入 2倍体积的预冷乙醇，颠倒混匀， -20 存放 2小时以上。 （ 6）离 心（ 12000rpm， 10min）产生白色沉淀，轻柔倒去乙醇，再加入 300L 75%的预冷酒精，缓慢颠倒洗涤 DNA沉淀，再离心（ 10min），弃酒精。 （ 7）重复步骤（ 6
25、）（注：不要将 DNA沉淀倒掉）。 （ 8） 将 DNA 样品置于真空干燥器干燥或烘箱干燥 (视管中乙醇残留量多少适当调整干燥时间 )，加入适量 TE（ 10mM Tris-HCL， 1mM EDTA， pH8.0）溶解，置 4C 冰箱待用或长期保存于 -20C 待用。 2.3 PCR 扩增 mtDNA 控制区第一高变异段用鱼引物 DL - S 和 DL - R 的扩增 。引物序列如下 ： DL - S： 5 - CCC ACC ACT AAC TCC CAA AGC -3“（正向）； DL - R： 5 - CTG GAA AGA ACG CCC GGC ATG -3（反向 ）。 PCR 反
26、应体积为 50L，其中包括 20-50 ng 模板 DNA， 5L 10反应缓冲液， 5L 氯化镁（ 25mM）， 1L 的 dNTPs（ 10mM），各引物 10pM， 2.5 单位的 Taq DNA 聚合酶（ Promega 公司）。 PCR 反应在 Eppendorf Mastercycler 5333 扩增仪上进行。 PCR 反应条件为： 94 预变性3min，然后进行 40 个循环，每个循环包括 94 45s， 50 45s， 72 1min，最后 72 延伸 10min。以上反应均用阴性对照来检查是否有 DNA 污染。取 1.5L 扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。 2.4
27、PCR 产物的纯化 PCR 产物用 1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。每个样品取 2L 检测，对于扩增效果良好的样品进行回收。回收时用 1.5%的琼脂糖凝胶， 150V 电压电泳分离，用小量胶回收试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）进行回收和纯化，回收步骤如下： （ 1）紫外透射仪割 下含目的 DNA 条带的琼脂糖块，放入 1.5mL 离心管中。 （ 2）按每 100 mg 琼脂糖加入 300L S1 液的比例加入 S1 液，置 50 温浴 30 min，使 琼脂糖完全融化。每 5 min 颠倒混匀一次。 （ 3）当目的片段 500bp 时，省略此步。 （ 4）将融化的 琼脂糖溶 液移入吸附柱，
28、 10000g 离心 30s。倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入收集管中。 （ 5）向吸附柱中加入 500L W1 液，静置 1 min 后， 10000g 离心 15s。倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管。 （ 6）重复步骤 （ 5） ， 10000g 离心 1min。 （ 7）将吸附柱放入干净的 1.5mL 离心管中，在吸附膜中央加入 30L T1（ 2mM Tris）液，静置 1 min 后， 12000g 离心 1 min。将 1.5ml 离心管 （ DNA） 储存于 -20C 待用。 2.5 测序 测序是在 ABI PRISM 3730 自动测序仪（ Applied Biosyst
29、ems）进行的，采用了正向和反向引物。测序引物和 PCR 扩增的引物相同。 2.6 数据分析 毕业论文 文客久久 序列编辑和对齐使用 DNAStar 软件。单体型数目、多态位点、碱基转换、颠换、插入 、缺失等分子多态性指数使用 ARLEQUIN 程序统计（版本 2.0）获得 18。单倍型多态度（ h）、核苷酸多态度（ ）两两序列平均核苷酸差异数（ k）以及相应的方差根据 Nei（ 1987）的公式由 ARLEQUIN 软件计算 19。测序后的序列 ， 与 GenBank 下载的其他鱼类控制区全序列一起用 Clustal W 排序，以 tRNAPro 的终点和 tRNAPhe 的起点查找控制区的
30、起点和终点，同时对比已报道的、白姑鱼、鳑鮍鱼类 20、鲹科鱼类 21的线粒体 DNA 控制区 序列，找到五种鱼类的 CSB-F 和 CSB-1，并以 CSB-F 和 CSB-1 的起点分别作为终止序列区、中央保守区和保守序列区的分界线。单倍型间的遗传关系采用邻接法 22在 MEGA 2.0 实施重建。使用 Kimura 的双参数替换模型计算系统发育重建所需的遗传距离。我们采用 1000 次重抽样评估 23来评估系统树的可靠性。 采用（ AMOVA）分析来评估白姑鱼的种群遗传结构。为了估计中、日白姑鱼间基因流，我们首先建立两个团体代表中国、日本白姑鱼来进行 AMOVA 分析。通过 1000 次重
31、抽样来检验不同遗传结构水平上的 协方差的显著性。此外，样本点之间的成对的遗传分歧估计使用固定指数 Fst 值，其中包括线粒体单体型频率和遗传距离。 通过 1000 次重抽样检验两两群体间Fst 值的显著性。 3 结果 3.1 碱基组成 3.1.1 白姑鱼 mtDNA 控制区碱基组成 对白姑鱼 4 个群体 90 个个体的控制区 5端进行了测定和分析，经比对去掉两端引物后，得到 479bp 的目的片段。在所调查的四个白姑鱼群体中， T、 C、 A 和 G 碱基平均含量分别30.50%、 20.70%、 34.70%、 14.10%，结果显示 G 碱基的含量相对缺乏 ， A+T 的平均含量（ 65.
32、20%）高于 G+C 的平均含量（ 34.80%）（表 3-1），这个现象与其他鱼类的控制区的碱基含量相似。在所调查的四个群体中，碱基组成有着一定的区别。日本有明海群体的白姑鱼碱基组成中 (A+T)含量最低，为 64.87%，明显高于其 G+C 含量（ 35.13%）；而东海群体的白姑鱼碱基组成中 (A+T)含量最高（ 65.22%）。 表 3-1 四个采样点的碱基组成和线粒体 DNA 控制区的长度 Tab. 3-1 Nucleotide compositions and length of the mitochondrial DNA control region in four sample
33、 sites 3.1.2 白姑鱼 Cytb 基因片段碱基组成 Cytb 基因片段经 PCR 扩增后得到清晰的谱带，经测序并对除去引物后的序列进行比对排序，得到白姑鱼的 Cytb 基因片段长度为 411bp。在所调查的四个群体中，碱基组成有着一定的区别。日本有明海群体的白姑鱼碱基组成中 (C+G)含量最高，为 50.27%，大于 (A+T)的含量49.73%，而白姑鱼群体的（ A+T）平均值为 50.01%， (G+C)含量平均值为 49.98%。 (A+T)碱基T% C% A% G% A+T% C+G% 长度 青岛 (QD) 30.58 20.65 34.60 14.17 65.18 34.8
34、2 479 广州 (GZ) 30.60 20.61 34.50 14.29 65.10 34.90 479 东海 (ES) 30.48 20.77 34.74 14.01 65.22 34.78 479 有明海 (AS) 30.29 20.83 34.58 14.30 64.87 35.13 479 平均 30.50 20.70 34.70 14.10 65.20 34.80 毕业论文 文客久久 含量 最高的则是广州和青岛群体，均为 50.12%（表 3-2）。 表 3-2 四个采样点的碱基组成和 Cytb基因片段长度 Tab. 3-2 Nucleotide compositions and
35、length of the mitochondrial DNA control region and Cytb gene in four sample sites T% C% A% G% A+T% C+G% 长度 青岛（ QD） 26.42 34.21 23.70 15.67 50.12 49.88 411 广州（ GZ） 26.37 34.21 23.75 15.67 50.12 49.88 411 东海（） 26.40 34.25 23.66 15.69 50.06 49.94 411 有明海（） 26.13 35.18 23.60 15.09 49.73 50.27 411 平均 26.
36、30 34.50 23.70 15.50 50.00 50.00 49.40%49.50%49.60%49.70%49.80%49.90%50.00%50.10%50.20%50.30%50.40%青岛广州东海有明海图 3-1 中日白姑鱼群体的配对碱基含量百分 比 Fig. 3-1 Base pairing ratio in 4 populations o f Pennahia argentata in China and Japan 将四个采样点白姑鱼的碱基组成含量（ A+T、 C+G)作图表示，得到图 3-1。从图 3-3中我们可直观地观察到：青岛和广州两个群体的白姑鱼碱基组成中 A+T和
37、 C+G的含量无差别；日本的有明海白姑鱼群体与中国的青岛、广州、东海之间差异显著。 3.2 单倍型及核苷酸多态度 3.2.1 mtDNA控制区单倍型及核苷酸多态度 表 3-3 白姑鱼群体遗传多样性指数 Tab. 3-3 Sampling data of white croaker including sample size and several diversity indices 采样点 样品大小 单倍型数 单倍型多态度 核苷酸多态度 两两平均差异数 青岛 (QD) 15 14 0.99050.0281 0.01440.0081 6.903.44 广州 (GZ) 7 6 0.95240.09
38、55 0.01630.0099 7.814.14 东海 (ES) 49 43 0.9915 0.0072 0.01410.0075 6.74 3.23 有明海 (AS) 19 16 0.98250.0223 0.00860.0050 4.112.14 总计 90 78 0.99580.0027 0.02330.0118 11.155.11 从 4个群体白姑鱼 90个个体中得到 479bp的目的片段，经比对后，同源序列长度为 479bp，在此片段长共检测到 78个变异位点，其中有 52个是简约信息位点。在 90个个体中共检测到 78个单倍型，其中 70个单倍型只在 1个个体中检测到。单倍型间的核苷酸差异数在 1和 27之间。 C+G A+T
