1、 Peptide Pull-down 方案 设计好的备用肽段（C 端末尾加几个残基作为连接臂并且末端偶联生物素， ）应被色谱纯化至纯度大于80%，等分，冻干，干燥环境下于80度储存1 连接肽段的珠子的制备：（注意，制备的所有步骤都应在冰上或最多4度的环境下进行）1 用1mL 磷酸盐缓冲液加0.1% 的表面活性剂 Triton X-100，冲洗400微升的亲和素珠（离心？（microcentrifuge） ，500RCF，30s）移去上清液，至少洗三次（洗去表面的保护剂，表面活性剂 Triton X-100也促使疏水性的珠子与水相分离，否则无法得到上清液）制备两个400 L 的珠子，其中一份不偶
2、联肽段作为只有珠子的对照组。用装有毛细管凝胶的移液器尖端来取上清液，从而避免移去珠子2 使100微克偶联生物素的肽段重新悬浮在400微升磷酸盐缓冲液（PBS）中这些肽段的量足够配400 L 偶联肽段的珠子，做 20次 pulldown，如果珠子有着不同的连接生物素能力，注意将肽段和 亲和素比例调整合适3 将2 中制备好的400微升重新悬浮的肽段加入400微升洗过的珠子中，旋转（rotation ） ，在室温下温育3到5h也可在4度过夜温育4 用1 mL PBS + 0.1% Triton X-100冲洗连接了肽段的珠子至少三次，来移除未连接上的肽段5 将偶联了肽的珠子重新悬浮在 400微升磷酸
3、盐缓冲液中来制备 50%的悬浮液，在4度下储存若长期储存，加叠氮化钠到浓度为0.1%， 4度下至少可 储存1个月。甲基化修 饰稳定，磷酸化修饰不稳定2 用固定好的肽段从复杂混合物中钓蛋白一些一般原则：1 在实验的每一步中都要确保蛋白酶抑制剂的使用，防止蛋白的降解。2 都应在冰上或最多4度的环境下进行。3 必须加未偶联肽的珠子作为阴性对照。4 除 HEPES 缓冲液外在这次试验中也可使用其他缓冲液5 所有肽段平行处理制备蛋白质的复杂混合物1 每次实验从 108 数量级的细胞（问题：细胞培养）中制备新鲜核提取物，采用标准的高盐溶液提取方案总量 108 数量级的细胞一般来说基本足够了，最好用新鲜核提
4、取物防止蛋白降解，不过提取物可先快冻在液氮中再在-80C 储存，从不同细胞系中提取是很重要的，因为有些蛋白在给定的细胞中表达的不是很好，此外考虑到所感兴趣的组蛋白翻译后修饰所涉及的细胞有丝分裂过程，与修饰同步的，正进行有丝分裂的细胞的核提取物是合适的，一些 组蛋白连接的蛋白因子在 420mM 浓度的盐溶液提取过程中不能被有效提取（比如那些和染色质连接很牢固的，这时就要考虑其他提取组蛋白方法了，比如用 DNA 水解酶或微球菌核酸酶来使组蛋白溶解）2 调整提取物的盐浓度到 150 毫摩每升：利用 KCl 盐浓度为 150 毫摩每升的缓冲液 D 透析或利用无盐缓冲液 buffer D 稀释，调整体积
5、到每毫升 108 当量细胞， （总蛋白浓度约为2.5g/L）向 buffer D 加入 新制的 DTT, PMSF，蛋白 酶抑制剂是很重要的3 添加表面活性剂 Triton X-100 到提取物中使得 Triton X-100 浓度为 0.1%Triton X-100 对防止 pull down 过程中蛋白的非特异性连接很重要4 最大速度（13200RCF）离心 15 到 30min，清除所有沉淀，转移上清液到干净试管中4C 下我们用 13200 转每分的台式离心机，等待一段时间来确保所有的可见沉淀都被从核提取物中清出，彻底移去所有沉淀是非常重要的，会显著减少非特异性连接的背景水平复杂混合物与
6、珠子的处理5 每份将80 L （50% ）的未偶联的珠子溶液（含40L 珠子） ，离心使成团（500RCF ，30s） ，移除上清液6 用 500 L Buffer D(含浓度为 150 mM 的 KCl)将珠子至少洗一次（ 500 RCF，30s，移去上清液，避免移走珠子）7 将制备的核提取物加到洗过的珠子中，在 4 度下轻轻旋转（rotation）温育 30 分钟若方便可以增加温育时间，然而预清理时间在超过30分后，我们再没能观察到非特异性连接蛋白背景水平的下降。而且请记住这步不能从数量上减少非特异性连接的水平（只作为对照组）8 通过离心 30 秒使珠子集聚成团状（离心力调整为 500RC
7、F） ，用干净试管收集上清液来用于pull down如果需要的话，再离心除去任何残余珠子9 取 15 uL 清澈的核提取物作为 input 对照组用于之后的分析偶联肽段珠子的准备10 每份取 40uL,50%的珠子悬浮液（含 20uL 珠子）偶联肽段的珠子的量可以根据蛋白与它结合的亲和力的强弱来调整，然而我们也发现当珠子体积超过 20 uL 只能增加背景干扰水平，不能增加特异性连接11 离心使珠子集聚成团状，移除所有上清液，保证每份有着大致相同量的珠子通过离心30秒使珠子集聚成团状（离心力调整为500RCF），用装毛细管凝胶的移液管吸头移去上清液， ，在每次 pull down 试验中确保使用
8、大致相同的已偶 联肽段的珠子是很重要的，确保不同肽段之间能进行比较12 用 500 L Buffer D(含浓度为 150 mM 的 KCl)将珠子洗 1-3 次，移除所有上清液洗涤注意：使珠子离心30秒（离心力调整为500RCF）与毛细管凝胶装载在移液管吸头最后一次洗之后要尽可能将上清液与珠子分离彻底Peptide pull-down:13 将预处理过的核提取物约 40uL 加到 20 uL 的洗过的偶联肽段的珠子里14 在 4 度条件下旋转，温育 2 到 16hPull-down 的温育时间可以取决于使用的蛋白， 肽段的量以及 结合的亲和力大小，为方便期间可以过夜温育，然而要发 生结合的话
9、一般 2 小时就足够了，在某些情况下更长的温育时间会减少特异性结合蛋白的复原15 离心（500RCF 30s）使珠子集聚成团状16 转移所有上清液到干净试管中作为 flow-through 对照组用于之后分析17 用 1 mL Buffer D(含浓度为 300 mM KCl)洗珠子至少五次，弃去上清液彻底的清洗成团的珠子和彻底的将其与上清液分离是很重要的，它确保在 pull-down 环节中没有留下残余的未连接蛋白质，在一次成功的 peptide pull-down 中，关键是要把握好盐浓度的平衡，既要能洗去非特异性连接的背景干扰蛋白，又能保持相关的特异性连接蛋白18 最后一次用低渗 HEP
10、ES Buffer 冲洗，弃去上清液使用低浓度 HEPES Buffer 使得下步中用氨基乙酸洗脱时 PH 能稳定改变收集 pull-down 片段19 加 1 到 2 珠子体积的 Glycine（100 mM ，pH 2.8，约 20-40 uL ）来冲洗珠子洗脱时洗脱液的量的调整取决于需要复原的蛋白量，并不是所有蛋白都能高效地用氨基乙酸酸洗下来，这时有两种选择 ，一是用 0.5 N NH4OH + 0.5 mM EDTA 碱性环境洗脱，一种是用 0.5 mg/mL 用磷酸盐缓冲液 PBS 溶着的未偶联生物素 肽段洗脱（这是专一性最高的方法但是需要大量肽段）20 在室温下温育 10 分钟使酸
11、洗脱蛋白，温育时轻弹试管，使洗液与珠子充分混合温育时间应当加长如果用肽段而不是用酸或碱洗21 将所有洗出液转移到干净试管中（用装毛细管凝胶的移液管吸头）22 重复 19-21。第二次酸洗.第二次洗脱增加了和珠子相连蛋白的复原量，但可能忽略来限制洗脱液的体积，23 加入 1/10 体积 (4-8 uL) ，浓度 1 M 的弱碱缓冲液 Tris (pH 8.0).中和 PH24 加入大约 4 倍体积的 Laemmli 缓冲液于混合洗出液中，储存作为“acid-elution”组用于之后分析: Laemmli 样品缓冲液 0.2 M TrisHCl, pH 6.8, 8% SDS, 40% glyc
12、erol, 0.04% bromophenol blue, freshly added DTT to 40 mM25 将酸洗的珠子重新悬浮于 20 uL 浓度为 100 mM 的 Tris 中(pH 8.0)，26 加入大约 4 倍量的 Laemmli 缓冲液于洗出液中（为制胶预备） ，95 度下煮沸 5 分钟使残余的连接蛋白质变性。通过酸洗和变性收集剩下的连着在珠子上的蛋白，使得被酸洗脱蛋白质和未酸洗脱蛋白之间出现了平行对照，因为可能给出的某种蛋白无法高效的用酸洗脱27 最大速度离心 30 秒，充分摇晃？（vortex vigorously）15 秒后再次离心，取所有上清液作为变性洗出液组用
13、于之后分析分析和鉴别结合蛋白将“input”, “flow-through”（16 中探针与蛋白温育后的溶液部分） , “acid-elution”（被酸洗脱的结合蛋白） 和 “denaturing-elution”（变性后被洗下的蛋白）四组进行凝胶电泳，再用银染对比，切割只出现在被修饰肽段那组的条带，用质谱分析用专一性抗体验证感兴趣的蛋白的确是特异性连接我们使用来自 Invitrogen 公司的 SilverQuest 银染工具，小心操作胶防止角蛋白污染Materials see procedure section)6 低浓度 HEPES Buffer: 4 mM HEPES, pH 7.9, 10 mM NaCl7 100 mM Glycine (pH 2.8)Optional (for base-elution): 0.5 N NH4OH + 0.5 mM EDTA8 4X Laemmli buffer: 0.2 M TrisHCl, pH 6.8, 8% SDS, 40% glycerol, 0.04% bromophenol blue, freshly added DTT to 40 mM9 1 M Tris (pH 8.0)10 100 mM Tris (pH 8.0)
