1、 细胞周期 检测（ PI 法 ） 一、 实验方法原理 细胞周期（ cell cycle)： 是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程， 通常由 G0/G1 期 、 S 期、 G2 期和 M 期组成。 G1 期：细胞开始 RNA 和蛋白质的合成，但 DNA 含量仍保持二倍体。 S 期： DNA 开始合成，这时细胞核内 DNA 的含量介于 G1 期和 G2期之间。当 DNA 复制结束成为 4 倍体时，细胞进入 G2 期。 G2 期的细胞继续合成 RNA 及蛋白质，直到 进入 M 期。因此，单纯从 DNA 含量无法区分 G2 期和 M 期。一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个
2、细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（ G0 期），而G0 期从 DNA 含量上同样无法与 G1 期区分。因此，整个复制周期可以描述为 G0/G1、 S、 G2/M 期。 通过核酸染料 PI 标记 DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出 G0/G1%、S%、 G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以 S 期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。 流式细胞仪的工作原理 ：是 将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的
3、光散射和荧光指标，分析出其 DNA 特征。 细胞周期检测的原理： PI 法是较常见的一种周期检测方法。 PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸 DNA 和 RNA 双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与 DNA 的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的 DNA 分布状态，从而计算出各个期的百分含量。 PI 染色后，假设 G0/G1 期细胞的荧光强度为 1，那么含有 双份基因组 DNA 的 G2/M 期细胞的荧光强度的理论值为 2，正在进行 DNA 复制的 S 期细胞的荧光强度为 1-2 之间。 细胞周期示意图如 （图一） 所示 （图一） 二、 材料及准备工
4、作 1.材料准备 试剂、耗材名称 品牌 货号 细胞培养瓶 corning 6 孔板 corning 10ml 离心管 国产 1.5ml EP 管 国产 胰酶（无 EDTA） 贝博试剂盒中包括 RNase-A 贝博试剂盒中包括 PI 贝博试剂盒中包括 无水乙醇 国产 PBS 自配 2. 试剂配制 10XPBS 液 体配方 （ 0.1MPBS pH 7.4） 以 1L 量为例： NaCl 80g Na2HPO412H2O 32.3g NaH2PO42H2O 4.5g （十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠） 加双蒸水 900mL 左右，用 HCl/NaOH 调 pH至 7.4，最后定容为 1000
5、mL。 使用时用去离子水稀释成 1XPBS 3.仪器设备 流式细胞仪 ； 细胞培养 孵箱； 离心机 ； 水浴 ； 冰箱 ； 离心管 ； 封口膜 ； 移液器 三 、 实验步骤 及注意事项 ：（采用 贝博公司的 细胞周期检测试剂盒 ） 1. 细胞样品的准备： 单次流式细胞仪检测， 1 份样品细胞数量约 106（ 我校 8 楼免疫教研室的要求） 收集细胞培养液备用。 用胰酶（无 EDTA） 消化 细胞，至细胞可以被轻轻用吹打下来时，加入前面收集的细胞 培养液，吹打 下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。 将 细胞悬液收集到 10ml 的 离心管内。 800g 左右离心 5min，沉淀细胞。小心吸除上清，
6、残留约 50 微 升 左右的培养液，以避免吸走细胞。 加入 1ml 冰浴预冷的 PBS， 重悬 细胞， 800g 5min。 为 减少细胞损失可用 1.5ml 离心 。 再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，残留约 20ul 左右的 PBS，以 避免吸走细胞。 重复第 5 步操作，用 预 冷 的 PBS 再次 洗细胞 ，并离心收集细胞。 轻轻弹击离心管底以适当 分散细胞 ，避免细胞成团 ，用 250ul 预冷的 PBS 重悬细胞 。 2. 细胞固定： 缓慢 加入 750ul 冰浴预冷 无水 乙醇 ，轻轻吹打混匀， 4固定2 小时 或 -20固定 1 小时， 封口膜封口 （此步可停止， -20 保存样
7、品， 1 周内样品检测不受影响） 。 3. 染色： 1000g 左右离心 3-5min，沉淀细胞。小心吸除上清，可以残留约50ul 左右的 70%乙醇，以避免吸走细胞。 加入约 1ml 冰浴预冷的 PBS， 洗涤细胞一次 。 再次离心沉淀细胞，小心吸除上清 。 用 200ul 预冷的 PBS 重悬细 加入 Rnase A 溶液 20ul， 37 水浴 30min。 每管细胞样品中加入 400ul 碘化丙 啶染色液，缓慢并充分 混匀后4避光 孵育 30 min。染色完成后宜在 24h 内完成流式检测。 . 流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长 488nm 波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况
8、。采用适当分析软件进行细胞 DNA 含量分析和光散射分析。 注意事项 1.RNaseA 用 PBS 配制，但是注意要沸水浴去除 DNase 的活性。 试剂盒中带有配制好的酶。 2.流式分析时需要的是单个细胞悬液，因此在操作过程中充分混悬细胞。 3.固定过程中 不直接加 70%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现 象，很难重悬成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。 3. PI 液体 4 避光保存 。 FlowJo 分析细胞周期数据的过程 1.把细胞周期样品拖入 FlowJo 软件，双击打开原始数据。如 (图二 )所示： (图二 ) X 轴选择 FSC,Y 轴选择 SSC。分析细胞周期的细胞
9、选择上图所示的细胞群体进行分析。 2. 在 SSC/FSC 图中双击分析的细胞群体，如 （图三） 所示： （图三） X 轴选择 FL3-LIN,用来表示 PI 的线性信号。 Y 轴选择 FL3-PEAK,用来表示 PI 的峰值信号。本实验数据采集采用的是贝克曼仪器采集的数据。（ 如果是 BD 的仪器采集的数据， X 轴选择 FL2-W,用来表示 PI的宽度信号 。 Y 轴选择 FL2-A,用来表示 PI 的面积信号 ），如上图所示多倍体或异倍体细胞不予分析。 3.在 FlowJo 工作台中选中“用于周期分析的二倍体细胞”这个结点，在工具栏的“工具”中选择“细胞周期”。 如 （图四） 所示 （图
10、四） 说明： 1) 分析的模型有 Watson 和 DJF 两种，用户可以选择任 意一种进行分析，两模型间没有实质的差别。模式右边是 两种模型的显示方式。 2) 细胞周期拟合原则： G1 峰限制和 G2 峰限制。根据实验结果拟合情况，对 G1 峰限制和 G2 峰限制进行适当的调整。 曲线调整原则：粉色的曲线为模型曲线，黑色的为样本曲线，理想状况是粉色和黑色曲线吻合一致为最佳。拟和的好坏可以 根据右边的 RMS 值来判断。 RMS(root mean square)值越小越好。但是这只是一个相对值，只在同样本不同模拟情况下，选取最小值来达到最佳拟和。你可以选中 G1 期的峰或 G2期的峰，根据调
11、节按钮调节峰的宽度 通常 来说， G2 的位置为 G1 的 2 倍。 你可以根据相对固定的那个峰来确定另外一个峰的位置，如 G1 峰相对固定的话，就选择 G2 峰的均数为 G1 的 2 倍 (2G1)；如果 G2 峰相对固定的话，就选择 G1 峰为 G2 峰的 0.5G2 细胞周期结果解读： G0/G1 期细胞占总的 61.2%，峰位于横座标的 45.76 G2/M 期占 13.07，峰位于横座标的 91.43 S 期占 25.73 G2/G1 为 2.0（即 G2 期为 4 倍体细胞，而 G1 期为 2 倍体细胞，比值为 2） 峰的变异系数为 4.54%（好） 细胞碎片为 0.48%，细胞聚
12、集体有 0.06%。 总的细胞数（仪器检测到的）为 17525 个， 在细胞周期中分析的细胞数为 17431 个（即排除了碎片及聚集体后） CV 是变异系数。一般 CV 越小，峰形越好，越尖锐。能控制在 5%左右是比较好的结果，一般小于 10%就可以认可了。 细胞周期分析常用术语： CV：变异系数。不同细胞群体 DNA 含量的细微差别可能有生物学上的重要意义，因此 DNA 含量的流式分析中分辨率尤其关键。通常检测分辨率或精度由 G0/G1 峰的 CV 来反映。影响 CV的因素主要包括两方面：仪器因素和样品制备及染色过程对标本的人为影响。 Ploidy:倍体。原指染 色体数目。流式中用来描述总的
13、 DNA 含量。二倍体细胞有正常细胞的 DNA 含量但不排除染色体的异常。 S 期含量 :S 期细胞占总细胞周期的比例。 细胞周期数据结果输出 1. 细胞周期结果的输出根据最终的需求可以有多种输出方式 在细胞周期分析窗口工具栏中选择 “ 文件 ” 并单击，选择下拉菜单中的 “ 另存为 ” ，选择保存位置、重新命名文件名以及文件保存的文件类型（ SVG、 PNG、 EMF、 JPG）。 把上述样品的分析应用到组中，在 Flow Jo 软件界面中单击打开布局编辑器，在工作台的样品空间把“分析的细胞群体结点”拖入布局编辑器 中，单击布局编辑器右上角的 Batch 工具。输出整个实验组的数据。 如 （图五） 所示 （图五）
