1、叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定【实验目的】1.掌握提取和分离叶绿体色素的方法；2.掌握测定叶绿体色素含量的方法；3.熟悉叶绿体色素的理化性质及吸光特性；4.了解植物叶绿体色素组成及其与生境的相关性。【实验原理】1.叶绿体色素是植物进行光合作用的重要物质，叶绿体色素包含绿色素（包括叶绿素 a和叶绿素 b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类，这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。 提取液可用色层分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同
2、，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。2. 叶绿素是一种二羧酸叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开图一：叶绿素的结构3.叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。图二：叶绿素对光能的吸收与能量转变示意图4.叶绿素中的镁可以被 H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素。铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。5. 叶绿体色素具有吸光特性，
3、可利用分光光度计在某一特定波长下测定色素溶液光密度，即可用公式计算出其中各色素的含量。各种色素含量计算如下：Chla（g /ml）=12.7 OD6632.69OD645Chlb（ g /ml） =22.9 OD6454.68 OD663ChlT（g /ml）=Chla + Chlb0.1ml 提取液 Chla 含量（g ）=Chla（g /ml） *0.1ml*稀释倍数0.1ml 提取液 Chlb 含量（g）=Chlb（g /ml） *0.1ml*稀释倍数0.1ml 提取液 ChlT 含量（g ）=ChlT（g /ml） *0.1ml*稀释倍数（ 菠菜：稀释倍数=0.1ml/3ml=30，玉
4、米：稀释倍数=0.3ml/3ml=10）每种叶绿素含量计算（以 Chla 为例）： FW取V Chla取1ml /Chla 液其中 FW 为样品总重（2.0g 菠菜叶片，0.2g 玉米叶片） ，V 总=10ml6.叶绿体色素易受光氧化，提取色素应在弱光中进行，并避光保存色素。光照下叶绿体色素会被破坏。【实验材料】1.材料：菠菜叶片，玉米叶片2.试剂：9 丙酮（100%及 80%） ；石英砂；碳酸钙粉 ；四氯化碳；醋酸铜； HCl（6N ）乙醚， KOH-甲醇3.器材：研钵，培养皿，量筒，试管，滴管，定性滤纸，分光光度计，比色皿【实验内容】1.叶绿素的提取与定量（1）取菠菜新鲜叶片 2g，玉米新
5、鲜叶片 0.2g。洗净，擦干，去掉中脉（玉米叶片可直接剪碎） ，剪碎，放入研钵中。 （2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，取 10ml 丙酮，分几次加入研钵，充分研磨后过滤，定容至 10,mL。（3）将两种植物的叶绿素提取液置于试管中，避光保存。备用。（4）取 0.1 ml 菠菜叶片色素提取液及 0.3ml 玉米叶片色素提取液，用丙酮稀释到 3 ml ，测定吸收光谱（400nm-700nm） ，测定 663、645 nm 处的吸光值，根据公式计算叶绿素a、叶绿素 b 的含量。2.叶绿体色素的分离：取圆形定性滤纸一张，用毛细管吸取叶绿体色素提取滴在圆形滤纸中心，使色素扩散的宽度限制在 0.5 c
6、m 以内，保证叶绿素扩展速度均匀 ,保证色素扩展清晰,风干后，应多点样几次,大约 20 次左右 .在圆形滤纸中心戳一圆形小孔（直径约 3mm） ，将纸捻一端插入圆形滤纸的小孔中，使与滤纸刚刚平齐（勿突出） 。长形滤纸一条，也点样后层析分离（用于测定吸收光谱）培养皿中加入适量的四氯化碳，把带有纸捻的圆形滤纸平放在培养皿上，使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好培养皿。此时，推动剂借毛细管引力顺纸捻扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色素向四周推动，不久即可看到各种色素的同心圆环。所用培养皿底、盖直径应相同，且应略小于滤纸直径，以便将滤纸架在培养皿边缘上。长形滤纸放入盛有四氯化碳大试管中，进行层析后获得线形不同
7、色素条带，分别剪下后测定吸收光谱。叶绿素的理化性质部分3 荧光现象的观察用反射光和透射光观察提取液的颜色有何不同，反射光下观察到的提取液颜色即为叶绿素产生的荧光颜色。4 光对叶绿素的破坏作用：取叶绿体色素提取液少许，分装两支试管中，一支放在黑暗处（或用黑纸套包裹） ，另一支放在强光下（阳光下） ，经过 2-3h 后，观察两支试管中溶液的颜色有何不同。5.铜代反应：取色素提取液少许于试管中，一滴一滴加浓盐酸，直至溶液颜色出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。然后加醋酸铜晶体少许，慢慢加热溶液，则又产生鲜亮的绿色。此即形成了铜代叶绿素。6.皂化反应：取叶绿体色素提取液 2 mL 于大
8、试管中，加入 4mL 乙醚，摇匀，再沿试管壁慢慢加人3mL 蒸馏水，轻轻混匀，静置片刻，溶液即分为两层，色素已全部转入上层乙醚中。用滴管吸取上层绿色层溶液，放入另一试管中。加入 30KOH甲醇溶液，充分摇匀，再加入蒸馏水约 3-5 mL，摇匀静置。可以看到溶液逐渐分为两层上层是黄色素，下层是绿色素。 【实验结果】1.各吸收光谱的测定总光和色素波长（nm）第一次第二次第三次 平均色素1色素2色素3色素4400 0.464 0.406 0.471 0.447 0.040 0.053 0.534 0.224 410 0.566 0.496 0.562 0.541 0.043 0.063 0.644
9、0.023 420 0.633 0.560 0.627 0.607 0.047 0.066 0.667 0.331 430 0.749 0.624 0.735 0.703 0.049 0.068 0.796 0.421 440 0.718 0.648 0.706 0.691 0.050 0.078 0.541 0.427 450 0.503 0.446 0.509 0.486 0.053 0.066 0.293 0.496 460 0.493 0.437 0.499 0.476 0.040 0.051 0.224 0.543 470 0.448 0.395 0.458 0.434 0.040
10、0.067 0.230 0.389 480 0.322 0.280 0.338 0.313 0.038 0.045 0.164 0.192 490 0.172 0.145 0.200 0.172 0.025 0.017 0.091 0.084 500 0.082 0.065 0.116 0.088 0.014 0.007 0.057 0.063 510 0.041 0.026 0.076 0.048 0.008 0.005 0.045 0.031 520 0.027 0.015 0.063 0.035 0.005 0.004 0.047 0.035 530 0.024 0.010 0.058
11、0.031 0.003 0.002 0.050 0.035 540 0.028 0.015 0.063 0.035 0.003 0.002 0.052 0.039 550 0.027 0.015 0.062 0.035 0.003 0.003 0.053 0.042 560 0.030 0.017 0.064 0.037 0.002 0.003 0.063 0.045 570 0.046 0.031 0.078 0.052 0.003 0.004 0.084 0.050 580 0.056 0.040 0.085 0.060 0.008 0.011 0.101 0.056 590 0.054
12、0.040 0.085 0.060 0.003 0.005 0.096 0.063 600 0.062 0.048 0.098 0.069 0.003 0.005 0.110 0.069 610 0.081 0.066 0.113 0.087 0.001 0.005 0.140 0.069 620 0.091 0.077 0.124 0.097 0.003 0.005 0.151 0.070 630 0.081 0.070 0.117 0.089 0.002 0.006 0.132 0.083 640 0.111 0.098 0.147 0.119 0.005 0.009 0.138 0.15
13、9 650 0.191 0.172 0.222 0.195 0.007 0.012 0.256 0.202 660 0.363 0.332 0.383 0.359 0.005 0.019 0.541 0.169 670 0.341 0.311 0.362 0.338 0.002 0.014 0.436 0.107 680 0.079 0.069 0.110 0.086 0.000 0.005 0.126 0.032 690 0.014 0.009 0.046 0.023 -0.002 0.000 0.000 0.032 700 0.004 0.000 0.036 0.013 -0.003 -0
14、.003 0.014 0.003 645 0.146 0.131 0.180 0.152 0.006 0.010 0.176 0.194 663 0.396 0.360 0.413 0.390 0.003 0.018 0.583 0.155 总光合色素吸收光谱如图：总光合色素吸收光谱应有两个峰，分别位于 430nm 处（蓝紫光）和 660nm 处（红橙光） 。由图中可以看出，色素 3 和色素 4 在蓝紫光和红橙光处均由吸收峰，可判断出其为叶绿素 a 或叶绿素 b。由于色素 3 的吸收峰在 430nm 处而色素 4 的吸收峰在460nm 处，因而色素 3 为叶绿素 a，色素 4 为叶绿素 b。胡
15、萝卜素类色素在植物叶片中含量较少，因而吸光值较低，二者吸光图谱很相似，吸收峰均在蓝紫光内，并无法准确判断二者。3 叶绿素分离通过滤纸上条带的颜色及前后顺序，可以判断，光和色素 14 分别为胡萝卜素，叶黄素，叶绿素 a，叶绿素 b。4 叶绿素定量5 叶绿素的荧光现象：透射光观察：绿色反射光观察：红色6 光对叶绿素的破坏作用：置于暗处的叶绿素提取液仍为鲜绿色置于光下的叶绿素提取液为黄色结果见附图 17 铜代反应：实验结果见附图 2 及附图 38 皂化反应：实验结果见附图 4【实验讨论】1.由实验结果一可以看出，叶片中叶绿素有两个吸收峰，分别位于在 处的吸收峰主要为，在 处的吸收峰主要为。而计算叶绿
16、素的含量主要是计算在 处的吸收峰。对于两种叶绿素而言，在 645nm 和 663nm 处均有吸收峰，且在这两处的比例吸收系数 K 均已知，由 lambert-beer 定律，可列出浓度 C 与光密度 D 之间的关系式：A663=82.04Chla+9.27Chlb （1）A645=16.76Chla+45.60Chlb （2）解方程（1） （2）即得：Chla 含量（）=12.7 A6632.69A 645Chlb 含量（）=22.9 A 6454.68 A 663菠菜（稀释 30 倍） 玉米（稀释 10 倍）645nm 0.152 0.045吸光值 663nm 0.390 0.163Chla
17、 浓度（g /ml ） 4.544 1.950Chlb 浓度（ g /ml） 1.656 0.268ChlT 浓度（g /ml） 6.200 2.2180.1ml 提取液 Chla 含量(g) 13.632 1.9500.1ml 提取液 Chlb 含量(g) 4.968 0.2680.1ml 提取液 ChlT 含量(g) 18.600 2.218材料中 Chla 含量（g /g） 681.6 889.19材料中 Chlb 含量（g /g） 248.4 122.21材料中 ChlT 含量（g /g） 930.0 1011.39lambert-beer 定律是光吸收基本定律，反应的是光吸收值与液层
18、厚度与浓度之间的关系。其关系式为：A=-lgT = K b c ，其中 K 只与某物质自身的结构相关，是物质的特征常数。本实验所用的比色皿厚度为1cm，因此直接将 K 值带入公式 A=K c 计算浓度。几种光合色素均含有多环共轭结构，该种结构使得其带有不同的颜色，在不同波长处有吸收值。2.一般植物叶片中的叶绿素 a/b 的理论比值应接近3:1，但实验结果看出，,所得菠菜中的叶绿素 a/b 的比值接近 3：1，而玉米则大于3:1。可能原因是因为测定过程中，经过一段时间的光照，材料中叶绿素减少一定量，剩余的叶绿素比值与最初植物材料中提取的叶绿素比值相比会发生一定改变（若两种叶绿素减少量相同，则比值
19、会变大） 。3.从叶绿素 a 和 b 的吸收光谱可以看到，它们在蓝紫区橙红区各有一个强的吸收峰，这说明叶绿素主要吸收橙红光和蓝光。因此，这两种光对光合作用最有效。叶绿素对光谱中段的绿光吸收得很少，绿光被反射出来，这就是为什么植物叶片通常都呈绿色的原因。还可以看到，叶绿素 b 的两个吸收峰比叶绿素 a 的两个吸收峰更为靠近，因此，叶绿素 b 的存在使得叶片的吸收光谱缩短了一些“绿色空档”，从而提高了叶片对不同波长光的利用效率。因此阴生植物叶绿体中有更高比例的叶绿素 b。因为阴生植物所处的光环境比阳生植物差，要吸收不同波长的光才能获得足够的光能来满足光合作用的需要。叶绿素 a/b 的值在生理学上的
20、意义最重要的就是判定植物为阴生植物还是阳生植物。4.光破坏的机理：叶绿素在光下接受电子会迅速从基态窜升至激发态,虽然还会马上回落成基态,但这个过程中会有 90%的能量以热能的形式散失掉,并用剩余的10% 左右的能量发出红色的荧光. 经过一段时间的阳光照射,能量达到一定程度的损失,使剩余的能量所对应的波长不足以发出绿光,只够发出黄光。因此在实验过程中是要尽量避光进行实验，否则光对叶绿素的破坏作用会导致测量结果出现较大误差。若当荧光出现后，立即中断光源，用灵敏的光学仪器还可在短时间内看到红色“余晖”，这就是磷光。 5.从叶绿素 a 和 b 的吸收光谱可以看到，它们在蓝紫区橙红区各有一个强的吸收峰，
21、这说明叶绿素主要吸收橙红光和蓝光。因此，这两种光对光合作用最有效。叶绿素对光谱中段的绿光吸收得很少，绿光被反射出来，这就是为什么植物叶片通常都呈绿色的原因。还可以看到，叶绿素 b 的两个吸收峰比叶绿素 a 的两个吸收峰更为靠近，因此，叶绿素 b 的存在使得叶片的吸收光谱缩短了一些“绿色空档”，从而提高了叶片对不同波长光的利用效率。因此阴生植物叶绿体中有更高比例的叶绿素 b。因为阴生植物所处的光环境比阳生植物差，要吸收不同波长的光才能获得足够的光能来满足光合作用的需要。但由结果2可以看出，植物叶片中叶绿素 a 的含量一般要高于叶绿素 b 的含量，因此可以推断，玉米与菠菜均不属于阴生植物。对于阳生
22、植物来讲，不需要过多的叶绿素 b 来填补空白。胡萝卜素和叶黄素总是与叶绿素 a 和 b 一起存在于高等植物的叶绿体中，它们吸收蓝光，并把吸收的光能传递给叶绿素 a，最终用于光合作用；它们还起到保护叶绿素的作用，可防止强光对叶绿素的破坏。在一般条件下，绿色植物中类胡萝卜素的颜色被叶绿素的颜色所掩盖，秋天，由于叶绿素解体，这些黄色素的颜色便显现出来，其中有些因氧化而变成橙色甚至红色，于是我们便可看到叶片由绿色变黄色或红色的景象。6.研磨时加入少量 CaCO3,可以调节液体的 PH,防止叶绿素被破坏，加入少量石英砂是为了充分研磨破坏叶表皮,使色素能被充分提取.7.取材要避开主叶脉，因为主叶脉上主要是茎中的维管束鞘分支，含有的叶绿体少，使得测量结果偏低。附图一附图二 附图三附图四
