1、膜蛋白质组学在毒理学研究中的应用 黄爱博 1,2、洪文旭 1、许华 2、刘建军 1 1 深圳市疾病预防控制中心深圳市现代毒理学重点实验室，广东 深圳 518055； 2 暨南大学药学院，广东，广州， 邮编 510632 基金项目：国家自然科学基金（ 21102094）；广东省医学科研基金（ A2012577）；深圳市科技计划项目（ 201102100）；深圳市科技研发资金基础研究计划资助项目（ JCYJ20130329161137543） 作者简介：黄爱博，（ 1989-），男，硕士研究生，主要从事蛋白质组学研究。 通 讯作者：刘建军， email:bio- 摘要： 膜蛋白是细胞膜的重要组成部
2、分，执行着细胞内外物质交换、细胞识别与免疫应答、信号转导和调控，以及能量传递等重要功能。随着蛋白质组学技术的发展，膜蛋白质组学成为毒理蛋白质组学研究的重要组成部分，为在膜蛋白水平阐明毒理机制和建立毒理评估模型提供了新的途径。本文综述了近年来膜蛋白质组学的技术进展以及其在 一些 毒理学研究中的应用。 关键词： 膜蛋白质；蛋白质组学；毒理学 细胞膜是细胞对外界的屏障和细胞内外环境交流的界面 ，它使细胞与周边环境隔离开，维持着相对稳定的细胞内环境。膜蛋白是细胞膜的重要组成部分，执行着细胞内外物质交换、细胞识别与免疫应答、信号转导和调控，以及能量传递等重要功能 1。在基因组中，编码膜蛋白的基因约占基因
3、总数的三分之一 2。在已知的药物靶标中，大约有 70%是膜蛋白 3，包括 G蛋白偶联受体、离子通道蛋白，转运蛋白，细胞色素 P450等 4,5。随着蛋白质组学技术的发展和膜蛋白重要功能的突显，膜蛋白质组学已经成为蛋白质组学研究的最前沿领域和热点，关于膜蛋白质组学的动态观察和表征对深入理解生理过程，疾 病机制和药物靶点的寻找具有十分重大的意义 6,7。在毒理学研究中，膜蛋白质组学可利用差异表达的膜蛋白进行外源性物质毒性的高通量评价，为在膜蛋白水平阐明毒理机制和建立毒理评估模型 、寻找生物标志物 提供重要的科学线索。 然而，膜蛋白在生物体中的表达丰度很低，且疏水性强，水溶性不好 8，给膜蛋白质组学
4、的具体操作带来了很大的困难。另外，大部分膜蛋白都会被翻译后修饰（ PTMs），例如糖基化，磷酸化和硫化等。 PTMs致使膜蛋白的微观结构极度不均一 9。由于膜蛋白的强疏水性和 PTMs，使其分离变得的困难 ,从而影响后续 的 2-DE 电泳，反相液相色谱 (RPLC)分析以及质谱鉴定 10。近年来，各种针对膜蛋白性质特点的新方法不断涌现，为膜蛋白的富集、提取、分离和鉴定以及后续的功能研究提供了强而有力的工具。 1 膜蛋白 质 的制备及鉴定 1.1 细胞膜 的溶解和蛋白及多肽的分离纯化 膜蛋白组学研究前，首先是复杂样品的分级纯化，尤其是在复杂混合物中对低丰度蛋白质的富集。比较经典的方法是差速离心
5、法和密度梯度离心法，以及利用细胞表面电荷的两相分配法。近年来，还出现了一系列利用细胞膜蛋白特性来富集 细胞膜 的技术，包括抗体免疫磁珠纯化 11,12、生物素标记法富集 13以及根据细胞表面蛋白糖基化修饰富集 14等技术。在分离纯化细胞膜后，需要对膜蛋白进行进一步的提取。可以通过阳离子交换色谱（ CEX）结合反相液相色谱（ RCP），即多维蛋白鉴定技术（ MudPIT）富集纯化膜蛋白。酶切获取的片段进行二维凝胶电泳（ 2-DE）分离，最后进行质谱分析。上述方法已用于内皮细胞质筏高疏水性多肽的分离 15。由 RCP， CEX和亲水相互作用色谱材料可对 MudPIT进行改进。滞留在柱子上的肽段可被
6、不同的缓冲液按梯度洗脱下来 16。 膜蛋白常被同时磷酸化和糖 基化。这就是不同模式亲和色谱被用于肽段分级纯化的原因 17。固定金属亲和色谱（ IMAC）和免疫亲和色谱（ IAC）可分离胰蛋白酶酶切的磷酸化肽段。通常情况下， IMAC可与 RPC及 CEX联用进而对磷酸化肽段分离，再用电喷雾时间飞行串联质谱（ ESI-QTOF-MS/MS）进行鉴定。O-和 N-连接的糖肽类常被附有固定凝集素的亲和色谱进行富集。 IAC常被用做从复杂混合物中分离纯化特殊蛋白和蛋白混合物 18。 IAC分离纯化鳞状癌细胞系的磷酸酪氨酸信号网络蛋白分子。进而用CEX-RPC分离胰酶酶切所得肽段，并结合 MALDI-M
7、S进行鉴定。样品用不同的去垢剂和离液剂溶解后，结合 2-DE和荧光差异双向电泳（ 2D-DIGE）技术分析。上述方法已被用于疏水和翻译后修饰蛋白的分析 19。 16-BAC/SDS-PAGE比传统2-DE（ IEF/SDS-PAGE）在整合膜蛋白的分辨率和范围上具有显著的优势，已被应用到分离疏水性膜蛋白。膜蛋白包含共价结合的糖基磷脂酰肌醇（ GPI）锚定物。 GPI一般需特定的方法处理，因 GPI与胆固醇和鞘糖脂相连，并聚集在质筏上，在 细胞膜 溶解过程中，对 Triton-X100具有抗性 20。磷脂酶 C可特 定地移除膜锚定物，运用两相萃取法分离后，去除 Triton-X114。 GPI锚
8、定蛋白留在富含去垢剂的相中，磷脂酶 C作用 GPI， GPI溶解度增加，进入水相并从质筏残余疏水蛋白中分离。上述方法一般用作 GPI锚定蛋白纯化的第一步，在第二步中，电泳分离消化蛋白和 LC-MS/MS鉴定。可对整个蛋白混合物进行三氯乙酸（ TCA）沉淀并进行蛋白消化和 LC-MS/MS鉴定。也可用 基质辅助激光解析电离 飞行时间质谱（ MALDI-TOF-MS）和（基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱）MALDI-QTOF-MS/MS鉴定 21。 1.2 膜蛋白裂解为肽段 选择合适的方法将膜蛋白裂解为肽段在蛋白组学中十分重要。在这个过程中，膜蛋白易于沉淀。而且，在消化，提取和后续样品的制备过
9、程中，高疏水性，糖基化，磷酸化的多肽会选择性的丢失。在随后的 质谱 鉴定中，会与实际结果不符 22。肽键内切酶 Lys在尿素存在情况下消化酵母膜蛋白。并结合溴化氢（ CNBr）化学裂解法来裂解与尿素不溶的膜蛋白。大鼠脑细胞膜溶于 90甲酸 并用 CNBr裂解。肽链内切酶 Lys和胰蛋白酶的混合物完成对蛋白的消化，从而进行 MALDI和 LC-MS/MS分析 23。 1.3 膜蛋白的鉴定 膜蛋白组学为理解膜蛋白系统功能和发现与治疗相关的膜蛋白作用位点起到了重要作用 24。近年来，膜蛋白一直被讨论能否作为潜在疾病的生物标志物。细胞膜是动态系统，在细胞相互接触中信号分子传导或在细胞成熟期间起到重要作
10、用。膜蛋白的表达一直发生变化，一些蛋白仅表达于恶性转移或其他形式的细胞功能突变 25。 在考虑到样品准备的重要性和质膜定位出现错误的前体下，选择正确的蛋白 质组学鉴定方法和避免因疏忽偏差而得到错误结论显得尤为重要。 氨肽酶 P和膜联蛋白存在于肺固态肿瘤的细胞膜上，而正常肺内皮细胞中不存在，说明可用放射免疫对抗膜联蛋白 A1从而治疗肿瘤以增加动物生存机率。通过比较健康和疾病组织，研究膜蛋白表达差异将为探究疾病，发现候选生物标记和潜在药物靶点提供重要线索。但上述情况也存在一些问题，如癌组织的不均一性，侵润性癌组织常掺杂健康组织 26。激光显微切割常用于组织样品的分离，通过激光显微切割可获取 100
11、000个癌细胞，为膜蛋白组学的分析提供了充足的材料。通过经典质膜生物标记 ，例如肾的二肽激酶，粘附分子 CEACAM,肝脏脱唾液酸受体和肝细胞癌转铁蛋白受体为质膜研究提供重要提示 27。运用 细胞培养条件下稳定同位素标记技术 (SILAC)定量策略研究人胚胎干细胞在自我更新和分化过程中膜蛋白的差异表达，共鉴定了 1556个差异表达的蛋白质和 527个磷酸化位点，在鉴定的 811个膜蛋白中 6个膜蛋白在未分化的状态下高表达，其中 1个膜蛋白是已知的，另外 5个是潜在的生物标志物 28。膜蛋白的质谱分析大多采用自下而上 (bottom-up)的技术路线 , 也称为鸟枪法 , 即在分离分析之前先将完
12、整的蛋 白裂解成多个肽段 , 然后再对所得肽段进行离子交换和反相色谱分离及质谱分析 29。 2 膜蛋白质组学技术在毒理方面的具体应用 原多甲藻贝类毒素（ AZA-1）对 MCF-7细胞膜蛋白的表达有重要的作用。例如， Na+/K+-ATPase和催乳素受体。 1nM AZA-1处理细胞 24h后将会导致钙粘蛋白的水解， Na+/K+-ATPase和催乳素受体在膜结构水平上的增加。拉春库林（ Latrunculin A）可模拟 AZA-1产生的效应，表明其毒性作用机制是通过阻碍膜蛋白的内吞作用。无质膜渗透作用的生物素酰化 试剂作用完整细胞，实验结果表明 AZA-1处理 MCF-7细胞会使细胞表面
13、总蛋白的水平提高 2倍 30。甲基对硫磷(MP)被广泛用作有机磷农药并与环境生物毒性作用密切相关。运用膜蛋白组学的方法， MP作用斑马鱼肝细胞系 24小时后研究膜蛋白特性的改变。通过 2-DE共发现 13个蛋白质点， MP显著改变了蛋白质的表达水平。采用 MALDI-TOF-MS分析这些蛋白质。 9种蛋白质被鉴定出，其中 7种表达量升高， 2种表达量下降 31。这为更好地理解 MP毒素的机制并且为有效监控水生环境中 MP污染水平和发现新蛋白生物标记提供帮助。 乙醇中毒伴随着氧化应激的发生，从而干扰细胞代谢和改变细胞膜的结构及功能。红茶具有抗氧化特性，保护膜磷脂并有可能保护整合膜蛋白，对 12个
14、月的老年大鼠长期用乙醇处理。检测红茶引起的整合膜蛋白的改变，乙醇毒性组中大鼠肝细胞膜整合膜蛋白减少，同时水解多肽的酶和氨基酸也减少了。红茶处理的乙醇中毒大鼠在一定程度上保护了蛋白质进而抑制乙醇引起的膜结构改变。红茶防止了半胱氨酸，赖氨酸和已经验证多肽的减少 32。总之，红茶一定程度上保护了大鼠肝细胞整合膜蛋白的组成和表达水平，从而对抗乙醇中毒引起的改变。 3 展望 随着 分子生物学的发展，膜蛋白质组学在毒理学研究上将会得到越来越多的应用。高通量膜蛋白质组学技术结合先进的生物信息学分析，为膜蛋白的深入研究提供了新的策略。通过解析膜蛋白受体介导的信号通路和筛选分子标记物，从而建立毒理评价模型，找出
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