1、第四章 细胞化学染色,细胞化学染色，是一种以形态为基础，结合运用化学或生物化学技术对血细胞内各种化学成分作定位、定性及半定量分析的方法。用于研究血细胞生理、病理和化学结构；临床上为某些血液病的诊断、鉴别诊断、疗效观察、预后监测和发病机制的探讨，提供重要依据。,血细胞化学染色的基本要求是在原位显示细胞成分和结构，故在染色时应尽量保持细胞的生前结构、化学成分和酶活性，反应产物应是有色沉淀物，具有一定的稳定性。血细胞化学染色可显示糖原、脂类、酶、蛋白质，包括某些氨基酸、蛋白质SH基、结合的糖蛋白、粘蛋白、核酸（包括RNA，DNA）、及无机盐等。,血细胞化学染色首先是要固定骨髓片或血片，然后才是各种定
2、性、定量的特殊染色。 （一）固定固定有物理法与化学法，前者为干燥和火焰固定，后者最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。,（二）显示 1、偶氮偶联法：这类方法多利用人工合成的酶底物，在酶作用下，产生分解产物，再与重氮盐结合引起偶氮偶联，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的存在。 2、联苯胺法：粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶作用于过氧化氢，释放新生态氧，使无色的联苯胺形成蓝色沉淀。,3、普鲁士蓝法：细胞内、外铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成蓝色亚铁氰化铁沉淀。4、雪夫反应：过碘酸氧化细胞内糖类中乙二醇基形成乙醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀。5、四唑盐法6、金属沉着法其他尚有物理学方法
3、，如脂溶性染料染色（显示脂质）、荧光显示、放射自显影以及体外活体染色亦常用于临床血液细胞学诊断。,（三）细胞化学定量粗略估量，以染色反应的强弱，受色的深浅，人为地区别为阴性和各种程度的阳性。百分法，只能反映细胞阳性率，不能反映受色强弱。积分法，是常用的半定量法，将前述的等级估量与百分率相结合（计算方法见碱性磷酸酶染色），它既反映了细胞阳性率的高低，又反映了细胞受色的强弱。流式细胞仪测定单个细胞内的化学成分含量。以细胞受色反应的强弱比色，常用于RNA、DNA定量测定和各阶段幼红细胞胞浆中血红蛋自定位、定量等。,1985年国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐了五种方法，即：过氧化物酶法、碱性磷酸
4、酶法、酸性磷酸酶法、非特异性酯酶法、氯乙酸AS-D蔡酚酯酶法。这些方法学在白血病的鉴别诊断上很重要，须对其染色方法和临床意义加以充分地理解。下面介绍几种常用的细胞化学染色方法。,一、过氧化物酶染色（POX）,（一）四甲基联苯胺法【原理】 粒细胞和单核细胞的胞浆内的髓过氧化物酶（POX orMPO）分解过氧化氢，释放新生态氧，使无色联苯胺氧化成蓝色联苯胺，后者进一步变成棕色化合物沉着于细胞质内。,【试剂】1. 1%TMB (3,5,3,5气四甲基联苯胺）乙醇溶液O.lg TMB溶于100m1 88%乙醇中，置棕色瓶内，放冰箱中保存。2. 亚硝基铁氰化钠饱和溶液在少量蒸馏水中加人亚硝基铁氰化钠晶体
5、，至不再溶解为止，置棕色瓶内，放冰箱中保存。3. 1%过氧化氢溶液取30%过氧化氢l ml加人蒸馏水29m1，放冰箱中。4. 稀过氧化氢溶液取过氧化氢1滴，加l0 ml蒸馏水稀释（需临时配制）。5. 瑞氏染色液。,【操作】1取0.1%TMB乙醇溶液lml，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10l，溶液呈淡棕黄色。此试剂在临用时配制。2.在新鲜干燥的血片上，加0.1%TMB-亚硝基铁氰化钠饱和溶液的混合试剂0.5m1,放置lmin后，再加稀过氧化氢溶液0.7m1，吹匀，染色6min 。3倾去染液，待干，再用瑞氏染液复染1520min 。4.用水洗后，待干，用油镜镜检。,【结果】 细胞质内有蓝黑色颗粒者为阳
6、性。（） 无颗粒沉着；（） 颗粒细小 ，分布稀疏；（+） 颗粒较粗，局灶分布； （+） 颗粒粗大，分布较密，占胞质 1/22/3；（+） 颗粒粗大，呈团块分布；（+） 全部胞质均部满颗粒，可覆盖胞核。,【临床意义】（1）粒系：POX主要分布在粒细胞和单核细胞内，分化差的原始粒细胞阴性，分化好的原始细胞可出现蓝黑色颗粒，自早幼粒细胞至成熟粒细胞均呈阳性反应，随着细胞成熟的程度而逐渐增强，中性分叶核粒细胞为强阳性。嗜酸性粒细胞阳性程度最强，其阳性颗粒比中性粒细胞粗大，有折光。碱性粒细胞为阴性。,（2）单核细胞： 原始单核细胞为阴性反应， 幼稚单核细胞和成熟单核细胞呈弱阳性反应，颗粒细小，弥散分布。
7、（3）其他细胞： 淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、组织细胞、巨核细胞均呈阴性反应。（4）血小板过氧化物酶主要定位于幼稚型巨核细胞的核膜上，可作为原巨核细胞的一种标志物，有助于FAB M7的识别。,（5）过氧化物酶染色主要用于鉴别急性白血病类型，急性髓细胞白血病多呈阳性反应，以M3和M2型反应最强，MI和M5型反应较弱，故有助于区别M3和M5型。急性淋巴细胞白血病呈POX阴性反应，或阳性原始细胞3%（可能是残留的原粒或早幼粒细胞），故为急性髓细胞和淋巴细胞白血病鉴别的重要指标。,AML-M1,M1 - POX(+),质量保证1. TMB配制在85%一89%的乙醇溶液中染色效果较好，勿用90% -95
8、乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向内渗人而作用减弱。2. 过氧化氢需新鲜配制，其浓度与加人量勿随意更改。 3. 染色液pH应为55。,二、苏丹黑B染色,【原理】苏丹黑B (sudan black B , SB )是一种能溶解于脂肪中的色素染料，可使细胞内的中性脂肪、磷脂和类固醇着色，即使细胞内微细结构的脂类物质也能显示出来。,【试剂】1. 10%甲醛液。2. 苏丹黑B乙醇溶液的制备 贮存液：取苏丹黑B 0.3g于100m1无水乙醇中，经常振摇使其溶解。缓冲液：取169酚溶于30m1无水乙醇中，0.3g磷酸氢二钠溶于100ml蒸馏水，将两份溶液相混。染色液：用前将贮存液60m1与缓冲液
9、40m1相混合，过滤后可用数周。,【操作】、1干燥血片或骨髓片在甲醛蒸气中固定510min。2自来水冲洗35min。3放人染色液中，37 下染色3060min。4用70%乙醇脱色12min（注意掌握时间），然后水洗lmin。.5待干后用瑞氏染液复染2030min。,【结果】 脂类呈黑色或棕黑色颗粒，定位于细胞浆中（+） 颗粒很小，细小、稀疏，或胞质局部面积的1/4有致密的颗粒。（+）颗粒较少，或胞质面积的1/2出现黑色颗粒。（+）颗粒较密，或胞质面积的3/4出现黑色颗粒。（+） 颗粒极密，颗粒间无间隙。,【临床意义】1. 粒细胞系早幼粒及以下阶段随着细胞成熟， 阳性颗粒逐渐增加。早期原粒细胞一
10、般为阴性，少数细小点状颗粒代表线粒体被染上，晚期原粒细胞可出现阳性颗粒，其颗粒限于胞浆的某一区域。2. 单核细胞系阳性，颗粒细小，分布弥散，形状不规则。原单核细胞为阴性。3红细胞系、淋巴细胞系均呈阴性反应4尼曼一匹克细胞和戈谢细胞均为阳性反应。,5苏丹黑B和过氧化物酶染色临床意义相似，主要用于急性白血病类型的鉴别。过氧化物酶染色要求涂片新鲜，立即固定，才能保持酶活性，得出正确结果；而苏丹黑B染色则无此要求。也有人认为在急性粒细胞白血病M1型，苏丹黑B染色较过氧化物酶染色更敏感，但特异性不如过氧化物酶染色（极少数急性淋巴细胞白血病可为阳性）。,M1-SBB(+),M2-SBB(+),【质量保证
11、1苏丹黑贮存液配制后，在室温中要经常摇荡，需数天后才能完全溶解。 2苏丹黑贮存液与缓冲液混合后，需过滤后备用。,三、酯酶染色,酯酶是分解各种酯类的水解酶，根据机制的不同，分为非特异性酯酶和特异性酯酶。单核巨噬细胞类为非特异性酯酶反应而染色中性粒细胞类则为特异性酯酶反应而染色，因此在判别单核细胞类或中性粒细胞类时非常有用，特别是二重染色法非常重要。,酯酶染色的方法较多，常根据其作用液的pH和底物的不同将常用的酷酶染色法分为两类：特异性酯酶(specific esterase)染色法，如氯乙酸AS-D萘酚酯酶(naphthol AS-Dchloroacetate esterase）染色法；非特异性
12、酯酶（nonspecific esterase， NSE）染色法，常用a乙酸萘酚酯酶和a丁酸萘酚酯酶染色法。,(一)特异性酯酶染色法（Moloney）,【原理】氯乙酸AS-D萘酚被细胞内特异性酯酶水解，产生AS-D蔡酚，再与稳定的重氮盐（坚牢紫酱GBC)偶联，生成不溶性红色沉淀，定位于胞浆中。,细胞质酯酶活性部位呈红宝石色颗粒，定位于胞浆中。（） 无红色颗粒沉淀（ ） 颗粒少量、稀疏（+） 胞质内1/2区域出现颗粒沉淀（+） 胞质内3/4区域出现颗粒沉淀 (+) 胞质内全部区域出现颗粒沉淀 (+) 胞质内全部区域出现浓集的颗粒沉淀.,（1）粒系：分化差的原始粒细胞为阴性， 分化好的为阳性， 早
13、幼粒细胞至成熟粒细胞均为阳性， 嗜酸性粒细胞呈阴性或阳性， 嗜碱性粒细胞呈阴性。 （2）单核细胞：绝大多数为阴性 （3）肥大细胞为阴性。 （4）淋巴细胞、红细胞、浆细胞、血小板、 巨核细胞呈阴性。,【临床意义】 本染色法主要用于鉴别急性白血病类型。 （1）急性粒细胞白血病时，原粒细胞和幼稚粒细胞均呈一定程度阳性。 （2）急性单核细胞白血病、急性淋巴细胞白血病，均呈阴性， （3）急性粒-单核细胞白血病时部分细胞阳性，部分细胞呈阴性。,AML-M1,AML-M1 AS-DNCE,质量保证染色温度以3839 为宜，此时酶反应强而无明显扩散。此酶不受氟化钠抑制，并且萘酚和坚牢紫酱GBC较低温时易溶解。
14、,（二）非特异性酯酶染色,血细胞的非特异性酯酶及其同工酶种类很多，凡能作用于短链脂肪酸，水解醇和酚的按酸醋的酶就称为非特异性酯酶。现仅介绍a乙酸萘酚酯酶（a-naphthol acetate es-terase，a-NAE）染色法。【原理】a乙酸萘酚酯酶将乙酸萘酚水解，产生萘酚，再与重氮盐（如坚牢蓝B)偶联，生成不溶性的有色（灰黑或棕黑色）沉淀。,【结果】细胞浆内有灰黑色或棕黑色弥散性颗粒状沉淀为阳性，胞浆内无沉淀为阴 性。“一” 胞浆无灰黑色或棕色颗粒；“” 浅灰色，极少黑色沉淀；“2” 浆灰黑色片状，占胞浆1/2;“3” 浆充满灰黑色沉淀或弥散灰黑色；“4” 浆内较深的灰黑色或充满弥散黑颗
15、 粒。,“一”记为0分，“”记为1分，“2”记为2分，“3”记3分，“4”记为4分。 例如100个细胞中：“”者10个，2”者20个，“3”者2个，“4”者1个，其积分值为：（110）（202）（23）（41）60分。,【临床意义】（1）非特异性酯酶又称单核细胞酯酶，主要存在于单核细胞和组织细胞内，单核细胞胞质呈均匀一致的弥散样的淡红或深红色，无点状颗粒。AML- M5呈强阳性，能被氟化钠抑制，其他细胞不被抑制。（2）有助于鉴别T、B淋巴细胞的鉴别 :成熟T淋巴细胞胞质内有深红色、圆形、边缘清楚，点状颗粒1-2个，呈明显局限性分布。B淋巴细胞阴性（3）骨髓瘤、多毛细胞白血病、T-淋巴细胞瘤呈阳
16、性反应，恶性组织细胞病呈很强弥散阳性反应，粒细胞可呈单核样着色。,AML-M5,AML-M5,AML-M5 ANAE(+),【质量保证】1标本必须新鲜，应于取材后2天内染色。2重氮盐可选择，以坚牢蓝B、坚牢蓝RR 及坚牢黑B重氮盐为好。3染色时间和温度应恒定。,四、过碘酸一雪夫（PAS)染色,【原理】胞浆内存在糖原或多糖类物质（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）经过碘酸（periodic acid）氧化，转变为二醛基（CHO-CHO），与雪夫(Schiff )试剂中的无色品红结合，形成紫红色染料而沉积于胞浆中。该反应称为过碘酸一雪夫(PAS)阳性反应。,【结果
17、】（1）粒细胞系：原粒细胞多呈阴性反应，也可弱阳性。自早幼粒细胞以后随着细胞的成熟程度，阳性反应逐渐增强。嗜酸粒细胞颗粒本身不着色，但颗粒间的胞质呈弥漫性阳性反应；嗜碱粒细胞为阳性反应，颗粒紫红色，大小不一。,中性粒细胞糖原含量参考标准（-） 胞质无颗粒（+） 胞质呈淡红色，无颗粒（+） 胞质呈红色，有少量颗粒（+） 胞质呈暗红色 ，颗粒较密（+）胞质呈紫红色，颗粒极密,过碘酸-Schiff反应(PAS),（2）淋巴细胞系： 大多数淋巴细胞呈阴 性反应， 少数为（+）的阳性反应。 淋巴细胞糖原含量程度参考标准 （-） 胞质内无颗粒 （+） 胞质内有颗粒 （+） 有较粗红色颗粒 （+） 有粗大红
18、色颗粒 （+） 颗粒粗大并有红色块状,（3）红细胞系： 幼红细胞和红细胞呈阴性反应 红细胞系列糖原含量程度参考标准 （-） 胞质无颗粒 （+） 有少数红色颗粒 （+） 有较粗红色颗粒或弥漫红色 （+） 有粗大红色颗粒或深红色 （+）有粗大红色块状或紫红色,（4）巨核细胞： 巨核细胞和血小板染色反应均为阳性 巨核细胞糖原含量程度参考标准 （-） 胞质无颗粒 （+） 少量糖原包涵体 （+） 中等量糖原包涵体，定位于核膜 出或分散胞质中，占胞质1/3 （+）大量糖原包涵体分散于胞质的1/2 （+）糖原包涵体充满整个胞质,PAS 巨核细胞,巨核细胞包涵体,（5）单核细胞呈阴性或阳性，颗粒细小，往往位于
19、胞质边缘； 浆细胞大多呈阴性，少数为红色颗粒阳性； 组织细胞为阴性反应； 巨噬细胞可呈阳性，为红色颗粒反应。,【临床意义】（1）M6与巨幼贫的鉴别 M6的幼红细胞PAS可呈强阳性，积分明显增高，巨贫、再障、溶贫时PAS反应为阴性。（2）急性白血病的类型鉴别 ALL，PAS呈大块状阳性，也可是阴性，AML为阴性，急性单核细胞白血病时原单核细胞及幼单核细胞PAS阳性，积分增高，阳性颗粒小而多，呈弥散分布。,ALL-L1,L1 PAS(+),AML-M5,M5 PAS(+),AML-M6,AML-M6 PAS(+),AML-M7,M7 PAS(+),（3）巨核细胞和Sternberg细胞鉴别 巨核细
20、胞PAS强阳性，Sternberg细胞为阴性或弱阳性。（4）戈谢氏细胞强阳性，尼曼-皮克细胞阴性或弱阳性。（5）淋巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴细胞的糖原积分增高；一般的病毒感染，糖原积分在正常范围内。,【质量保证】1，过碘酸溶液浸泡时间不宜过长，否则醛基进一步被氧化为梭基。2过碘酸和偏重亚硫酸钠易潮解，用后必须密封或放于干燥器内存。3配制雪夫液的器具需十分清洁干燥。雪夫液显红即失效4活性炭可以多加，其目的在于吸附红色。如品红不合格，多加活性炭红色亦不能被吸附掉。5放人雪夫液中染色时，涂片一定要完全干燥，若有水，则雪夫液即变红而失效。6染色时间和温度应相对恒定，一般37C 30min最好。7染色好的
21、标本不能久置，8天后逐渐退色。因此应及时观察结果。,五、中性粒细胞碱性磷酸酶染色,偶氮偶联法（Kaplow法）【原理】中性粒细胞胞浆中的碱性磷酸酶在pH 9.29.8缓冲液中，能水解磷酸萘酚钠，并释放出磷酸与萘酚。再以重氮盐与萘酚偶联成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞浆中。,【结果】坚牢蓝RR阳性为紫黑色颗粒，坚牢紫酱GBC阳性为棕红色沉淀。“一”阴性反应，胞浆中无阳性染色颗粒。“”胞浆中含有少量颗粒或呈弥散浅红色（或弥散紫色）。 “2”胞浆中含有中等量颗粒或弥散受色。“3”胞浆中有丰富的颗粒或弥散深色，胞核清晰。“4”有极丰富的粗大颗粒，充满胞浆，或弥散深色，胞核不清晰。,中性粒细胞碱性磷酸酶(N
22、AP),偶氮偶联法,NAP积分法 计数100个成熟中性粒细胞，按其反应强度分级，各级百分率与其级数乘积的总和，即为积分。 例如： NAP反应结果（%） （-） （+） （+） （+） （+） 20 40 20 15 5 积分=（020）+（220）+（315）+（45）=145 参考值：正常人血细胞碱性磷酸酶除成熟中性粒细胞（杆状核及分叶核）可见阳性外，其他血细胞均为阴性。 中性粒细胞NAP活性积分值一般为1050分，但有时可高达162分。,【临床意义】 （1）生理变化： 新生儿NAP增高，成人较儿童减低，老人更低；激烈运动增高； 月经期经前增高，行经后降低，经后期恢复正常； 妊娠期2-3月轻
23、度增高，以后逐渐增高，分娩时达到高峰，产后恢复正常。,（2）、病理变化 增高：严重化脓性感染、类白血病反应、AA、CML加速期、ALL、CLL、恶性淋巴瘤、癌转移、MM、真红、骨髓纤维化等。 减低：PNH、CML、恶性组织细胞病、MDS。,（3）疾病鉴别诊断 慢粒与类白的鉴别：CML减低，类白增高。 急性白血病的鉴别：AML减低，ALL增高。 PNH与AA鉴别：PNH减低，AA增高。 病原微生物的鉴别：病毒感染减低，细菌感染增高。,NAP (+),CML-NAP(-),六、酸性磷酸酶染色（ACP）,【原理】 血细胞内的酸性磷酸酶在酸性条件下，将基质中的磷酸萘酚AS-BI水解，释出萘酚AS-BI
24、，再与重氮盐偶联，形成不溶性有色沉淀，定位于胞浆中。,2、结果 阳性反应为棕黑色颗粒沉淀， 定位与胞质中。 粒细胞、淋巴细胞、巨核细胞、血小板、浆细胞、巨噬细胞呈阳性。,酸性磷酸酶(ACP),偶氮偶联珐,3、临床意义 （1）白血病类型鉴别 多毛细胞白血病的多毛细胞ACP呈强阳性或中等度阳性，且不被L-酒石酸抑制；CLL和淋巴瘤ACP常呈弱阳性反应；急单核细胞白血病的原单核、幼单核细胞ACP为强阳性反应；急粒细胞白血病的原粒细胞对ACP反应不一。,ACP(+),毛白,T-ACP,（2）有助于T淋巴细胞和B淋巴细胞的鉴别：T淋巴细胞ACP呈阳性反应，颗粒粗大、密集、局限性块状阳性； B淋巴细胞AC
25、P呈阴性反应或颗粒稀疏、细小的弱阳性反应。 （3）戈谢细胞ACP呈强阳性反应， 尼曼-皮克细胞呈阴性或弱阳性反应，有助两者鉴别。,ALL-ACP(+),七、骨髓铁染色,【原理】正常人骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中，骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝反应，形成蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位，从而反映骨髓中铁的储存量。化学反应过程为： 4 Fe3+ 3 K4Fe（CN）6 Fe4Fe（CN）6312 K+（含铁物质） （亚铁氰化钾） （亚铁氰化铁）,【结果】 （1）细胞外铁的观察 ： 细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小株状或团块状。 以油镜观察定级标准 （-） 无铁
26、粒可见。 （+） 少数铁粒或铁小珠。 （+） 较多铁粒和铁小珠。 （+） 很多铁粒、铁小珠和少数小块。 （+）极多铁粒、铁小珠并有很多小块，密集成堆。 正常范围：+，“+”占2/3，“+”占1/3。,细胞外铁,（2）细胞内铁观察： 细胞内铁指有核红细胞胞质内出现蓝色颗粒，以油镜计100个中、晚幼红细胞，记录胞质中含有蓝色小颗粒（即铁粒红细胞）的比值。并根据细胞铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布情况，将铁粒幼红细胞分为如下四型。,细胞内铁,型：仅含1-2个铁颗粒。 型：含3-4个铁颗粒。 型：含6-9个以上铁颗粒。 型：10个铁颗粒。 正常范围：30% 90% ，平均60%， 多见型，少见型，无、型。,（3）环形铁粒幼红细胞： 指含铁颗粒6个，其中2/3以上铁颗粒围绕核周排列成完整环形或不完整环形。 正常或非铁粒幼细贫血无环形铁粒幼细胞，铁粒幼细贫血中环形铁粒幼细胞6% 。,
