1、 药物分析 综 述 题目： 液相 核磁共振联用技术在中药分析中的应用 组员 姓名： 黄志华、窦文渊、 彭 啟 柏 所在学院： 药科学院 专业班级： 药学 05（ 5）班 学号： 0503501564、 0503501565、 0503501535 日期： 2008-6-2 1 液相 核磁共振联用技术在中药分析中的应用 摘要 : HPLC一 NMR联用技术是一种高效、快速获得混合物中未知化合物结构信息的 术 ， 近 年来，它在药物研究中的应用日益广泛 。 本文介绍了 HPLC一 NMR联用技术及其在中药分析中分离、结构鉴定 、构型分析等方面的一些 研究 应用。 关键词 : 液相 核磁共振联用技术
2、 (LC NMR) 中药分析 中药是中华民族的瑰宝，数千年来，中药对中国人民的医疗保健发挥了巨大的作用特别是随着我国加入世界贸易组织后，以仿制为主的西药研制将遇到严重挑战，中药己成为我国最有优势的研究与开发领域。充分利用现代科学技术的方法和手段，按照国际认可的医药标准规范，研究开发能够正式进入国际医药市场的中药产品，推动中药的现代化，不仅具有经济效益也具有巨大的社会效益。在这其中，中药及其复方的药效物质基础研究是中药现代化研究的重点与突破口 ，它关系到药材、饮片，中药制剂和中成药产品等的质量控制等。 中药的真伪鉴别和品质评价是临床应用、成药制备、中药科研不可缺少的前提条件。我国药材品种繁多，存
3、在南北差异、同名异物、同物异名等情况，混淆品极多，疗效也各不相同。而且中药的有效成分和环境、产地、采收季节等因素也有很大关系。加之近年来，假冒伪劣中药充斥市场，为控制中药质量、保证临床用药安全和有效，需要对中药进行严格鉴定。随着科技不断发展，从最原始的眼观、鼻闻、口尝、手摸到显微鉴别和理化鉴别，再到光谱、色谱等现代技术的应用，中药鉴定技术越来越多元化。但每 一种分析技术均有其适用范围和局限性，将单一的分析技术联合起来，不仅能获得更多的信息，而且可能产生单一分析技术所无法得到的新的信息。因此，联用技术已成为中药鉴定发展的一个重要方向。 HPLC虽然 是复杂成分的分离中最有力的工具 ，微处理机的应
4、用 ，简化了仪器操作，并能够实现全自动化， 应用极为广 ，通过 UV可变波长检测器， 可 获得一些化合物的附加信息，但信息量非常有限 ，对活性成分的结构鉴定帮助不大。 NMR能够提供大量的结构信息，包括立体化学信息 (在某些情况下，它不需其他光谱的信息，就能解析未知物的结构 )。 因此 NMR对中 药 中活性成分的结构鉴定有很大的帮助。毫2 无疑问， HPLC NMR联用技术对中药的分析研究中活性成分的分离和结构鉴定的速度将大大提高。 以下对 HPLC NMR联用技术 操作及在中药中的 分析 应用作简单的介绍。 1. HPLC NMR联用技术 HPLC NMR联用技术 的研究开始于 20 世纪
5、 70 年代 ,早期发展十分缓慢，主要是因为当时 NMR仪的灵敏度还较低，溶剂峰抑制问题也尚未解决。近年来 HPLC-NMR联用技术的迅速发展得益于 NMR波谱仪磁场强度的提高、 HPLC NMR专用探头的设计及溶剂峰抑制技术的发展，从而解决了动 态变化、灵敏度及溶剂抑制 (尤其是梯度系统 )的问题。 当时该仪器可采用停止流动模式 ,随后不久连续流动模式打通 ,从此以后 ,随着仪器设计、磁场强度、流动探头等方面研制水平的提高与改进 ,以及有效的压制溶剂峰的脉冲序列的建立 ,使得这项技术现在已广泛应用到实际工作中 。 1.1 基本操作模式 LC NMR联用技术主要有三种操作模式 :连续流动操作模
6、式、停流操作模式和峰存贮操作模式。 1.1.1 连续流动（ on-flow）操作模式 :样品由 HPLC常规检测器（ UV等）出口，用毛细管直接连接到专用 NMR探头的液槽，毛细管的长度为 2m。随着分离连续获得 NMR图谱，一次分析可得到所有组分的 NMR信息，然而由于样品溶液浓度低， NMR采样时间短（通常扫描 16次），很难得到分辨率良好的 NMR图谱。 1.1.2 停流 (stop-flow)操作模式：当样品色谱峰最高点到达 NMR液槽的中心位置时，停止流动，进行一维或二维 NMR采样，直至 获得良好的 NMR图谱。然后再启动输液，恢复正常 HPLC条件，继续下一色谱峰的 NMR测定。
7、在出峰时停泵，可以获得较好的 NMR图谱。 1.1.3 峰存贮操作模式：当欲分析组分较多而各组分的含量较低时，为避免由于多次暂停 LC分离而带来峰扩散现象，可采用峰存贮操作模式。正常色谱分离时当 UV检测到色谱峰时将流出物收集并暂时贮存到不同的毛细管回路内，由 NMR谱仪逐一离线测定各流分。该模式下的样品 需要量低于停流操作。这样既不中断 HPLC过程，又能获得全部成分的良好的 NMR图谱。除用毛细管回路贮存色谱成分外，还有小柱截留法。 1.2 溶剂峰抑制方法 大多数 HPLC体系采用反相柱 ,使用 2种或 3种溶剂的混合物作洗脱液 ,除 D2O外 ,其它氘代溶剂作为常规洗脱液太昂贵。因此 ,
8、在线反相 HPLC - NMR实验中常采用含质子的溶剂 ,如CH3 CN 和 CH3 OH 等。常用的 MeOH - H2 O 和 MeCN - H2O体系在 NMR中有很强的响应值 ,可能掩盖分析对象。为了消除 NMR波谱仪接收器的动态范围问题 ,溶剂质子信号必须加以抑制 ,3 常用的方法有 : (1)采用氘代溶剂 ,但价格昂贵 ,适合于 HPLC。 (2)通过不同频率通道进行多重溶剂峰预饱和。 (3)脉冲梯度场的相位离散而消除溶剂干扰。 近年来由于毛细管 HPLC的发展 ,溶剂的消耗量大为减少 ,在实验中有可能完全使用氘代试剂作洗脱液 ,不必使用溶剂抑制。 1.3 灵敏度的提高 提高 HP
9、LC - NMR灵敏度的方法有 : (1) 利用 SPE等方法浓缩样品。要得到高分辩的谱图 ,溶液中不能有悬浮的灰尘和纤维。一般情况下用棉花和滤纸把样品直接过滤到样品管中。测试微量样品时 ,要带手套处理样品 ,以防手指上的微量物质溶在溶液中 ,否则 1H谱中 1. 4会出现一个 7 Hz裂分的双峰 , 4还有一个四重峰 ,可能来自丙氨酸或乳酸。 (2) 提高磁场强度 (900 MHz NMR已经商品化 )。核磁谱仪场强的不断升高 ,从某种程度上增加了 NMR的灵敏度和分辩力 .从 1987年第一台 600MHz的 NMR仪 ,到现在已经发展到900MHz了。 (3)降低探头温度 (商品化的低温
10、探头 ) 。利用高温超导薄膜材料而制成的超导低温探头 ,当样品温度由温控单元维持时 ,采用闭环或开环制冷系统使超导线圈温度降到 25K,消除了谱图的电噪声 ,相对常规 5 mm探头而言 ,其潜在灵敏度可以提高 8 10 倍。国内已有此类探头使用 , 500MHz信噪比达 3 200 1,可达到 800MHz水平。 2. HPLC NMR在中药分析中的应用 2.1 HPLC NMR联用技术在检测植物药有效成分中的应用 2.1.1 半夏水提取物中的应用 陈平 、 梁世瓢 等利用 HPLC NMR对半夏 水提取物中 8种化合物的结构进行分析 . 他们采用 Loop-collection（环收集方式）
11、 的工作方式，将液相分离后不同组分分别收集在不同馏分收集环 (Loop)里，然后逐个注入流动探头，再根据化合物浓度不同 ,进行不同采样时间的核磁共振检测，根据需要增加低浓度样品的核磁采样时间。由实验结果分析而得半夏水提取物中的 8种化合物分别是胞昔、酪氨酸、尿普、腺喋吟、鸟营、苯丙氨酸、腺营和色氨酸 (Figure2-6)。实验过程中被测组分从 loop中进入 NMR分析，在数据采集前必须利用溶剂抑制技术去除流动相产生的巨大的共振 信号的干扰。使用溶剂抑制技术带来的一个问题是如果被测化合物的 NMR共振信号恰好在溶剂峰包埋之下，则这些信号将与溶剂信号一4 样被压掉。当被测化合物是未知化合物时，
12、这些信号的缺失将会严重。 2.1.2 对蛇葡萄根的化学成分的研究 王映红、李娜等通过用 HPLC NMR仪对葡萄科蛇葡萄根的化学成分进行研究。在 INOVA 2500 LC NMR上 , 用停止流动的方法采集 LC NMR 1H NMR谱及 WEGCOSY谱 . 进样量为 25 L , 1H NMR 谱采样时间为 1.5 s ,累加次数为 416。 WETG2COSY的 F1 , F2 均为 60000. 0 Hz , nt = 24 , ni = 128 ,总采样时间为 1h7min37。由 结果鉴定出其中主要成分的结构为一白藜芦醇四聚体 Vitisin B。 2.1.3 对长叶框树中的木脂
13、素类化合物的分析 Zhao等用停止流动 HPLC-NMR鉴别了紫杉科植物长叶框树中的木脂素类化合物。长叶框树针叶样品经提取、固相提取等预精制后，以梯度洗脱 HPLC分得 8个化合物峰，通过停止流动方法记录 1H NMR谱，再结合 EI-MS等对其中 7个化合物作了结构研究。峰 1-6分别为化合物络石昔元、去甲络石糖昔元、牛芬昔元、欧侧柏内醋甲基醚、松脂素和甲基松脂素。峰 7的 HPLC-1HNMR谱与 1-6的不同，提示为一个新木脂素型化合物。峰 8通过 HPLC NMR测定，表明是一个未知结构的非木脂素类化合物。 2.1.4 对棕 榈 油提取物的分析 StrohscheinL等以 C30HP
14、LC NMR联用研究了富含维生素 E同系物的粗棕 榈 油提取物。通过对图谱分析分离、鉴定去粗棕 榈 油提取物中有一和 -型生育三烯酚、型生育三烯、 a一生育三烯酚、 a一生育酚、 a一生育烯酚。本方法用甲醇作为流动相而不需 加缓冲液的色谱条件对联用技术来说是理想的。 2.1.5 山蓝色素前体分子组成与化学变化 的研究 谢运昌 、 文永 新 等用 HPLC NMR联用技术研究山蓝中 山蓝色素前体的分子组成与化学变化，由分析 1H NMR图谱表明 山蓝色素前体分子有由 2个紫蓝氨酸残基和 1个氨基酚残基键合而成的片段，在室温下放置后，氨基酚结构转变为醌结构。研究结果为山蓝色素前体、山蓝色素及其相关
15、化合物的结构测定提供了重要数据为山蓝色素的化学、山蓝色素形成机理的阐明起到了关键作用。 2.1.6 LC一 NMR联用技术分析黄连中微量生物碱的研究 王爱国 、 冯 幸章等运用 INVOA 500 LC一 NMR联用仪对黄连中微量生物碱进行 LC一 NMR研究，分别测定几个微量成分的 1H NMR，根据 LC一 NMR分析，推定黄连总碱中几个微量成分为化合物 (1)为 5一羟基一 13一甲基小檗碱；化合物 (2)为 5-羟基一棕榈碱 ； 化合物 (3)为 13一甲基小 檗 碱 ； 化合物 (4)为棕 榈 碱， 该研究对黄连成分的研究有重要的指导意义。 5 2.2 HPLC NMR对双氢青蒿素差
16、向异构体转化的研究 刘宁 、 杨 腊虎等通过 HPLC NMR仪对双氢青蒿素进行分离和测定。在 HPLC色谱条件下所分离而得的 2个异构体 以工 作 频率为 500MHz的 NMR仪进行分析 ,用氘代甲醇为溶剂 ,并兼作化学位移内标 ,在室温下对溶解在氘代甲醇 30min后和异构体转化平衡时进行氢谱检测 。在对实验初期和放置一段时间后的 1H NMR图谱比较 ,在 1H NMR图谱中明显一个峰位高低转化的过程 ,说明双氢青蒿素在溶液中存在异构体的转化过程 。并由图谱得出 2个异构体的1H NMR图谱主要在 5位 H于 12位 H化学位移值有明显的差异。 2.3 LC-NMR在用血清药化学方法对
17、单味中药内活性成分进行研究中的应用 杨春、梁晓天等 以“血清药物化学”方法为研究思路， 用 LC-NMR联用技术对服用当归后大鼠的血清样品进行研究，分析其中的活性成分。 用 HPCL法在大鼠服药后的血清中发现了 5个当归活性成分，在肝脏中发现 8个当归活性成分。用 HPLC一 NMR联用技术对肝脏和血清中 2个主要活性成分研究表明，它们为莫本内 酯 和 6， 7一二羟基一 3a， 6， 7， 7a-四氢藁 本内 酯 。在服药后大鼠的肝脏中，阿魏酸的含量最高，而 6, 7-二羟基 -3a,6,7,7a-四氢藁 本内 酯 的含量比 藁 本 内酯高。在血清中， 6, 7-二羟基 -3a,6,7,7a
18、-四氢藁本内酯 的含量最高，而 藁 本内 酯 的含量较低，未发现阿魏 酸。在大 鼠 服 药后 1.Oh 的肝脏中发现阿魏酸的含量最高，而 藁 苯类化合物的含量并不高。这可能由于阿魏酸的水溶性大，而 藁 苯类为脂溶性化合物，因此阿魏酸在体内吸收较好。但在 1.Oh 的血液中并未发现它的存在，可能其代谢较快。 由于体内生物样品中的活性成分来源于中药，在排除代谢产生的成分后，通过对中药中相应成分的检测，可知中药在体内的活性成分，这为中药的研究提供了一种新的思路。 总结 实践证明 HPLC NMR 在结构具有规律性的同类化合物的鉴定中 ,可起到提高工作效率、避免盲目重复劳动的作用 . 在中药分析的提取
19、分 离工作中不但有指导作用 ,还 可以提供较为准确的光谱信息 , 排除杂质的干扰 ,大大降低了中药中混合物结构分析的难度，从而可以 确定其结构和立体构型。 在过去几年里，虽然 HPLC NMR联用技术的灵敏度已大大提高，并在分离和鉴定上有了一些成功的应用，但 仍不够满意，柱与池间以及池本身造成的峰扩散需进一步降低。不断提高 NMR的灵敏度和色谱光谱分辨能力，使得实验结果更准确可靠。 参考文献 6 1. 刘文英 药物分析 第 6版 人民卫生出版社； 2. 徐苏丽 联用技术在中药研究中的应用 海峡药学 2007年第 19卷第 6期 ； 3. 张亮，张正行 HPLC/NMR联用技术 及其在药物分析中
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