1、第六章 DNA重组的操作,第一节 DNA的体外重组第二节 重组体导入受体细胞的原理与技术第三节 重组子的筛选和鉴定,外源DNA,载体DNA,重组分子,原核细胞,真核细胞,扩增或表达,表达,连接,转化或转导,电穿孔或显微注射,受体细胞,第一节 DNA的体外重组,第一节 DNA的体外重组,一、黏性末端的连接 二、平末端的连接 三、PCR产物的连接 四、Gateway载体构建系统,第一节 DNA的体外重组,重组DNA,重组DNA是来源不同的DNA在体外结合在一起从而形成的新的DNA分子Recombinant DNA 形成重组DNA的目的有三个： (i)形成新的蛋白产物 (ii)形成多拷贝的基因 (i
2、ii) 插入外源基因片段到新的物种中从而赋予其新的特性,一、重组DNA的概念和目的,第一节 DNA的体外重组,二、外源基因与载体的连接1. 粘性末端连接（由同一种酶或同尾酶产生末端）,第一节 DNA的体外重组,二、外源基因与载体的连接1. 粘性末端连接（1）具有相同粘末端的DNA分子之间的连接,使用碱性磷酸酶处理载体DNA，去掉其5末端的磷酸基，以防质粒DNA的自身环化 。,第一节 DNA的体外重组,第一节 DNA的体外重组,二、外源基因与载体的连接1. 粘性末端连接（2）具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接,质粒载体的定向重组,第一节 DNA的体外重组,二、外源基因与载体的连接2. 平头末
3、端连接（1） 直接连接5端与3端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。,5,5,5,5,3,3,3,-OH,-OH,-P,-P,P-,P-,HO-,HO-,5,3,-OH,-P,P-,HO-,5,3,3,第一节 DNA的体外重组,非酶切位点,二、外源基因与载体的连接2. 平头末端连接（2） 人工加尾形成 “粘性末端” a）同聚加尾 法,第一节 DNA的体外重组,第一节 DNA的体外重组,二、外源基因与载体的连接2. 平头末端连接（2） 人工加尾形成 “粘性末端” b）衔接物(linker)连接Linker:用化学合成法合成的
4、一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。linker的作用：用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。,GGAATTCC CCTTAAGG,EcoRI linker：,第一节 DNA的体外重组,衔接物(linker)连接,第一节 DNA的体外重组,衔接物(linker)连接,优点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2）能给载体连接上Polylinker 缺点：如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段,第一节 DNA的体外重组,二、外源基因与载体的连接2. 平头末端连接（2） 人工加尾形成 “粘性末端” c) DNA接头 (ad
5、apter)连接法 adapter: 有单链，也有双链。双链的一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。 adapter的作用:用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。,5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5,BamHI adapter,第一节 DNA的体外重组,缺点：接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。防止自我连接：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）,c) DNA接头 (adapter)连接法,二、外源基因与载体的连接3.PCR产物的连接（1）在引物的5
6、端设计酶切位点,GCAGAATTC,互补序列,3端1520bp与模板互补； 5端610bp是某个内切酶的识别序列,（5端多余的35bp属保护碱基）,第一节 DNA的体外重组,第一节 DNA的体外重组,引物1,GCAGAATTC,互补序列,模板,EcoRI位点,5-,-3,GCAGAATTC,互补序列,5-,-3,3,模板,GCAGAATTC,互补序列 PCR产物,5-,-3,3,复性,延伸,模板,模板,3,第一节 DNA的体外重组,GCTAGCCGG,互补序列,模板,BamH I 位点,-5,3-,复性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互补序列,3-,模板,GCTAGCCGG,P
7、CR产物 互补序列,引物2,3,3,第一节 DNA的体外重组,二、外源基因与载体的连接3. PCR产物的连接（2）与T载体直接连接 Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）,因此PCR产物两个3端一般都有一个AT载体的两个3端人为地各加一个T：利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！,第一节 DNA的体外重组,A,A,dNTP,T,T,dTTP,Taq DNA聚合酶,载体,PCR产物,T A,T A,第一节 DNA的体外重组,T载体图,二、外源基因与载体的连接3. PCR产物的连接（2）与T载体直接连接,第一节 DNA的
8、体外重组,二、外源基因与载体的连接传统方法,第一节 DNA的体外重组,二、外源基因与载体的连接4.Gateway 载体构建系统利用噬菌体的位点特异性重组系统，在不进行酶切和连接的基础上实现基因快速克隆及载体间平行转移，有利于保持正确的开放阅读框和插入方向。,第一节 DNA的体外重组,二、外源基因与载体的连接4.Gateway 载体构建系统,第一节 DNA的体外重组,二、外源基因与载体的连接4.Gateway 载体构建系统,4、Gateway 载体构建系统,噬菌体位点特异性重组系统；高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移。,入门克隆,改造过的各种表达载体,4、Gateway 载体构建系统,（1
9、）创建入门克隆 BP反应：attB+attP attL+attR，产物：入门克隆,入门克隆,改造过的各种表达载体,4、Gateway 载体构建系统,（2）构建表达克隆 LR反应：attL+attR attB+attP，产物：表达克隆,入门克隆,改造过的各种表达载体,第一节 DNA的体外重组,三、DNA体外连接应注意的事项1.插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。决不能进行非粘性末端连接。,EcoRI,EcoRI,EcoRI,（1）用相同的酶切,（2）用同尾酶切,BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。,第
10、一节 DNA的体外重组,三、DNA体外连接应注意的事项2. DNA插入的方向正确,由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。,用双酶切,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,第一节 DNA的体外重组,三、DNA体外连接应注意的事项3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。,ATGGAATTC,载体,ATGCGGAATTCT,插入片断,EcoRI,EcoRI,ATGGAATTC T,重组,但移码突变！,第一节 DNA的体外重组,三、DNA体外连接应注意的事项4. 防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。,第一节 DNA的体外重组,四、载体和外源DNA插入片段的连接结果,1. 载体自身环化连接（能存活）,2. 载体之间互相连接（能存活）,3. 插入片段互相连接（不能存活）,4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活）,5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活）,第一节 DNA的体外重组,
