1、稳定表达系统和瞬间表达系统的区别稳定表达系统和瞬间表达系统是按目的蛋白表达的时空差异来分的；瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体 DNA 随细胞分裂而丢失，目的蛋白的表达时限短暂。瞬时表达系统的优点是简捷，实验周期短。大规模的瞬时表达技术是近年来的一个研究热点。已有报道能放大到 100L 反应器中生产重组蛋白，产量可达110mg/L。缺点是该方法技术条件要求高，如质粒的纯度、转染的效率等，而且瞬时转染得到的蛋白质产物保存时间较短，只能持续数天或 2 周。这是因为瞬时转染中，外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不与基因组染色体相整合，当细胞复制后，诱导的性状消失。稳
2、定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载体 DNA 稳定存在于细胞内，可随细胞转录表达和传代，目的蛋白的表达持久、稳定。缺点是由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。有研究表明：把目的基因定点整合入染色体高活性位点有望能在较短时间内获得高表达细胞株。另外，近年来还报道了一些筛选高表达克隆的新方法，如影印法、固相筛选技术等，对缩短实验时间甚有帮助。CHO 细胞的背景资料CHO 细胞即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary)，该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。全世界批准正式应用于人类疾病治疗或疾病预防的基因工程产品约有三
3、十多种，其中只有一种(乙肝疫苗)是由酵母菌生产的，其余所有产品都是由 CHO 细胞和大肠杆菌生产的，大肠杆菌不能形成有活性的二聚体(如白介素 2)，也不具有糖基化的功能(如 EPO)，而 CHO 却具有如上的功能，因此CHO 成为表达复杂生物大分子的理想宿主。另外 CH0 细胞在基因工程使用中还有一个优点，该细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌 CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利。CHO 细胞的培养基类型：1. 血清培养传统上 CHO 细胞的培养都是在 DMEMF12 基础培养基中添加 510 的小牛血清(用于重组蛋白)或胎牛血清(用于
4、杂交瘤生产)单抗来完成的，血清除了供给细胞的营养成分外，还能促进细胞开始合成 DNA，对细胞的增殖有很大的作用。实验证明，血清在细胞的体外培养中提供了细胞增殖所必需的生长因子。但是从重组蛋白生产的角度来看，出于 Q 和 Qc 的要求，每换一个批号的血清，都包含大量的验证工作，这就给生产带来很大的麻烦。另外血清来源于动物因此经常被污染，污染的血清往往导致细胞生长缓慢，蛋白产量下降，甚至导致细胞死亡。目前购自各大公司的血清虽能消灭细菌和所有支原体，但很难保证除去所有的病毒污染。血清的成分十分复杂，经研究表明，血清除含有促进生长的活性成分外，还含有一定的细胞毒性物质和抑制物质，对细胞有去分化作用，影
5、响细胞功能的表达 血清复杂的成分也给基因工程表达产物的下游工作带来很大的困难。培养方法： 把培养瓶内的培养基用 5ml 的移液管转移到保存用的离心管里。 用培养液量的 1/2 的 PBS（25ml2.5ml）清洗细胞表面（2 次）。 再用培养液量的 1/10 的（25ml0.5ml）的胰酶冲洗细胞表面 再 CO2 培养厢里静置 5 分钟。（利用这段时间，准备好 15ml 的大离心管，并也好标签做好记号。） 物理方法处理，（敲击培养瓶两侧）是细胞脱离，再用显微镜确认是否完全脱离。加入等倍量的（25ml5ml）培养基，充分冲洗培养瓶内表面，在连同细胞全部转移到大离心管中。离心分离（1,000rpm
6、、4、10min）。（这段时间准备新的培养瓶，按照 9/10 的量（25ml4.5ml），加入培养液准备好。加入 MTX 的同时加入。）离心分离后，为了避免沉淀细胞扩散到溶液里，要迅速将上清用吸管吸除。加入培养液(DMEM+FBS,25ml5ml)，用移液管充分混匀细胞。按 1/10 量，（25ml0.5ml）将细胞悬浊液注入新培养瓶中。?在 CO2 培养厢中 37 度条件下培养。培养液总量为 5CHO 细胞培养：CHO 细胞株置于 RPMI1640 培养基中，内含 10%灭活小牛血清，青霉素 100IU/mL，链霉素 100IU/mL，置于 37，5%CO2 的培养箱（德国 Heraeus）
7、中培养。每隔 48h 换培液，当单层培养细胞汇合以后，用 0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。将培养瓶中的 CHO细胞按 1105/mL 传代移入培养板中，待进入对数生长期后（约 24h）加药。2. 无血清培养利用含血清培养基生产蛋白制品有许多不利，如增加培养成本和污染机会，增加纯化难度和成本，增加产品质控指标。因此，大规模生产临床使用的生物制品，应尽量减少血清的用量，最好用无血清培养基取代。为此，应尽可能增加大规模细胞培养的接种密度，以缩短生长延滞期，提高细胞比生长速率。如果接种密度较低时，在培养开始阶段，可使用含血清培养基，待细胞密度达到一定浓度(如106/ml)，细胞进入对数生长期，再降低
8、血清浓度或使用无血清培养基。外源蛋白的实际产量无明显下降。许多实验表明，细胞的比生长速度相对降低时，产物的比生长速率提高，原因可能是用于细胞增殖的能量减少，有利于外源蛋白的生产。 使用无血清培养墓代替含血清培养基，可克服血清带来的弊端。但失去血清中的促细胞生长因子，细胞生长减慢，密度降低，生存周期缩短，导致蛋白产最下降。因此，往往通过增加无血清培养基中的营养物质，以优化细胞培养，提高蛋白表达。用作血清替代成份的种类很多，大致可分为激素和生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子及低分子量营养因子四类。有研究报道，添加 BSA 对促进细胞生长作用显著，丙酮酸钠、腐胺、丁酸钠有利于表达目的产物。不同的 C
9、HO 工程细胞的培养基添加成份可能存在差异，一般需要自己进行摸索最优条件。 一例无血清培养试验步骤1实验材料 % G5 M4 E/ c$ m4 d nCHO 细胞株购于俄罗斯 Soym Agromed，无血清培养基(CHO-S-sFM1I)购于 Gibeo 公司。 2实验方法 . y) w9 Q( “ f2.1 无血清培养基的配制 6 V/ A! h& K: e7 U/ S用 90ml 纯水溶解制备 1 升量的袋装 Gibeo CHO-S-sFM1I，加人 2.45g NaHC03，用 1N NaOH 将 pH 调为 8.0，再用 1N HC1 调回至 pH7.1，定容后用 0.22m 滤器过
10、滤除菌。2.2 CHO 细胞的适应 用含血清的常规培养基和无血清培养基 1:1(v/v)悬浮细胞，接种量为 3105 个/ml。在 37，8培养箱中培养，使细胞密度达 5105 个/m1。然后用等体积的 CHO-S-sFM1I 将细胞稀释到 3x 105 个/ml，继续培养，重复上述操作，直至血清浓度降为0.1后，用完全无血清培养基培养到 3106 个/ml。再以 3l05 个/ml 接种，传 50代，至此完成适应工作。4 & X$ y. Y# d+ R) W1 vCHO/DHFR-表达系统的特点CHO 表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，与其它表达系统相比，它具有许多优点：准确的转录
11、后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子；表达产物胞外分泌，便于分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；贴壁生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到 1000L 以上；CHO 细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化。某些利用 CHO 细胞表达的外源基因药用蛋白 产量G-CSF 90g/1x106ce1124h: 55.6gml72hFSH 14mgL24hFEP0/h 10085Um 了Pro -UK5001000IU106ce1124h8001500IU106ce1
12、124hIL -6 36.8g106ce1124hIL -12 105UmlIFN(7) 4 9gmlAT+ 67.980g106ce1124hCMPATH-1H: / 131.1mgL 122h)GP1 0.64mgml8TIMP 180gml$ L9 e目前常用的 CHO 细胞包括原始 CHO 和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株 CHO。CHO-dhfr-细胞自身缺失二氢叶酸还原酶（dhfr），无法自身合成四氢叶酸，所以必须在添加了次黄嘌呤（hypoxanthine）、胸腺嘧啶（Thymidine）和甘氨酸的培养液中才能得以存活。而通过目的基因与 dhfr 基因共转染，不
13、仅得到在不含上述添加剂的培养基上也能生长的细胞克隆，更为重要的是由于 dhfr 可被叶酸类似物 MTX 所抑制，在 MTX 浓度选择压力下，dhfr 基因必须扩增到很多的拷贝数才能生存，从而得到抗 MTX 细胞系；又由于与 dhfr 基因共转染的目的基因倾向于同它一起整合到细胞染色体上的同一区域，所以编码外源重组蛋白的序列片段也随着 dhfr 基因的扩增而扩增，我们就得到了能大量表达外源蛋白的细胞克隆，这在基因工程抗体及各种基因工程蛋白的表达中是可行度很高的一种措施。 影响重组蛋白在 CHO 细胞中表达的因素很多，涉及 CHO 细胞表达体系、表达载体系统、外源基因、表达细胞株的加压扩增与筛选、
14、细胞大规模培养等。有人认为表达载体的构建是影响细胞能否表达的关键问题，因为 dhfr 基因及邻近区段染色体 DNA 拷贝数是共扩增的关系，因此必须将外源基因片段整合到 dhfr 基因的上游或者下游，位置不能太远，否则无论如何筛选也得不到表达外源基因产物的细胞，因此说它是能否表达的关键，当然其它步骤也不能忽略，如 CHO-dhfr-细胞转染、使用强启动子等。如果构建成功可以产生外源蛋白，那么筛选高表达的细胞株等操作就是提高外源蛋白表达量的问题，使外源蛋白高效表达，也是很有意义的，为大规模培养奠定基础。 MTX 筛选扩增系统，常需在 MTX 选择压力下，经过长期的筛选。因此 MTX 加压筛选是需要
15、时间和耐心的，但是细胞培养的条件要合适，如培养基的选用（CHO 细胞一般采用 F-12 培养基），营养成分的适量（L-谷氨酰胺），培养液的新鲜等，首先要保证细胞正常的生长和存活，这样才能缩短加压筛选的周期。另外也要等细胞适应这个压力并恢复正常生长后再继续加压，提高 MTX 浓度，可以成倍数递增，待细胞适应新的压力并恢复正常生长时再继续，同时还要保存每个 MTX 浓度下的细胞种子。因为在此后的细胞培养的过程中，随着 MTX 的撤离和细胞传代次数的增加，转染细胞高表达抗体的能力常会逐渐下降甚至丧失。因此，即使是来源于同一细胞株的各个亚克隆细胞之间，其抗体表达量也常不均一。CHO 转染细胞的这种不稳
16、定性，可能是由于细胞内外源基因拷贝数的丢失或转录效率下降等所致。对此尚有待进行深入地研究。但这一现象提示，在筛选建株的早期，应采取措施及早鉴定各个细胞克隆表达的稳定性，并及时大量保存稳定高表达的细胞种子，或适时地对细胞株用 MTX 再加压和克隆化筛选，以保持转染细胞高表达抗体的能力。应及时用 MTX 对细胞株进行再加压筛选，以保持细胞稳定表达抗体的能力。 有报道称加压方式对表达量的提高和细胞株表达的稳定性有较大的影响。小梯度多次加压有利于最终得到高表达细胞株，且细胞株表达稳定，比大幅度快速加压能够得到表达水平更高的克隆。大幅度加压可以在短期内得到高表达克隆株细胞，但是最终表达水平并不比小幅度多次加压得到的细胞株表达量高，而且细胞株表达往往不稳定，在撤掉筛选压力后，表达水平往往下降。在大幅度加压筛选过程中，可能由于种种原因dhfr 基因发生突变，突变后的 DHFR 对 MTX 的亲和力降低，因而突变细胞株的基因扩增倍数也低，目的基因无法高表达，更易产生非生产性克隆。
