1、地高辛标记探针的 DNA 印迹方案Southern blot using DIG Prober(分子生物学实验室)Step I 采用地高辛高效标记混合物(ROCHE) 标记 DNA 探针1 以质粒为模板，PCR 扩增序列特异性片段，回收片段，并测定浓度浓度测定：将回收产物取 1l 稀释 5 倍，标准分子量的标记物 MAKER 分别点 1l，2l，4l，6l.然后比较回收产物的条带亮度与 MAKER 比较后，可以粗略估算浓度。2 取1g模板（第1步扩增回收产物）于1.5ml的eppendorf管中，加入灭菌双蒸水至终体积为16l。3 沸水浴处理 10min 后迅速于冰上冷却使 DNA 变 性 1
2、 摇匀 DIG-High Prime（vial 1），取 4l 加入已热变性的模板 DNA 中，混匀后，瞬时离心，37 保温 20h，65处理 10min 终止反应。4 取l 电泳检测，标记后的条带稍大于标记前片断。标记好的 DNA 探针20 保存。Step II 基因组 DNA 酶切1 提取高 质量的基因 组 DNA，浓度1g/l ; 测定浓度的方法同测定探针浓度方法一样。2 选择合适的内切酶（酶切的 DNA 量 20g 左右。注意考虑到纯化的损失，约 30%，酶切 DNA 浓度过大时，可以考 虑多做几管做浓缩）。50l酶 切反应 体系：EcoR I (15U/l ) 5l10M buffe
3、r 5lgDNA 10l（约 10-20g）ddH2O up to 50l注：有些内切酶需加 BSA，请参照内切酶说明（包括最适酶切温度）。3 37酶切 12h （电泳检测 ），视酶切情况可延长酶切时间，直至酶切完全。65保温 10min 停止酶切反应。Step III 预电泳和电泳1 配制 0.8 %的琼脂糖凝胶（大胶 40ml 左右，胶薄较好，利于转膜）。2 加入适量上样缓冲液（Loading Buffer ）点样，点上质粒做对照。注：两边的点样孔尽量空出来；点上 marker,再单独一点样孔用溴酚兰做指示，防止跑过。3 120V， 5min；40V，4h。溴酚蓝前沿跑至胶边约 1 厘米处
4、即可。Step IV 转移胶处理与转膜电泳后用 EB 染色，紫外光下拍照，然后，切下 marker 和右上方一角。1 凝胶在灭菌的双蒸水中漂洗片刻。2. 室温下凝胶在 0.25M HCl 中浸泡 15min，使 DNA 脱嘌呤， 摇床上缓慢摇动，（溴酚蓝由蓝色变为黄色）灭菌的双蒸水中漂洗凝胶。3 凝胶转移到 10 倍于凝胶体积的变性液（1.5M NaCl，0.5M NaOH）中轻轻振荡20min；换液一次，继续漂洗 20min。4 灭菌的双蒸水漂洗凝胶片刻，然后置于 10 倍于凝胶体积的中和液中轻轻振荡20min，换中和液重复一次。换培养皿，用 20SSC 转移缓冲液漂洗一下仪器：大培养皿 3
5、 套换洗过程很重切记清顺序Step V 转膜1 将尼龙膜漂浮于超纯水中至完全浸润，转移至 20SSC 转移缓冲液中浸泡15min。先尼龙膜再倒水和缓冲液，保证完全浸润。2 组装转移装置：玻璃板+滤纸桥(边缘完全充分浸入 20SSC 转移缓冲液)+1张滤纸+凝胶 (背面朝上)+ 尼龙膜（做好标记）+ 滤纸（ 3 层）+吸水纸+玻璃板+500g 重物（如下图）方向 注意每层都要用玻棒排净气泡。3 毛细转移装置如图。在 20SSC 转移缓冲液中毛细转移 24h，为提高转膜效果可以适当延长时间；转膜期间经常更换吸水纸及加液（注意防止短路！：用封口膜在四周封好，防止膜上吸水纸接触到膜下缓冲液）。4 转膜
6、结束后，凝胶拍照检测 DNA 残留状况。5. 取膜， （用铅笔标记样品孔的位置，切角标示方向）毛细转移法具体步骤：1 20SSC 浸湿一张 whatman 3mm 滤纸放在支撑平台上，此平台要比凝胶稍大，形成一个“桥” 。2 凝胶反放在浸湿的 whatman 3mm 滤纸上注意两者之间不能有气泡。3用塑料膜包裹膜的边缘，照凝胶的大小剪一张尼龙膜。4膜（20SCC 平衡过）放在凝胶上。5 尼龙膜上放一张 whatman 3mm 滤纸、一叠吸水纸、上置一玻璃板，其上放一重约0.20.5kg 的物品。620SCC 的转移缓冲液中充分转移 1824h 及时换掉浸湿的吸水纸。Step VI 固定，预杂交
7、，杂交1 将尼龙膜浸入 6SSC 溶液中 25min，除去黏附在膜上的凝胶碎片。2 固定： 把膜放在两 层干燥的吸水 纸中央， 80烘烤 2h。处理后的膜直接用于杂交或用保鲜膜包裹干燥保存于冰箱。3 配制地高辛杂交液：用 64ml 的无菌超纯水分两次 加入 DIG Easy Hyb Granules（vial 7）中，迅速于 37振荡 5min 至溶解。 （因为试剂盒中 vial 7 是用大约 75ml 左右的小瓶装的，原试剂是冻干粉样，配制杂交工作液需加入64mlddH2O，若一次加入会产生大量气泡至溢出，需要先少量加入 ddH2O，待其溶解后再加入剩下的部分。 ）4 将事先加入 杂交液（D
8、IG Easy Hyb，vial7，10ml/100cm2）的杂交瓶预热至 42，固定好的尼龙膜轻轻卷成圆柱状放入杂交瓶中 42预杂交 30min，以封 闭非特异性位点。5 倒掉预杂交液。标记好的探针(25ng/ml)沸水浴 5min（用 .ml 管并用封口膜封好）, 迅速冰上冷却后 , 加入 预热至 42的杂交液中（3.5ml/100cm 2 尼龙膜，混合均匀避免产生气泡）。加液顺序：沿壁加 5ml 杂交液探针5ml 杂交液，防止产生气泡。6 将尼龙膜完全接触杂交液，42杂交 16-20h，杂交过程避免有气泡。（杂交液冷后会凝，可回收放2用于下次，不凝则探针浓度少）。Step VII 洗膜1
9、 低严谨洗脱：杂交结束后，用 2SSC，0.1%SDS 洗脱液（现配用时 25预热）15-25振荡洗涤 2 次，每次 5min（视膜大小配溶液以没过膜为准） 。（配时先放水后入 SSC、SDS 可防沉淀）2 高严谨洗脱： 用预热的 0.5SSC，0.1%SDS 洗脱液（ 现配）65 -68振荡洗涤2 次，每次 15min（在杂交炉中进行）。3 再用ml Washing buffer 洗膜 5min，滤干洗液进行显色处理。Step VIII 显色试剂配制（现配）：封闭液 1工作液的配制取 12ml 的 10blocking solution（vial 6）用马来酸 buffer 稀释至120ml
10、。抗体溶液的配制每次使用前 Anti-Digoxigenin-AP（vial 4）10000rpm 离心 5min，吸取 4l上清加入 20ml 封闭液（1工作液）中。显色液的配制加 200l 的 NBT/BCIP 储存液（vial 5）（上清）于 10ml 的 Detection buffer中。 （避光）1 将杂交膜置于盛有 100ml 封闭液（Blocking solution）的培养皿中，室温缓慢摇动 30min。2 转到盛有 20ml 抗体溶液（Antibody solution）的培养皿中，室温缓慢摇动30min。3 在 100ml 的 Washing buffer 中洗膜 215
11、min，缓慢振荡。4 在 20ml 检测缓冲液(Detection buffer) 中平衡 2-5min，缓慢摇动。5 用新配制的 10ml 显色液温浴膜,黑暗静置（37 培养箱）至出现明显条带（3h20 h）。6 用 50ml TE buffer 洗膜 5min 停止显色，白光拍照记录。Southern boltting 试剂配置1.变性液；87.75g NaCl, 20.0g NaOH 加水至 1L2.转膜液 20SSC175.3gNaCl, 88.2g 柠檬酸钠,用浓盐酸调节 pH 至 7.0,定容到 1L3.中和液：175.5gNaCl, 60.55g Tris 调节 pH 至 7.4 加水至 1L,4. Maleic Acid buffer11.61gMaleic Acid , 8.775g NaCl， 固体 NaOH 调 PH 至 7.5 加水至 1L5. Washing buffer 11.61gMaleic Acid , 8.775g NaCl， 固体 NaOH 调 PH 至 7.5， 加入 0.3%Tween20 过滤灭菌总量至 1L4 Detection buffer: 0.1M Tris 0.1M NaCl，PH：9.5
