1、常用分子生物学技术原理及应用 The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology 授课教师：方王楷生物化学与分子生物学教研室,第 十 五 章,DNA AnalysisSouthern Blot: telomere length; amplification; deletionPCR: mutation; DNA methylationIn situ hybridization: gene location; translocationChromatin immunoprecipitation
2、: DNA-Protein interactionDNA Chip: SNPBioinformatics,Southern Blot,Southern blot is a method routinely used in molecular biology for detection of a specific DNA sequence in DNA samples. Southern blotting combines transfer of electrophoresis-separated DNA fragments to a filter membrane and subsequent
3、 fragment detection by probe hybridization. The method is named after its inventor, the British biologist Edwin Southern.,应用：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态，是否有点突变、扩增重排等。,Measurement of telomere length by the Southern blot analysis,Human telomeres is involved in a spectrum of diseases, ranging from rare monog
4、enic diseases to common complex traits such as atherosclerosis and other age-related maladies.,Mammalian telomeres are a tandem array of TTAGGG repeats at the ends of chromosomes. Adjacent to this area is a subtelomeric region comprising noncanonical repeats. The principle of TRF length analysis lie
5、s in the relative lack of restriction sites in these regions.,Probe consists of three oligonucleotide repeats of the sequence complementary to the canonical telomeric TTAGGG sequence (i.e., CCCTAA) and is labeled at the 3end with digoxigenin (DIG).,Polymerase chain reaction,由变性-退火（复性）-延伸三个基本步骤构成：模板D
6、NA的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至4060左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。,Polymerase chain react
7、ion,DNA template that contains the DNA region (target) to be amplified. Two primers that are complementary to the 3 (three prime) ends of each of the sense and anti-sense strand of the DNA target. Taq polymerase or another DNA polymerase with a temperature optimum at around 70 . Deoxynucleoside trip
8、hosphates (dNTPs; nucleotides containing triphosphate groups), the building-blocks from which the DNA polymerase synthesizes a new DNA strand. Buffer solution, providing a suitable chemical environment for optimum activity and stability of the DNA polymerase. Divalent cations, magnesium or manganese
9、 ions; generally Mg2+ is used, but Mn2+ can be utilized for PCR-mediated DNA mutagenesis, as higher Mn2+ concentration increases the error rate during DNA synthesis. Monovalent cation potassium ions.,These components include:,Allele-specific PCR is a varation of the polymerase chain reaction which i
10、s used as a diagnostic or cloning technique, to identify or utilize single-nucleotide polymorphisms (SNPs) (single base differences in DNA).,The correct base pairing at the extreme 3 end of bound primers is a requirement for producing a PCR product. This allowed the use of PCR to distinguish between
11、 alleles of the same gene that differ in a single nucleotide.,Allele-specific PCR,DNA methylation is a biochemical process that is important for normal development in higher organisms. It involves the addition of a methyl group to the 5 position of the cytosine pyrimidine ring or the number 6 nitrog
12、en of the adenine purine ring. This modification can be inherited through cell division.,DNA methylation affect the transcription of genes in two ways:a. Methylation of DNA impede the binding of transcriptional proteins to the geneb. Methylated DNA may be bound by proteins known as methyl-CpG-bindin
13、g domain proteins (MBDs). MBD proteins then recruit additional proteins to the locus, such as histone deacetylases and other chromatin remodeling proteins that can modify histones, thereby forming compact, inactive chromatin, termed heterochromatin.,Methylation-Specific PCR (MSP), is used to identif
14、y patterns of DNA methylation at cytosine-guanine (CpG) islands in genomic DNA. Target DNA is first treated with sodium bisulfite, which converts unmethylated cytosine bases to uracil, which is complementary to adenosine in PCR primers. Two amplifications are then carried out on the bisulfite-treate
15、d DNA: One primer set anneals to DNA with cytosines (corresponding to methylated cytosine), and the other set anneals to DNA with uracil (corresponding to unmethylated cytosine).,DNA经重亚硫酸盐处理后，以处理后的产物作为模板，加入甲基化特异性的引物 (primer)或非甲基化的引物 (primer)，进行特异性的扩增，只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物。,Whole genome bisu
16、lfite sequencing, also known as BS-Seq, which is a high-throughput genome-wide analysis of DNA methylation. It is based on aforementioned sodium bisulfite conversion of genomic DNA, which is then sequenced on a Next-generation sequencing platform. The sequences obtained are then re-aligned to the re
17、ference genome to determine methylation states of CpG dinucleotides based on mismatches resulting from the conversion of unmethylated cytosines into uracil.,FISH is a cytogenetic technique that is used to detect and localize the presence or absence of specific DNA sequence on chromosomes. FISH uses
18、fluorescent probes that bind to only those parts of the chromosome with which they show a high degree of sequence complementarity.,Fluorescence in situ hybridization,Examples of diseases that are diagnosed using FISH include Prader-Willi syndrome, Angelman syndrome, 22q13 deletion syndrome, chronic
19、myelogenous leukemia, acute lymphoblastic leukemia, Cri-du-chat, Velocardiofacial syndrome, and Down syndrome.,Chromatin immunoprecipitation (ChIP),is a type of immunoprecipitation experimental technique used to investigate the interaction between proteins and DNA in the cell. It aims to determine w
20、hether specific proteins are associated with specific genomic regions, such as transcription factors on promoters or other DNA binding sites. ChIP also aims to determine the specific location in the genome that various histone modifications are associated with, indicating the target of the histone m
21、odifiers.,Chromatin immunoprecipitation,SNP microarrays,A SNP array is a useful tool for studying slight variations between whole genomes. The most important applications of SNP arrays are for determining disease susceptibility and for measuring the efficacy of drug therapies designed specifically f
22、or individuals.,Each individual has many SNPs. SNP-based genetic linkage analysis can be used to map disease loci, and determine disease susceptibility genes in individuals. The combination of SNP maps and high density SNP arrays allows SNPs to be used as markers for genetic diseases that have compl
23、ex traits. For example, whole-genome genetic linkage analysis shows linkage for diseases such as rheumatoid arthritis, prostate cancer, and neonatal diabetes. This information can help design drugs that act on a group of individuals who share a common allele - or even a single individual.,SNP microa
24、rrays,The new Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 features 1.8 million genetic markers, including more than 906,600 single nucleotide polymorphisms (SNPs) and more than 946,000 probes for the detection of copy number variation.,RNA Analysis Northern Blot : expressed genesRT-PCR: expressed gen
25、esIn situ hybridization: gene locationcDNA microarray : differentially expressed genesBioinformatics,Northern blot,Northern blotting allows one to observe a particular genes expression pattern between tissues, organs, developmental stages, environmental stress levels, pathogen infection, and over th
26、e course of treatment.,两种变换的聚合酶链式反应是常用的mRNA检测方法,1反转录PCR可用于mRNA的半定量分析 反转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 是一种简单、快捷地对RNA进行定性、定量分析的方法。它是以mRNA为模板，体外扩增cDNA，再以cDNA为模板进行特定基因转录产物的PCR扩增。RT-PCR技术一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测RNA样品进行半定量分析。该方法适合对待测样品进行初步筛选，目前已广泛被实时定量PCR替代。,常用于mRNA的定量分析 实时定量PCR (Real-time Quan
27、titative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR)是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时通过监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,2实时定量PCR,非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor,实时荧光定量PCR-DNA 产物的荧光标记,SYBR Green 法,SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位,SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，
28、形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBR Green,SYBR Green I 工作原理,SYBR Green 法 优缺点,TaqMan-水解型杂交探针,5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,工作原理,可对mRNA进行区域定位 是利用杂交原理建立的组织原位mRNA检测技术，可对细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位。同时也可作为定量分析的补充。通过设计与
29、目标mRNA碱基序列互补的寡核苷酸序列，标记后作为探针；该探针能够特异性地与目标靶序列杂交，检测标记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。虽然原位杂交在功能性方面提供的信息较少，但是该技术还是被广泛用于组织中的基因表达分析，这是因为其较高的稳定性、较广泛的靶点和组织适用性。,原位杂交（in situ hybridization，ISH）,原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合
30、的一种最佳方法。,原位PCR技术,高通量检测技术成为基因表达研究的有力工具,高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术是在大量核酸、多肽信息累计（即资料库）基础上，采用微板作为分子载体，制作集成“芯片”，以自动化操作系统进行分子杂交的试验过程。 因为快捷、灵敏、信息量大，适合大规模操作，故称“高通量”。 高通量检测技术适合“组学”（omics）研究，更适合生命活动过程相关的基因表达谱分析。,基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法 基因芯片（gene chip）又称DNA微阵列(DNA microarray)、DNA芯片（DNA chip）, 是将大量已知序列的
31、核酸片段（包括寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、microRNA等) 集成在同一基片上，组成密集分子排列，通过与标记样品进行杂交，检测、获取细胞或组织的基因信息。 其中基因表达谱（expression prifile）分析是目前基因芯片应用最多的一个方面，主要采用cDNA芯片，基因表达谱芯片便于对不同状态（如生理和病理条件）下的基因表达谱进行比较，揭示转录组（transcriptome）差异表达的规律，对探索发病机制、评价治疗效果、筛选药物靶标具有重要意义。,基因芯片和高通量测序技术可在基因水平高通量地分析基因表达,2. 高通量测序技术是新一代基因表达谱分析方法,高通量测序技术可以一次对几十万
32、到几百万个DNA分子片段进行序列测定，从而快速获得转录组或基因组的全貌, 又被称为深度测序(deep sequencing)。,在DNA水平上，可以大规模地分析基因组甲基化、筛选突变基因、检测基因多态性；在RNA水平上，可以对RNA片段进行扫描、定量与鉴定，对全基因组进行广谱表达研究。,1）目前，高通量测序技术不仅仅在DNA测序中起到重要的作用，并且已经应用于基因组分析的各个方面：,2）高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子RNA或非编码RNA(ncRNA)研究。测序方法能轻易地解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列, 高度同源), 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长
33、度,同时测序方法还能在实验中发现新的小分子RNA。,基因芯片的缺点: 在于它是一个“封闭系统”, 它只能检测人们已知序列的特征(或有限的变异)。高通量测序的优势: 在于它是一个“开放系统”, 它的发现能力和寻找新信息的能力从本质上高于芯片技术。,Protein AnalysisWestern Blot: protein concentrationImmunohistochemical Technique: protein location2-D Electrophoresis: differerentially expressed proteinsCo-Immunoprecipitation：
34、protein InteractionBioinformatics,通过蛋白质检测揭示基因翻译水平的表达特征,Western印迹（Western blot）是一种免疫印迹技术，其基本原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质/多肽分子。当在蛋白质水平上检测特定基因的表达活性时，最常用的方法就是利用Western印迹对细胞或组织的总蛋白质中的特异蛋白质进行定性和半定量分析。,（一）采用特异抗体经Western印迹可直接测定基因编码蛋白,蛋白质样品的制备SDS-PAGE分离蛋白质转膜特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗原）印迹杂交再经偶联了可检测
35、标记信号的第二抗体（即抗抗体，商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的Ig）最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后获取免疫印迹信息,Western blot基本程序,酶联免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）也是一种建立在抗原-抗体反应基础上的蛋白质分析基本方法。 该方法不需经电泳分离待检样品蛋白质，而是预先将样品包被在支持体上，以后反应过程与Western印迹大致相同顺序结合（即“吸附”）特异抗体（一抗）及与酶连接的第二抗体（也可预先包被抗体，“吸附”抗原），再进行酶-底物反应。反应后通过专门的酶标仪测定、记录数据。,（二）酶联免疫吸
36、附分析与Western印迹原理相似但形式不同,特点：具有特异性；灵敏度很高；稳定、操作简便，标本用量少，适于大规模筛查，尤其适用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原；既可以做定性试验也可以做定量分析。 被广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和免疫学等领域。,酶联免疫吸附分析,免疫组织化学（immunohistochemistry）与免疫细胞化学（immunocytochemistry）原理相同，都是利用标记的特异性抗体通过抗原-抗体反应和显色反应，在组织或细胞原位检测特定抗原（即目标蛋白质）的方法，简称为免疫组化实验。近年来由于荧光标记抗体的广泛应用，这两种方法又被统称为免疫荧光法。,（三）免疫
37、组化实验可对组织/细胞表达的蛋白质进行原位检测,immunofluorescence，可应用荧光（倒置）显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal microscopy）对靶分子进行定性、定量和定位分析，激光共聚焦显微镜还可进行断层成像，是在蛋白质水平分析基因表达的直观方法。其中抗体对于蛋白质靶点的特异性、种间交叉反应、检测系统的灵敏性以及细胞或组织的固定类型是该方法的关键因素。运用双重着色或多重着色程序同时对多个感兴趣的靶分子进行检测，是一种揭示更多有关细胞群的功能和它们之间相互作用信息的有效方法。免疫组化主要是作为定性、定位的技术，若结合密度计量系统、图像分析系统等测量工具也可以得到定量的
38、数据。,流式细胞术（flow cytometry）在细胞水平分析特定蛋白质的基本原理也是抗原-抗体反应，它利用荧光标记抗体与抗原的特异性结合，经过流式细胞仪分析荧光信号，从而根据细胞表达特定蛋白质的水平对某种蛋白质阳性细胞（即特异基因表达的细胞）作出判断。,（四）流式细胞术用于分析表达特异蛋白质的阳性细胞,流式细胞术可以检测活细胞，也可以检测用甲醛固定的细胞。广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达水平的定量分析，并能够根据各种蛋白质的表达模式区分细胞亚群。此外，流式细胞术可以使用多个荧光标记的抗体同时对多个基因产物进行标记和监测，是对细胞进行快速分析、分选、特征鉴定的一种有效方法。,（二）蛋白质芯
39、片和双向电泳可在蛋白质水平高通量地分析基因表达,蛋白质芯片（protein chip）是一种对蛋白质的表达和功能进行高通量分析的技术。 是将具有高度亲和特异性的探针分子（如单克隆抗体）固定在基片上，用以识别复杂生物样品溶液中的目标多肽；蛋白质功能芯片可用来研究蛋白质修饰、蛋白质-蛋白质/DNA-蛋白质/RNA-蛋白质，以及蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、小分子-蛋白质等的相互作用。,1蛋白质芯片有多种形式和用途,蛋白质检测芯片包括:抗体芯片抗原芯片配体芯片碳水化合物芯片等,根据蛋白质芯片制作方法和用途不同，可将其分为1. 蛋白质检测芯片2. 蛋白质功能芯片两大类,目前比较和鉴定蛋白质表达
40、谱更多采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳结合质谱技术。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术又称二维电泳（two-dimensional electrophoresis, 简称2-D电泳）。 原理: 根据蛋白质分子的两个属性等电点和分子质量将蛋白质混合物进行分离。电泳结果经染色后，即可对不同样品中蛋白质的表达谱进行比较；还可从凝胶中将特定的蛋白质点切下，经胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利用质谱（mass spectrum）技术进行定性分析，对差异表达的蛋白质进行鉴定。 可同时分离数成百上千的蛋白质。,2双向电泳结合质谱普遍用于蛋白质表达谱的分析和鉴定,Co-immunoprecipitation,免疫共沉淀（Co-
41、Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。,Co-immunoprecipitation,基因的生物学功能鉴定技术Methods for Identifying Biological Functions of Ge
42、nes,目前在已知的2.5万3万个人类基因中，大约70%的基因我们还不清楚它们的功能，有90%的基因我们不知道它们在体内的确切生理作用，因此，利用各种技术手段研究基因组中功能未知基因的作用，将是“后基因组时代”功能基因组学研究的主要内容。生物信息学利用已知数据和生物学知识进行合理推断, 可以节省大量的人力物力，但基因功能的鉴定最终仍需要通过实验来验证。通常采用基因功能获得和/或基因功能缺失的策略，观察基因在细胞或生物个体中的，细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化，来鉴定基因的功能。此外，基于正向遗传学的随机突变筛选技术也成为揭示基因功能的重要手段。由于基因的功能必须在完整的生物个体及其生命过
43、程中才能得到完整的体现，因此从整体水平研究基因的功能是必然的选择。,基因功能获得策略即通过将目的基因直接导入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因的功能。常用的方法有转基因和基因敲入技术等。,一、采用功能获得策略鉴定基因的功能,转基因技术（transgenic technology）是指将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞中，通过随机重组使外源基因插入细胞染色体DNA，再将受精卵或胚胎干细胞植入受体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代。,（一）用转基因技术获得基因功能,转基因动物（transgenic animal）是指应用转基因技术培育
44、出的携带外源基因，并能稳定遗传的动物。 其基本制作过程包括：转基因表达载体的构建，外源基因的导入，转基因动物的获得和鉴定，转基因动物品系的建立以及外源基因表达的鉴定。,1. 转基因动物可在整体水平研究基因的功能,转基因动物制作原理示意图,优点：利用转基因动物模型研究外源基因，能够接近真实地再现基因表达所导致的结果，及其在整体水平的调控规律，把复杂的系统简单化，具有系统性和独立性，是目前层次最高的实验体系。利用转基因技术建立的疾病动物模型具有遗传背景清楚、遗传物质改变简单、更自然更接近疾病的真实症状等优点。,但转基因动物模型仍存在一些亟待解决的问题：外源基因插入宿主基因组是随机的，可能产生插入突
45、变，破坏宿主基因组功能；外源基因在宿主染色体上整合的拷贝数不等；整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的不稳定遗传等。,虽然转基因技术本身仍存在一些问题，但其在医学研究中的重要地位是毋庸置疑的，随着转基因技术的不断完善，其在医学及生物学领域必将有更加广泛的应用。,目前，科学家已经采取了多种方法使转基因技术更加完善： 为了更为精确地调控转基因的表达，使其获得时空特异性的调控，在构建转基因表达载体时，选择只在特定的细胞类型或特定的生命时期才启动基因表达的启动子，即可使外源基因获得时空特异性的表达。可调控的基因表达系统也是一种常用的方法： 例如四环素调控系统，该表达系统可使转基因动物体内外源基因
46、的表达受诱导剂（四环素）的调控，通过加入或去除诱导剂，就可以实现对外源基因表达时间及水平的控制。,2. 转基因技术在不断完善,当前转基因动物所涉及的转基因片段长度大多在几十个kb以下，但是，随着科学研究需要进行大片段DNA、多基因或基因簇的转基因。克隆大片段DNA常应用酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)等，可获得200kb以上的大DNA片段，能携带包含完整的基因或多个基因，以及基因的所有外显子，和附近的染色体调控区，为目的基因提供与其在正常染色体上一致的环境，保证了转基因在正常细胞中的时空表达。,（二）基因敲入可以实现基因的定向插入,基因敲入( gene knock-in)是通
47、过同源重组的方法，用某一基因替换另一基因, 或将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定位点，使之表达并发挥作用。通过基因敲入，可以研究特定基因在体内的功能；也可以与之前基因的功能进行比较；或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。,基因敲入是基因打靶技术的一种，基因打靶技术是20世纪80年代后半期发展起来的，一种按预期方式准确改造生物遗传信息的实验手段。该技术的巧妙之处在于把胚胎干细胞技术和DNA同源重组技术“结合”起来，实现对染色体上某一基因的定向修饰和改造，从而深入地了解基因的功能。除基因敲入外，基因打靶还包括基因敲除、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等。,基因打靶
48、的原理和基本步骤首先, 从小鼠囊胚分离出未分化的胚胎干细胞, 然后利用细胞内的染色体DNA可以与导入细胞的外源DNA，在相同序列的区域内发生同源重组的原理，用含有正-负筛选标记的打靶载体，对胚胎干细胞中的特定基因实施“打靶”；之后将“中靶”的胚胎干细胞移植回小鼠囊胚( 受精卵分裂至8个细胞左右即为囊胚, 此时受精卵只分裂不分化) , 移植进去的中靶胚胎干细胞钻入囊胚胚层, 与囊胚一起分化发育成相应的组织和器官；最后诞生出具有基因功能缺陷的“嵌合鼠”。由于中靶的胚胎干细胞保持分化的全能性, 因此它可以发育成为嵌合鼠的生殖细胞, 使得经过定向改造的遗传信息可以代代相传。,基因打靶的原理示意图,基因
49、功能研究的功能失活策略是通过观察，细胞或个体的某一基因功能被部分或全部失活后，细胞生物学行为或个体遗传性状表型的变化，来鉴定基因的功能。常用的方法主要有基因敲除基因沉默,二、采用功能失活策略鉴定基因的功能,基因敲除（gene knock-out）属于基因打靶技术的一种，其操作步骤和原理与基因打靶技术相同。基因敲除技术是利用细胞染色体DNA可以与导入的外源DNA在相同序列的区域发生同源重组的现象，在ES细胞中定点破坏内源基因，然后利用ES细胞发育的全能性，获得带有预定基因缺陷的杂合子，通过遗传育种最终获得目的基因缺陷的纯和个体。 1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型，此后基因敲除技术得到进一步的发展和完善，目前该技术已经成为研究基因功能最直接、最有效的方法之一。,
