1、1摘要狂犬疫苗是一个历史悠久的疫苗，是嗜神经性病毒引起的人兽共患的传染病。法国科学家巴斯德于 1885 年发明。我国现在制造的狂犬疫苗系用狂犬病毒固定毒接种于原代地鼠肾细胞，培养后，收获毒液，经浓缩、纯化、精制并面检定合格后即为预防狂犬病的疫苗。狂犬疫苗的推广应用大大降低了人间狂犬病的发病率。到目前为止，世界上还未有一种有效的治疗狂犬病的方法，发病后的死亡率几乎 100%。所以，凡被病兽或带毒动物咬伤或抓伤后，都应立即注射狂犬病疫苗。精制地鼠肾细胞狂犬疫苗生产中,地鼠肾 细胞在组织培养中的生长状况对狂犬病病毒的培养起着决定性作用,而细胞生长的质量和新生小牛血清对肾细胞的保护与促进生长作用有至关
2、重要的关系。关键词： 毒种 疫苗制造 细胞瓶 牛血清1引 言 .31试剂与仪器 .31.1 毒种制备所需 .31.2 疫苗制备所需 .41.3 培养瓶对细胞的影响 .41.4 牛血清对细胞的影响 .42.毒种 .42.1 毒种来源 .42.2 毒种传代 .52.2.1 毒种悬液制备 .52.2.3 接种 .52.2.4 取脑 .53疫苗制备 .63.1 操作人员的消毒准备 .63.2 地鼠制备 .63.2.1 地鼠皮毛消毒 .63.3 种毒洗换 .73.3.1 洗液 .73.4 无菌实验 .83.5 取毒力 .84影响因素 .94.1 培养瓶对地鼠肾细胞的影响 .94.1.2 方法 .94.1
3、.3 细胞生长情况,一般在光镜下分成四级 .94.1.4 浓缩 .924.1.5 检定 .94.2 牛血清对细胞的影响 .104.2.1 地鼠肾细胞悬液和病毒液的制备 .104.2.2 细胞生长情况的判定标准 .105实验结果 .115.1 疫苗制备 .115.2 细胞瓶对肾细胞的影响 .115.2.1 细胞生长情况比较 .115.3 牛血清对肾细胞的影响 .136结语及展望 .15致 谢 .16参考文献 .173引 言目前，养宠物的家庭越来越多，不少喜爱宠物的人都有被爱犬或爱猫等小动物多次咬伤的经历，因此，他们关心已接种过狂犬病疫苗又被狗等小动物咬伤后，是否还需要再接种狂犬病疫苗？据统计，在
4、我国 95以上的人狂犬病是由犬狂犬病传染所致。狂犬病是凶险的疾病，人一旦感染上几乎百分之百死亡。因此被犬致伤后要及时去医院处理伤口，并去当地卫生防疫站注射狂犬病疫苗。预防狂犬病惟一有效的措施是接种狂犬病疫苗。轻度被犬咬伤者需接种狂犬病疫苗 5 针（全程免疫）；如在一年内再次被犬咬伤，还需加强注射狂犬病疫苗 1 针；如全程免疫一年后再次被犬咬伤应该加强注射 23 针。咬伤严重或特殊情况下，则应由防疫站医生根据情况酌情处理。 狂犬病是由嗜神经性的狂犬病病毒引起的一种人畜共患烈性传染病，世界范围流行，其发病和死亡率居我国甲、乙类传染病之首。目前狂犬病治疗全世界无特效药，一旦发病其死亡率为 100%，
5、及时进行狂犬病疫苗接种为预防、控制和消除狂犬病唯一有效的保护性措施，因而生产出安全高效的狂犬病疫苗尤为重要，而筛选出优良的生产用病毒株是制造疫苗的关键。我国现在制造的狂犬疫苗系用狂犬病毒固定毒接种于原代地鼠肾细胞，培养后，收获毒液，经浓缩、纯化、精制并检定合格后即为预防狂犬病的疫苗。1试剂与仪器1.1 毒种制备所需2%灭活小件血清注射用水 离心沉淀器一台乳钵，平皿玻璃沙吸管（1ml 10ml），1ml 注射器， 中试管， 镊子， 弯剪， 50ml 沉淀离心瓶， 乳胶手套分装豚鼠脑毒种用的 250ml 血浆瓶等装铝箱送高压 125Pa， 温度 121 灭菌备用41.2 疫苗制备所需 汉克氏液 牛
6、血清 199 培养液 人血白蛋白 7.5%NaHCO3 甲醛 柳硫汞 胰酶 15 升瓶 5 升瓶 100 毫升三角瓶 三角虹吸装置，眼科剪刀若干，眼科镊子，外科钝头剪刀，橡胶塞，烧杯，三角烧瓶带玻璃珠纱布条鸡玚带，不锈钢漏勺，以上器材装铝箱送高压灭菌.另外还准备 3 瓶用棉赛包布包好扎好送高压 125 帕121 度灭菌一小时备用，此外还准备地鼠板 1.3 培养瓶对细胞的影响 .地鼠 1214 日龄（卫生部长春生物制品研究所实验动物室提供）小白鼠昆明种体重 1113g(中国医科大学实验动物部提供)3.细胞培养瓶 3L 和 10L(成都市万福玻璃仪器厂出品)转瓶机 3L 和 10L 转瓶机(均为辽
7、宁省医疗器械研究所生产)狂犬病固定毒 aG 株(疫苗株 )和 CVS 株(攻击株)(均为中国药品生物制品检定所提供)1.4 牛血清对细胞的影响新生小牛血清(沈阳安迪生物高科技公司提供)浓度为 8%;0.25%水解乳蛋HanKs 生长液 ;0.4%人血蛋白 HanKs-SML 维持液;12 14d 龄地鼠肾细胞,实验组和对照组解剖取肾,均经胰酶消化过夜,分散备用;狂犬病毒毒种 (中国药品生物制品检定所提供), 狂犬病固定毒“北京株”(aG 株);小白鼠昆明种(购于中国医科大学实验动物室), 体重 1113g。2.毒种2.1 毒种来源 aG 株，由中国药品生物检定所委托卫生部制品研究所分发,生产用
8、毒种不超过 aG5 代。52.2 毒种传代2.2.1 毒种悬液制备 感染豚鼠（120g-180g）用的病毒悬液在无菌操作室内制备，已合格存放于40 度冰冻保存组织培养适应株脑毒种(aG 株)取出后迅速放放流水中解冻，解冻以后取出入平皿内称重用稀释液洗去甘油，洗液不少于 10ml 玻璃少放放乳钵内，同时放入豚鼠脑毒种，研磨成均匀后吸入 50ml 沉淀离心瓶内以 1000r/min离心 10min，取上清液，再稀释后冰溶备用。2.2.3 接种接种按无菌操作进行首先用 1ml 注射器吸取已稀释好的毒液 1ml，然后左手大拇指和食指抓住豚双鼠耳部，用手掌把豚鼠固定在操作台上，右手用 5%碘酊消毒颅中部
9、及四周，消毒完毕，取已吸好毒种液的 1ml 注射器用 4 号针头于颅顶旁入脑，每只豚鼠接种毒种 0.1ml 接种后每天喂莴笋，混合干饲料，同时，观察豚鼠发病情况先具有典型狂犬病症状的豚鼠收剖。2.2.4 取脑 在无菌操作室内进行，用剪刀尖掀开颅顶骨用镊子将脑（包括大脑，中脑，小脑，脑桥，延脑）取出，放 250 血浆瓶内，取脑同时随机抽取一部分样品作病毒滴定用，每个血浆瓶内装有玻璃珠，每一个脑装入一个血浆瓶内，编上号码用 10ml 吸管加入灭菌生理盐水 10ml 洗脑作无菌试验，塞好瓶盖，盖好铝盖，放-20 度冰箱保存备用。63疫苗制备3.1 操作人员的消毒准备在万级区，换拖鞋洗手进一更，换白大
10、褂戴帽，进入十万级区换拖鞋，用肥皂杀菌洗手三次以上，进入二更从上到下：换帽，戴口罩，穿缓冲衣。进入百万级区（进三更），穿无菌衣（四联体衣）再戴口罩，戴医用上手套。进入无菌操作间后，用酒精棉球对手心和手背全面消毒。注：进入无菌间进行操作，操作人员都须进行以上无菌程序，才可以操作3.2 地鼠制备 3.2.1 地鼠皮毛消毒把 12-14 日地鼠放放搪瓷桶内加乙醚加盖使地鼠麻醉致死，5. 用自来水冲洗除去木屑饲料，6. 粪便，7. 用纯净水洗若干次用甲醛浸泡 15 分钟，8. 用甲醛与新洁尔灭混合液浸泡 15 分钟，9. 再用新洁尔灭泡 10 分钟。3.2.2 解剖取肾按无菌操作在无菌室内将消毒后的地
11、鼠固定在地鼠板上沿地鼠 12 根肋骨下，脊柱两侧剪开后，腹膜 1 厘米的纵切口，暴露出肾脏，此时如果发现腹腔充血渗出液等应废弃，并更换剪刀，再剪下一个，两手执镊子，一把固定肾脏并协助取肾，另一把穿肾，取肾顺序从右向左，取出的肾脏放无菌 100 毫升烧杯，用灭菌汉克氏液 300 毫升冲洗倒入另一只灭过菌的 100 毫升的烧杯内用 16 厘米 外科顿头剪刀剪成肾组织块3.2.3 肾组织块的洗涤与消化将剪碎的肾组织块放入带有玻璃珠的 100 毫升的三角烧瓶内，用汉克氏液洗三次，每次洗量 800 毫升除去脂肪，血液，尿液，洗后的肾组织块加入 0.1%胰酶消化液，冷却消化 18-24h。肾细胞块皮质部分
12、基本离散，呈现发白，实质部分呈现暗红色。73.2.4 分散细胞3.2.4.1 生长液配制15 升汉克氏液，肾组织块 1000 毫升三角烧瓶按顺序放在无菌操作台上，在火焰下向 15 升瓶内加小牛血清，生长液 NaHCO3 液，然后依次装上互通的 15升瓶管道，用止血钳夹住，根据需要开放3.2.4.2 去胰酶消化液先加压 将 15 升瓶内的汉克氏液压入 1000 毫升的三角烧瓶内 800 毫升加液时慢慢注入避免冲力过猛，让洗液充分洗涤肾组织块，然后再让肾组织块沉淀，如此洗三次，然后把 15 升瓶剩余的洗液排空。3.2.4.4 分散细胞消化好的肾组织块去胰酶消化液后，按顺时针振动玻璃珠，使肾组织块分
13、散为单个肾细胞，一般振三遍，使肾组织块全部分散为单个肾细胞，并导入已知生长液的 15 升瓶中如有尚未被分散的仍可重复上述操作，直至分散完为止3.2.4.5 细胞接种分散好的单个肾细胞于 15 升瓶中充分摇匀后，通过导管接种 3 升培养瓶3.2.4.6 细胞培育放 37 度恒温室转瓶机上，横躺培养 2-3 天，细胞可长成单层，在此期间 24小时，观察一次细胞，了解细胞生长情况及其生长趋势接种前从毒种工序领取无菌试验合格的生产用的毒种，在水中迅速融化，用玻璃珠振摇脑组织使之为匀浆在无菌室内用汉克氏溶液稀释毒种在水中迅速融化，用玻璃 珠振摇脑组织，使之为匀浆 ，在无菌室内用汉克氏溶液稀释毒种3.3
14、种毒洗换3.3.1 洗液 8细胞瓶种毒后 20-24 小时 ，搬入缓冲间， 操作者按常规洗手，消毒后穿好操作 衣裤鞋，戴上口罩帽子进入操作室，取病毒维持液混均匀后装上 15 升瓶虹吸管3.3.2 洗换操作者横持细胞瓶，烧瓶口在火焰封闭下去平皿，盖上大钟罩加入维持液完 ，在火焰下塞上塞子，扎好瓶口放转瓶机上继续培养 ，收毒3.3.3 收液中毒后的细胞培养 5-7 天 收取病毒液培育成熟的细胞 ，从转瓶机上取下后 用力摇下细胞 ，送入 操作室 缓冲间,包布作无菌试验 ，每只培养基接种0.5 毫升取样塞好胶塞灭活完毕 存放在 4 度-8 度 冰库冷冻，待 无菌试验合格，毒力合格后 混合过滤3.4 无
15、菌实验收液后取培养基试管,吸取 0.5ML 放入试管内(无菌操作)盖好管塞,在 34 度培养基室观察.一般培养一周并每隔一天观察一次。3.5 取毒力取无菌毒力瓶,用吸管吸取收取的毒液 15-20ML(毒力瓶不要放到火焰旁以免影响毒力)包裹好后送入质检科,测毒力。灭活完毕,做完无菌检验,取毒力样后,把收取的液体存放在 2-8 度冷库，待无菌检验合格，毒力合格,类毒素测定后,混合送入超滤纯化部进行过滤纯化,最后送入分包装部进行分包装,然后存放到 4度冷库待售。94影响因素4.1 培养瓶对地鼠肾细胞的影响原代地鼠肾细胞是生产狂犬病疫苗的基础。多年来,培养地鼠肾细胞多采用10L 培养瓶,近年来亦有采用
16、 3L 瓶者,究竟哪种瓶效果更好,说法不一。为此,对上述两种培养瓶进行狂犬病疫苗平行生产和分析比较。4.1.2 方法按常规法解剖地鼠,取肾消化,制成细胞悬液。每个 3L 瓶接种 10 对肾细胞悬液,每个 10L 瓶接种 20 对肾细胞悬液(两种瓶单位表面接种的细胞数相等),同时接种病毒,置 37恒温室旋转培养。3L 瓶角速度为 14r/h,10L 瓶角速度为7r/h(3L 瓶半径为 10L 瓶半径的 1/2,两种瓶的旋转线速度相等)。培养 72h 在光镜下观察细胞,然后浸泡 6h 洗换,加维持液(3L 瓶加 0.7L,10L 瓶加 1.4L),置 37恒温室旋转培养,96h 收获。细胞镜检在 以上者再加维持液(3L 瓶加 0.5L,10L 瓶加1.0L),置 33 恒温室继续旋转培养 72h,第 2 次收获 1 。4.1.3 细胞生长情况,一般在光镜下分成四级4.1.4 浓缩将病毒滴度5.5LogLD50/1.0ml 的同批 1、2 次收获液合并后,用 30 万相对分子质量滤板进行 3 倍浓缩。4.1.5 检定病毒滴度及效力检定方法按文献1进行。
