1、分子生物学与细胞生物学实验基本技术2005-02实验一 组织块培养法一、目的学习原代培养方法，从供体取得 组织细胞后在体外进行的首次培养。二、概述组织块培养法是常用的、简便易行和成功率 较高的原代培养方法。可以采用剪切法，即将组织块剪切成小块后，接种于培养瓶，组织小块贴壁 24h 或更长时间后，细胞就从组织四周游出。但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤 ，并不是每个小 块都能长出细胞。用于组织块培养的培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理，如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长。 （本 节以新生牛主动脉平滑肌培养 为例）三、材料一一一 仪器1. 净化工作台2. 恒温水浴箱3. 冰
2、箱（4、-20 ）4. 倒置相差显微镜5. 培养箱一一一 玻璃器皿1. 培养皿（100mm ）2. 吸管（弯头）3. 烧杯（500ml、200ml、10ml）4. 广口试剂瓶（500ml）5. 玻璃瓶（250ml、100ml）6. 培养瓶7. 废液缸一一一 塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. EP 管一一一 其他物品1. 微量加样枪2. 眼科组织剪（直尖、弯）3. 眼科组织镊（直、弯）4. 12.5cm 组织镊（无钩、12 钩）5. 25cm 敷料镊（无钩）6. 止血钳（18cm 直纹式、12.5cm 直纹式、弯 纹式）7. 解剖剪一一一 试剂1. D-Hanks 液2. 小牛血清3.
3、 RPMI16404. 双抗（青霉素、链霉素）5. 1N HCl6. 7.4%NaHCO3四、操作步骤1. 取材：打开胸腔，无菌操作下取出主动脉胸段，浸到 预 先配制好的含双抗（500u/ml 青、链酶素）的 D-Hanks 液中漂洗。 2. 组织的冲洗、修剪：取出主 动脉，用 锋利的剪刀修剪除去周 围组织，再用 D-Hanks 冲洗主动脉 3 次，除去血块及杂组织 等。3. 平滑肌组织分离：纵向剖开主动脉，撕下主 动脉内层，取主动脉中层的平滑肌组织，无血清 RPMI1640 漂洗 3 次。4. 剪切：将平滑肌组织用锋利的眼科剪反复剪切至剪成 1mm3 小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加
4、 12 滴培养液，以保持湿 润。5. 贴块：将剪切好的组织小块，用眼科 镊送入培养瓶内，用弯头吸管将组织块均匀摆置，每小块间距 0.5cm 左右，组织块放置好后， 轻轻将培养瓶翻转， 让瓶底朝上，向瓶内注入适量含 10%牛血清培养液，盖好瓶盖。6. 培养：将培养瓶瓶底朝上， 37培养箱放置 24h，待 组织 小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养。7. 换液：原代培养 35d，需 换液一次，去除漂浮的 组织块 和残留的血细胞。 组织块培养法也可不用翻转法，即在 摆放组织块后，向培养瓶内仅加入少量培养液，以能保持组织块湿润即可，盖好瓶盖，放置 37培养箱 24h 再补加培养液。注意事项1.
5、取材的组织最好尽快培养。因故不能即 时培养，可将 组织 浸泡于培养液内，放置于冰浴或 4冰箱中，如果组织块很大， 应切成 1cm3 以下的小块 再低温保存，但时间不能超过24h。2. 从消化道、周围有坏死组织 等污染因素存在的区域取材，可用含 5001000u/ml 的青、链霉素 BSS 液漂洗 510min，或用 10%达克宁注射液冲洗浸泡 10min 再作培养。3. 组织块不易贴壁，可预先在瓶壁涂薄 层血清、胎汁或鼠尾胶等。4. 原代培养的 12d 内要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染，一旦 发现，要及时清除。审实验二 消化培养法一、目的学习原代培养方法，从供体取得 组织细胞后在体外进行
6、的首次培养二、概述此法采用消化分离法（即结合生化和化学手段把已剪切成小体积的组织进一步分散的方法），将妨碍细胞生长的细胞 间质包括基质、 纤维等去除，使细胞分散，形成悬液，可直接进行培养。分散后细胞易于从外界吸收养分和排出代 谢产 物，容易生 长，存活率高，可以很快得到大量活细胞，细胞在短 时间内生长成片。由于各种消化试剂的作用机制各不相同，要根据组织类型和培养的具体要求选择消化方法和试剂。本方法适用于培养大量组织，原代 细胞产量高，但步骤繁琐，易污染。 （本节以乳鼠心肌细胞培养为例）三、材料：一一一 仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 摇床（37）5. 冰箱（4、-20 ）
7、6. 倒置相差显微镜7. 培养箱一一一 玻璃器皿1. 培养皿（100mm ）2. 吸管（弯头、直头）3. 烧杯（200ml、10ml）4. 玻璃瓶（250ml、100ml）5. 玻璃漏斗6. 培养瓶7. 废液缸一一一 塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 15ml 离心管5. EP 管一一一 其他物品1. 微量加样枪2. 眼科组织剪（直尖、弯）3. 眼科组织镊（直、弯）4. 12.5cm 组织镊（无钩）5. 红血球计数板6. 泡沫板7. 大头针8. 尼龙网膜（140 目）一一一 试剂1. D-Hanks 液利益2. 小牛血清3. DMEM4. 双抗（青霉素、链霉素）5. 胰蛋白酶（0.0
8、8%）6. 1NHCl7. 7.4%NaHCO3四、操作步骤1. 取材：取新生 13 天的乳鼠，雌雄兼用，75%酒精消毒 3 次，用大 头针将乳鼠固定在泡沫板上，无菌操作下打开胸腔，取出心脏，放入装有 DHanks 液的培养皿中。2. 组织修剪、漂洗：修剪去除血管等 杂组织， DHanks 液中漂洗数次，以除去血块等。3. 剪切：将心室肌用锋利的眼科剪反复剪切组织至剪成 12mm 3 小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加 12 滴培养液，以保持湿 润。4. 消化：将组织小块转移至 100ml 的玻璃瓶中，再加入 3050 倍组织量并预温 37的0.08%胰酶消化液，37 摇床消化 6min
9、 左右。5. 细胞分离：消化完毕，用吸管 轻轻吸吹几下，使 组织小 块散开，静置 2min 后，吸取上面的混悬液（弃去第 1 次的混悬液）， 经 140 目尼龙网膜过滤 至盛有终止液试管中，1000rpm，离心 10 分钟，弃去上清，加适量的培养液悬混。在装有组织小块的玻璃瓶中再加入 3050 倍组织量并预温 37的 0.08%胰酶消化液，重复第 4、5 步骤，直至大部分组织小块消失。6. 细胞计数：将上述获得的细胞悬液，吸出少 许，适当稀释，加台盼蓝溶液染色，用红血球计数板计数活细胞和死细胞， 计算细胞密度和存活率。7. 细胞接种：将细胞接种至 30ml 的培养瓶中，每瓶 6105，用含 1
10、5%小牛血清的 DMEM培养液培养。8. 培养：5%CO 2、37培养箱培养 12h，显微镜下可见细胞贴壁，呈多角形，培养 24h，镜下见细胞已连结在一起，部分细 胞开始搏动。9. 换液：培养 35d，细胞换 液。五、注意事项1. 取材的组织最好尽快培养。因故不能即 时培养，可将 组织 浸泡于培养液内，放置于冰浴或 4冰箱中，如果组织块很大， 应切成 1cm3 以下的小块 再低温保存，但时间不能超过24h。2. 从消化道、周围有坏死组织 等污染因素存在的区域取材，可用含 5001000u/ml 的青、 链霉素 BSS 液漂洗 510min，或用 10%达克宁注射液冲洗浸泡 10min 再作培养
11、。3. 原代培养的 12d 内要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染，一旦 发现，要及时清除。审实验三 细胞传代一、目的学习细胞传代方法，扩增细胞，建立细胞系。二、概述培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。 贴壁生长的 细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。三、材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4、-20 ）5. 倒置相差显微镜6. 培养箱（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 玻璃瓶（250ml、100ml）3. 培养瓶4. 废液缸一一一 塑料器皿1.
12、 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 15ml 离心管5. EP 管（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板（五）试剂1. D-Hanks 液2. 小牛血清3. RPMI16404. 双抗（青霉素、链霉素）5. 胰蛋白酶（0.08%）或 EDTA 或两者混合液6. 1NHCl7. 4%NaHCO3四、操作步骤贴壁细胞的消化法传代：1. 吸除或倒掉瓶内旧培养液。2. D-Hanks 液洗 23 次。3. 向瓶内加入适量消化液（胰蛋白酶或与 EDTA 混合液） 轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加适量新的消化液，轻轻摇动再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。也可不
13、采用上述步骤直接加消化液 进行消化。4. 消化最好在 37或室温 25以上环境下进行。消化 25min 后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即终止消化。5. 吸除或倒掉消化液，如用 EDTA 消化，需加 Hanks 液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液，终止消化。6. 用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔不要用力过猛。 7. 计数，分别接种在新的培养瓶内。一一一 悬浮细胞
14、的传代悬浮细胞传代可离心收集细胞后传代，或直接 传代。离心传代法：1. 将细胞连同培养液一并转移到 15ml 离心管内；2. 离心 8001000rpm，5min ；3. 弃去上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液；4. 计数，分别接种在新的培养瓶内。直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉 1/22/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后再传代。(三)、部分贴壁 细胞的传代部分贴壁不牢的细胞，如 Hela 细胞等，不经消化处理直接吹打可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。对绝大部分贴壁生长的细胞，因直接吹打对细胞损伤较大，细胞常有较大数量的丢失，因而需消化后，才能吹打传代。五
15、、注意事项1. 胰蛋白酶要预温，温度 37左右为宜。2. 离心转速要合适，转速过 低，不能有效分离 细胞，离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。3. 要定时观察细胞，发现污 染， 应及时处理。审实验四 细胞冻存和复苏一、目的学习细胞冻存和复苏的方法，掌握 长期保存体外培养细胞的技 术。二、概述细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐 渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70 冰箱中可以保存一年之久；细胞储
16、存在液氮中，温度达-196，理 论上储存时间是无限的。细胞冻 存及复苏的基本原则是慢冻 快融， 实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻 存多采用甘油或二甲基亚砜 作保护剂， 这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷 冻可使细胞内的水分渗出细 胞外，减少 细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复 苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于 缓慢融化使水分渗入 细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。三、材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4、-20 、-70）5. 倒置相差显微镜6. 培养箱7.
17、 液氮冰箱（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 移液管（10ml）5. 15ml 离心管6. 冻存管（12ml）（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5. 移液枪（五）试剂1. D-Hanks 液2. 小牛血清3. 培养液4. 双抗（青霉素、链霉素）5. 胰蛋白酶（0.08%）6. 1NHCl7. 7.4%NaHCO38. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油四、操作步骤（一）细胞冻存1. 配制含 10%DMSO 或甘油、1020%小牛血清的冻存培养
18、液；2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白 酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至 15ml 离心管中、 ；3. 离心 1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为 5106/ml110 7/ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管 11.5 ml；6. 在冻存管上标明细胞的名称， 冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1-2 / min；当温度达-25 以下时，可增至-5-10/ min；到-100时， 则可迅速浸入液氮中。也可将装有 细胞的冻存管放入-20
19、冰箱2h ，然后放入-70 冰箱中过夜，取出 冻存管，移入液氮容器内。一一一 细胞复苏1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入 37温水中，并不时摇动令其尽快融化。2. 从 37水浴中取出 冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加 10 倍以上培养液，混匀；3. 离心， 1000rpm，5min；4. 弃去上清液，加入含 10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37培养箱静置培养；5. 次日更换一次培养液，继续 培养。五、注意事项1从增殖期到形成致密的单层细 胞以前的培养细胞都可以用于 冻存，但最好 为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；2将冻存管放
20、入液氮容器或从中取出 时，要做好防 护工作，以免冻伤；3冻存和复苏最好用新配制的培养液。审实验五 细胞生长曲线、四唑盐试验（MTT）比色试验一 细胞生长曲线（一）、目的学习细胞生长曲线的测定方法， 观察细胞生长基本规律。（二）、概述：细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系 细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。 细胞生长曲线的 测定一般可利用细胞计数法进行。（三）、材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4、-20 ）临床5. 倒置相差显微镜6. 培养
21、箱（37、5%CO 2、饱和湿度）（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 24 培养板4. 胶塞（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板（五）试剂1. D-Hanks 液2. 小牛血清3. RPMI16404. 双抗（青霉素、链霉素）5. 0.08%胰酶（四）、操作步骤1. 取生长状态良好的细胞，采用一般 传代方法进行消化，制成细胞悬液；2. 计数，精确地将细胞分别 接种于 2130 个大小一致的培养瓶内或培养孔（以 24 孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。3.
22、 每天或每隔一天取出 3 瓶（孔）细胞进行计数， 计算均 值。培养 35d 常要给未计数的细胞换液。4. 以培养时间为横轴，细胞数 为纵轴（对数），描 绘在半对 数座标纸上，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线。（五）、注意事项1 细胞生长曲线虽然最为常用，但有 时其反映数值不够精确，可有 2030% 的误差，需结合其它指标进行分析。2 现在很多实验室利用培养板采用 MTT 法进行生长曲线测定，较为简便。3 标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天的潜伏适应期，然后进入对数生长 期，达到平台期后生 长稳定，最后到达衰老。4 在生长曲线上细胞数量增加 1 倍时间称
23、为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。二、四唑盐试验（MTT）比色 试验（一）、目的学习四唑盐比色试验，检测细 胞存活和生长情况。（二）、概述四唑盐是一种能接受氢原子的染料， 简称 MTT。活 细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的 MTT 还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT 结晶物形成的量与细胞数成正比。（三）、材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4）5. 倒置相差显微镜6. CO2 培养箱7. 振荡混合仪8. 酶联免疫检测仪9. 移液枪10. 电磁力搅拌机11. 微孔滤器（二）玻璃器皿1. 吸管
