1、原代细胞的取材 一、取材的基本要求（1）取材要注意新鲜和保鲜 新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在 46h 内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于 4存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内 4存放，但时间不能超过 24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含 10%二甲基亚砜 (DMSO) 的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。（2）取材应严格无菌 所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400 单位/mL）甚至加入适量的两性霉素 B 或 10%达
2、克宁液的培养液内于 4下存放 2 小时以上，再用 PBS 洗 23 次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含 400 单位/mL 抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。（3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。（4）要仔细去除所取材料上的血液（血块） 、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。（5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤
3、组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。（6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。原代细胞的分离和制作 人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用 1mm3 的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：一、悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用 1000r/min的低速离心 10 分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间
4、，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁 PBS 洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞 二、实体组织材料的分离方法 （一）机械分散法所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针） ，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细
5、胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。（二）消化分离法1、酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：（）胰蛋白酶分散技术 胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH 以及消化时间的长短等。细胞类型 胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如 乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织
6、等就无效酶的浓度 胰蛋白酶一般采用的浓度为 0.1%-0.25%(活力 1:200 或 1:250)分离方法如下：过夜冷消化 将取得的组织用 Hanks 液洗三次，剪成碎块大小为 4 毫米左右，用Hanks 液洗 23 次以除去血球和脂肪组织，再加入 0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放 4过夜，次日再用 Hanks 液洗涤，弃去上清，共洗 23 次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。（）胶原酶（Collagenase）消化法适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用可用 PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度 200
7、u/mL 或0.10.3mg/mL。2、非酶消化法（EDTA 消化法）常用不含钙、镁离子的 PBS 配成 0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好 消化分离法的操作步骤：（1）剪切 把组织块剪碎，呈 15mm3 大小的组织块。（）加液漂洗 将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁 PBS 洗 2-3 次（采用倾斜，自然沉降法） 。（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或 EDTA）于 37水浴中作用适当时间（中间可轻摇 12 次） ，若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。（4）弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低
8、速离心法尽量弃去消化液。（5）漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3 次后，加入完全培养基。（6）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或 34 层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降 510 分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。原代细胞的培养方法 1、组织块培养法(1)按照前述方法取材，将组织剪成或切成 1mm3 大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。(2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距 0.2 cm0.5cm，一般在 25mL 培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种 2030 小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使
9、瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在 37温箱内。(3)培养 24 小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养 24 小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养 35 天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。2.消化培养法该方法是采用前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质（包括基质、纤维等）去除，使细胞
10、分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。3.悬浮细胞培养法：对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。一、原代细胞的培养与维持 1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为 5108细胞/L，培养基可用 Eagle(MEM)或 DNEM 培养，小牛血清浓度为 10%80%在起始的 2 天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增
11、多，pH 变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。2、悬浮细胞的培养凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中 pH 变酸，说明细胞生长繁殖良好，一般每隔 3 天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失） ，待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH 发生明显变化时，此时可考虑传代。悬浮细胞在未达到饱和密度时，但培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求时，只能采用半量换液的方式
