1、项目名称： 基于诱导多能干细胞技术的若干重大疾病模型与机理研究首席科学家： 金颖 上海交通大学起止年限： 2010 年 1 月-2014 年 8 月依托部门： 上海市科委一、研究内容我们拟在本项目中开展一下研究内容：1. 优化和完善建立人 iPS细胞的技术体系：本研究拟对现有的 iPS细胞诱导技术进行改进，构建新的非整合性细胞重编程因子表达载体，同时构建将细胞重编程因子输入体细胞的蛋白质直接运输系统及采用化合物及小分子进行输送的非病毒系统，筛选能够替代细胞重编程因子的小分子，建立并优化出高效、安全的 iPS细胞诱导技术。同时，我们还将对用于诱导 iPS细胞的体细胞种类进行研究，筛选出比成纤维细
2、胞更有效、更快速地被诱导成为 iPS细胞、并且易于收集的体细胞。此外，我们将对新方法建立的iPS细胞系进行安全性检验。2. 建立若干种重大疾病特异的 iPS细胞系：为了有保证后续研究疾病发病机制和筛选新的疾病治疗靶点，我们将首先建立严重危害人民健康的重大疾病的 iPS细胞系，重点选择我们项目组有一定研究基础的疾病，并优先考虑具有遗传起因的家族病例，包括神经系统 （阿尔茨海默病、帕金森病和小儿脊髓性肌肉萎缩症等)重大疾病、若干其它已知单基因或多基因改变的遗传性疾病（-地中海贫血、骨髓衰竭综合征、Y 染色体微缺失和肥厚性心肌病）和目前尚不知道基因改变的重大传染性疾病（艾滋病） 。当课题 1建立新的
3、方法后，我们将利用新的技术建立更多疾病患者特异的 iPS细胞系。3. 利用疾病特异的 iPS细胞系研究重大疾病的发生机制：重点选择神经系统疾病 （阿尔茨海默病、帕金森病和小儿脊髓性肌肉萎缩症等)和肥厚性心肌病患者特异的 iPS细胞系，以正常人 iPS细胞为对照，将疾病特异性 iPS细胞向相应疾病中的功能细胞定向诱导，比较正常人和患者来源的细胞在分化过程中以及在受到环境危害（如氧化应激）或过度刺激（overexcitation）情况下的形态和功能，建立研究相关疾病的模型。采用 microarray或深度测序技术研究 mRNA表达谱，采用 ChIP-chip(seq)和MeDIP-chip(seq
4、)技术研究表观遗传学谱，分析正常细胞和疾病细胞之间细胞编程的差异，结合蛋白组学和质谱分析，有效地将全基因组表达改变与疾病的表型变化链接起来，为揭示疾病的发生机制和发现新的药物靶点提供依据。4. 建立基于疾病细胞模型的药物评价和筛选体系：利用以上研究建立的某些特定疾病（肥厚性心肌病和帕金森病）的细胞模型对于现有药物的疗效和剂量做出个体化的评估并筛选能使细胞表型逆转的新药。同时结合疾病的发生机制研究结果获得新的治疗靶点，筛选出针对新靶点的激活剂或抑制剂，实现对若干重大疾病的有效控制。二、预期目标（一）总体目标：从解决重大疾病治疗和改善我国人民健康水平的需求出发，针对当前国际iPS细胞研究的关键问题
5、，优化建立人 iPS细胞的技术体系，实现安全有效地建立疾病特异的 iPS细胞系；在此基础上建立严重危害人民健康和我们项目组有一定研究基础的若干重大疾病的 iPS细胞系；掌握疾病特异性 iPS细胞向相应疾病中的功能细胞定向诱导的技术方法，以此作为模型研究这些疾病的发病机制；利用以上疾病模型，对现有药物做出个体化的评估，并发现新的治疗靶点和筛选新的药物，为这些重大性疾病的基础和临床研究开辟新的研究方法和技术平台。通过本项目的实施使我国在干细胞研究领域达到或领先国际水平。同时，以本项目为纽带，促进多学科、多院校的衔接和交流，尤其是基础研究与临床实践的密切结合，培养出一批优秀的干细胞研究人才。（二）五
6、年预期目标1. 优化和完善建立人 iPS细胞的技术体系：包括 1）通过非病毒或非基因组整合载体将重编程因子导入体细胞； 2）发现诱导多能干细胞产生的小分子化合物或新的细胞调控因子；3）筛选出可以被更有效、更快速地诱导成为iPS细胞、并且易于获得的体细胞种类，为建立患者特异的 iPS细胞系提供平台。2. 建立包括神经系统疾病 （阿尔茨海默病、帕金森病和小儿脊髓性肌肉萎缩症等)、若干其它已知单基因或多基因改变的遗传性疾病（ 地中海贫血、骨髓衰竭综合征、Y 染色体微缺失和肥厚性心肌病）和目前尚不知道基因改变的重大传染性疾病（艾滋病）等疾病患者特异的 iPS细胞系。3. 诱导正常人和患者特异的 iPS
7、细胞向有特定功能的细胞分化，应用分子生物学、细胞生物学、生物物理等多种手段发现疾病细胞表型，建立可供研究的阿尔茨海默病、帕金森病、小儿脊髓性肌肉萎缩症和肥厚性心肌病的疾病细胞模型。4. 利用以上研究中建立的疾病模型，重点选择肥厚性心肌病和帕金森病，筛选能逆转疾病表型的新药。同时，基于疾病发生机制研究中发现的可望获得重大疾病治疗的新靶点，筛选针对这些新靶点的化合物，为改善疾病的症状开辟新的途径。5. 取得具有国际影响的原创性成果，在国际重要学术刊物上发表高水平论文30篇以上。其中，在影响因子大于 5的刊物发表 15篇以上。培养一批从事干细胞研究的基础研究与临床应用结合的优秀人才。三、研究方案1.
8、 我们将在现有的建立 iPS细胞的手段的基础上，进一步优化和完善该技术体系。具体包括尝试通过非基因组整合病毒载体、非病毒载体、蛋白直接导入、小分子化合物、新的诱导因子等方法诱导成纤维细胞产生 iPS细胞系；同时，试验其它细胞类型，寻找比成纤维细胞更容易收集和更加容易诱导的细胞类型来建立 iPS细胞。通过这一研究实现更加安全有效地建立 iPS细胞系的计划。2. 利用已经成熟建立 iPS细胞系的技术，即逆转录或慢病毒载体过表达四种转录因子（Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc） ， 建立疾病特异的 iPS细胞系。我们将优先选择严重影响我国人民健康、有遗传起因、本项目组有一定研究基础的重大疾病建
9、立 iPS细胞系。3. 在此基础上，通过生长因子诱导、与其它细胞共培养或形成类胚体的途径诱导正常人和患者 iPS细胞向有特定功能的方向分化。比较正常和疾病 iPS细胞在正常或各种刺激条件下生长、分化、凋亡、附着、运动及细胞特有功能的不同，建立研究重大疾病的细胞模型。4. 利用这些疾病细胞模型，运用各种组学技术，如采用 microarray或深度测序技术研究 mRNA表达谱，采用 ChIP-chip(seq)和 MeDIP-chip(seq)技术研究表观遗传学谱，分析正常细胞和疾病细胞之间细胞编程的差异，结合蛋白组学和质谱分析、影像学和电生理的功能分析，有效地将全基因组表达改变与疾病的表型变化链
10、接起来。另外，根据每一种重大疾病中涉及到的基因产物不同，通过不同的生物化学、分子生物学、细胞生物学和物理学等手段进一步研究疾病发生分子机制。5. 以上分子机制的研究有可能发现对疾病治疗的新的靶点，针对这些靶点可以设计新的药物。另外，利用建立的疾病细胞模型可以直接检验新药，筛选对特异靶点或细胞表型有影响的药物或手段，从而实现对重大疾病的有效控制甚至个体化治疗。四、年度计划年度 研究内容 预期目标第一年1. 构建表达 4 种重编程因子（Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc）的非基因组整合载体，及重编程因子在体细胞的表达。参考Yamanaka 最近发表的小鼠 iPS细胞诱导方法，建立质粒介导
11、的人 iPS 细胞诱导技术；2. 体外表达可穿透细胞膜的重编程因子重组蛋白载体的构建和融合蛋白的表达和纯化;3. 经患者所在医院医学伦理委员会通过和患者知情同意之后，收集建立疾病患者特异的 iPS 细胞系的实验材料；4. 建立患者样本来源的体细胞系；5. 建立正常人 iPS 细胞定向诱导分化为胆碱能神经元, 多巴胺神经元，运动神经元和心肌细胞的技术平台。1. 完成编码 4 种重编程因子的非基因组整合载体构建和在体细胞的表达；2. 完成 4 种重编程因子在体外的表达和纯化；3. 建立获取患者样本的合符伦理的途径；4. 建立患者体细胞细胞系；5. 实现将 iPS 细胞稳定的分化为胆碱能神经元，多巴
12、胺神经元，运动神经元和心肌细胞的技术平台。第二年1. 应用现有的方法建立神经系统重大疾病和肥厚性心肌病患者特异的 iPS 细胞系；2. 比较不同来源体细胞重编程的效率；3. 应用第一年构建的载体诱导体细胞重编程，建立 iPS 细胞系；4. 探索体外表达的融合蛋白进入细胞的最佳条件；5. 对建立的 iPS 细胞系进行常规鉴定；6. 明确病人特异的 iPS 细胞向功能特异的神经元分化能力与正常人1. 获得部分疾病患者特异的 iPS 细胞系；2. 发现重编程效率高的体细胞；3. 建立非基因组整合的 iPS 细胞系；4. 建立体外表达的融合蛋白进入细胞的最佳条件；5. 为课题 3 提供 iPS 细胞系
13、；6. 建立 iPS 细胞定向诱导分化为胆碱能神经元, 多巴胺神经元，运动神经元的技术平台，建立AD，PD，SMA 的发病模型；年度 研究内容 预期目标iPS 细胞的异同，并检测体外培养细胞的存活能力及生理功能；第三年1. 研究 iPS 细胞的小分子诱导技术。首先，筛选能够诱导Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 等4 个内源基因表达的小分子，然后用这些小分子分别替代 4 种因子诱导产生 iPS 细胞。2. 研究应用体外表达和纯化的融合蛋白诱导 iPS 细胞；3. 将已知单基因或多基因改变的遗传性疾病（-地中海贫血、骨髓衰竭综合征和 Y 染色体微缺失）及艾滋病的体细胞诱导为iPS 细胞
14、；4. 比较正常 iPS 细胞和肥厚性心肌病患者 iPS 细胞向心肌细胞分化的差异；5. 了解不同遗传背景的肥厚性心肌病 iPs 来源心肌细胞功能和电生理学相关离子通道障碍的致病位点，选择相应临床药物进行疾病控制，并确认此种细胞模型获得的药物线索和临床实践的相关性。1. 发现新的能分别诱导 4 种重编程因子的小分子，检验发现的小分子在诱导 iPS 细胞中的作用；2. 鉴定体外表达的重编程因子在在诱导 iPS 细胞中的作用；3. 获得 -地中海贫血、骨髓衰竭综合征、Y 染色体微缺失等遗传性疾病及艾滋病患者特异的 iPS细胞；4. 利用肥厚性心肌病患者来源 iPs细胞获得心肌细胞实施临床药物筛选的
15、研究；5. 利用 iPS 模型探索帕金森病的发病机制，借助组学技术筛选关键差异蛋白或信号通路变化。第四1. 筛选对 iPS 细胞的诱导有加速/增强作用的小分子加速剂/增强剂；2. 继续优化诱导 iPS 细胞技术，包括非基因组整合载体和体外表达蛋白技术；3. 采用采用单细胞表达谱及 ChIP-chip(seq)和 MeDIP-chip(seq)技术1. 发现并应用对 PS细胞的诱导有加速/增强作用的小分子加速剂/增强剂；2. 实现高效安全地建立人的 iPS细胞系；3. 鉴定区分正常人和患者的关键性表观遗传标志；4. 发现并鉴定在疾病患者 iPS细胞年度 研究内容 预期目标年 研究正常人和患者的
16、iPS 细胞遗传和表观遗传学谱；4. 在疾病特异 iPS 细胞分化过程中，收集不同时间点的细胞，分别进行 mRNA 表达谱和 microRNA表达谱研究；5. 发现并鉴定 1-2 种在疾病发生过程中变化非常明显且与 AD 发病密切相关的关键基因和microRNA，同时尝试找到相应microRNA 的靶基因；分化过程中的 1-2个关键基因和microRNA，并对其功能做初步研究；5. 发表 3-5篇 SCI收录的高水平论文；第五年1. 对新方法建立的 iPS细胞系的安全性进行研究和鉴定；2. 应用课题 1中建立的新的优化方法建立重大疾病患者特异的 iPS细胞系；3. 利用 iPS模型探索帕金森病合肥厚性心肌病的发病机制，借助组学技术筛选关键差异蛋白或信号通路变化；4. 利用建立的模型进行药物评价和筛选；5. 论文的撰写和发表。1. 为建立疾病患者特异的 iPS细胞提供最佳的方案；2. 明确新方法建立的 iPS细胞的安全性；3. 发现疾病治疗的新靶点；4. 确认快速药物筛选和临床指导的新治疗策略；5. 在国家高水平的学术杂志上发表高质量的学术论文，申请专利。
