1、 题目： 蜂胶黄酮抗 H2O2诱导 PC12细胞凋亡机制的研究药学毕业设计（论文）摘 要目的 观察蜂胶黄酮对过氧化氢（H 2O2）诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC 12）凋亡的影响及机制。方法 培养 PC12 细胞，取对数生长期细胞分为五组，空白对照组、模型组、蜂胶黄酮高、中、低剂量组，剂量分别为 200mg/L、100 mg/L、50 mg/L.药物预处理 2h 后，孵育 H2O2（140 mol/L）24h 诱导过氧化损伤。TUNEL 试剂盒检测原位细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞内活性氧水平以及细胞周期，ELISA 检测细胞内 Caspase-3 蛋白含量。结果 TUNEL 细胞凋亡染色显
2、示, H2O2组与空白对照组比较染色明显加深,而蜂胶黄酮组染色明显变浅，说明蜂胶黄酮能对抗 H2O2诱导细胞凋亡；周期结果显示 H2O2组处于G0/G1 细胞明显增多，而处于 G2/M、S 期细胞明显减少，细胞增殖降低，而蜂胶黄酮增加S 期细胞促进细胞增殖；与空白对照组相比 H2O2组活性氧水平、细胞内 Caspase-3 含量明显增高，而蜂胶黄酮各剂量组活性氧水平降低，Caspase-3 含量减少。结论 蜂胶黄酮对 H2O2诱发 PC12 神经细胞凋亡有显著的抑制作用，其机制可能其影响细胞周期、清除氧自由基、降低凋亡因子 Caspase-3 有关。 关键词 蜂胶黄酮；PC 12 细胞；H 2
3、O2;Caspase-3；细胞凋亡毕业设计（论文）AbstractObjective: To observe the protection of propolis flavonoids on rat with injuried pheochromocytomacells(PC12) induced by hydrogen peroxide(H2O2) and to explore its possible mechanism.Methods: Culture PC12 cells,the cells in the logarithmic growth phase were divided in
4、to five groups,blank control group,model group,propolis flavone of high,medium and low dose group,the dose of 200mg/L,100 mg/L,50 mg/L. After 2h 0f Pharmacological preconditioning,the cells were incubated with H2O2(140 mol/L) for 24h to induce oxidative damage. TUNEL Kit is used for determining Cell
5、 apoptosis,Flow cytometry was used to detect the intracellular ROS level and cell cycle,ELISA is used for determining the concentration of protein Caspase-3 in cells.Results: Apoptosis of TUNEL cells staining, H2O2 group compared with the control group, staining was deepened, and the propolis flavon
6、e group was significantly lighter, that propolis flavonoids can antagonize the apoptosis induced by H2O2 Cycle showed that H2O2 group in G0/G1 cells were increased, and in the G2/M,S phase cells decreased significantly, reduced cell proliferation, and propolis flavonoids increased S phase cells prom
7、oting cell proliferation; compared with the blank control group, caspase-3 in H2O2group, the levels of reactive oxygen species in cells increased significantly, while the propolis flavone in all dose groups decrease the levels of reactive oxygen species, reduced caspase-3 content.Conclusion: Propoli
8、s flavonoids on H2O2-induced PC12 cells damage a significant protective effect,The mechanism may be its effect on cell cycle, scavenging oxygen free radicals, decrease the apoptosis related factor caspase-3.Key words: Propolis; flavonoids; PC12 cells; H2O2; apoptosis毕业设计（论文）目 录正文011 前言012 仪器与试剂013 实
9、验方法023.1 蜂胶总黄酮的提取与含量测定023.2 PC12 细胞的培养及分组给药 023.3 TUNEL 细胞凋亡原位检测023.4 流式细胞仪检测细胞周期023.5 流式细胞仪检测细胞内活性氧水平033.6 ELISA 试剂盒检测细胞内 Caspase-3 蛋白含量034 实验结果034.1 TUNEL 细胞凋亡原位检测034.2 流式细胞仪检测细胞周期044.3 流式细胞仪检测细胞活性氧水平054.4 ELISA 检测细胞内 Caspase-3 蛋白含量065 讨论076 结论08参考文献09文献综述10致谢15毕业设计（论文）1蜂胶黄酮抗 H2O2诱导 PC12细胞凋亡机制的研究1
10、 前言老年性痴呆 (Alzheimers disease, AD) 是一种以进行性认知功能障碍和记忆能力受损为主的中枢神经系统退行性疾病。该病严重威胁中老年人的健康，对社会和经济造成巨大压力。因此，研究 AD 发病机制及寻求有效药物防治已成为目前世界医药界的热点和难点。氧化应激损伤神经元在神经退行性病变中具有重要的病因学意义。研究表明老年性痴呆与氧化应激损伤密切相关。H 2O2是和氧化应激反应密切相关的活性氧之一，它参与了许多神经系统疾病的发病，与多种疾病如自身免疫病，肿瘤，炎症以及细胞凋亡的发生有关，长期用作神经细胞氧化损伤的诱导剂。蜂胶(Propolis) 被誉为“紫色黄金” ，是蜜蜂从植
11、物新生枝嫩芽或花蕾处采集的树脂类物质，掺入其舌腺及蜡腺分泌物，经蜜蜂反复混合而成的胶状物质。蜂胶富含多种具有药用价值的活性成分，其中主要是黄酮类化合物。本课题组前期研究发现蜂胶醇提物对东莨菪碱、亚硝酸钠、三氯化铝诱导的小鼠学习记忆障碍模型具有明显保护作用，对 D-半乳糖诱导衰老模型小鼠学习记忆功能也有保护作用，其作用机制可能与其对抗小鼠体内过氧化反应有关 1-2。通过 MTT、流式细胞术等前期研究也发现蜂胶黄酮能有效的保护 H2O2诱导的 PC12 细胞损伤，提高细胞存活率，抑制细胞凋亡，为进一步研究其抗痴呆作用奠定了基础。PC12 细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，在细胞形态，结构，功能上与多
12、巴胺神经元有许多相似特征，能够表达多巴胺转运体，是体外神经细胞损伤及保护作用研究使用最为广泛的细胞系。本实验拟培养大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞 PC12 细胞株，以 H2O2诱导神经细胞损伤，蜂胶黄酮干预， TUNEL 染色观察蜂胶黄酮的抗凋亡作用，并通过检测细胞周期、活性氧及 Caspase-3 对蜂胶黄酮的抗凋亡机制进行研究。2 仪器与试剂2.1 材料和试剂蜂胶原胶，购自山东省实验种蜂场；PC 12 细胞（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株） ，购毕业设计（论文）2自南京凯基生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO） 、胰蛋白酶、PBS,购自于索莱宝；完全 DMEM 培养基、新生牛血清(NBS)，购
13、自于南京凯基生物技术有限公司；TUNEL 细胞原位凋亡测定试剂盒、活性氧试剂盒及细胞周期检测试剂盒（购自于南京凯基生物技术有限公司） 、ELISA 试剂盒（蓝基生物技术有限公司） 。其它试剂均为分析纯。2.2 仪器二氧化碳孵箱（Thermo） ；单人双面超净工作台（SW-CJ） ；倒置式生物显微镜（XDS-1B） ；酶标仪（Infinite f200） ；流式细胞仪（FACSCalibur） ；高速离心机（TGL-16G） ；数控超声波清洗器（KQ-600DB） ；旋转蒸发仪（RE-52A 上海亚荣生化仪器厂） 、恒温干燥箱（施都宝 Bao-80A） 、恒温水浴锅(HW.SY21-K)、超低温
14、冰箱（Thermo） 。3.实验方法3.1 蜂胶黄酮的提取与含量测定取蜂胶 50g 粉碎，用 85%乙醇浸泡 4 天，配料比蜂胶（g）：85%乙醇（ml）为 1:30，在 30条件下超声 50min 后，旋转蒸发仪蒸发成浸膏状，冰箱 4内保存备用。以芦丁为标准品，得标准曲线 y=13.656x+0.0404， R2=0.9969，计算蜂胶中黄酮含量为：4.86mg/g。 3.2 PC12细胞的培养及分组给药在 37，恒湿的 5%CO2 细胞培养箱内培养 PC12 细胞，完全培养基为高糖 DMEM 培养基中含 10%新生小牛血清，加入 100 g/ml 链霉素和 100 g/ml 氨苄青霉素。细
15、胞为上皮样贴壁生长，每 23 d 传代 1 次，取对数生长期细胞用于实验。将细胞分为五组：空白对照组、模型组、蜂胶黄酮高、中、低剂量组。加药前先将蜂胶黄酮溶于 DMSO 中，再用完全培养基稀释，使药物终浓度为 200 mg/L、100 mg/L、50mg/L，DMSO 终体积为 1，空白对照组及模型组加入含 1DMSO 完全培养基。药物预处理 2h 后，再加入 H2O2培养24h，24h 后检测各项指标。3.3 TUNEL 细胞凋亡原位试剂盒检测细胞以 2105 个/孔接种量接种于 24 孔带爬片的培养板上，药物分组处理后，取出爬片，自然晒干后用 4%多聚甲醛室温固定 20-30min，PBS
16、 漂洗三次，每次5min，1%TritionX-100 通透 5min，PBS 漂洗，3% H2O2 封闭 10min，PBS 漂洗吸干，每个样本滴加 50lTdT 酶反应液，加盖玻片放入温盒，37避光反应 60min，PBS 漂洗吸干，加 5olStreptavidin-hrp 工作液，加盖玻片放入温盒，37避光反应 30min，PBS 漂洗吸干，加 50lDAB 工作液，反应 5min，显微镜下观察，拍照。3.4 流式细胞仪检测细胞周期毕业设计（论文）3细胞以110 6个/孔的接种量接种于6孔培养板上。药物分组处理后，加入不含 EDTA的胰酶消化，加培养基终止消化，PBS冲洗2次，加入2m
17、l-20预处理12h的70%乙醇固定24小时后，离心5min（小于1000r/min） ，弃去乙醇，每管加入 PBS洗两遍，将细胞混悬后离心5min（小于1000r/min） ，按照1:50的RNaseA和 PBS，37恒温水浴锅水解30min，过20目细胞筛于流式管内，加入5l PI染色10-15min ，流式细胞仪测细胞周期。通常用细胞增殖指数PI( pro liferation index)作为衡量细胞增殖的指标，PI 即指处于DNA 合成期及有丝分裂期的细胞在全部细胞中所占比例，公式表示为: PI= ( S+ G2 /M ) / ( G0 /G1 + S+G2 /M) *100%3.5
18、 流式细胞仪检测细胞内活性氧细胞以 1106个/孔接种量接种于 6 孔培养板上，药物分组处理后，加入不含 EDTA的胰酶消化，加培养基终止消化，提取细胞，PBS 离心冲洗 2 次，收集于流式管中，离心5min（1000r/min） ，按照 1:1000 有用无血清的培养基稀释 DCFH-DA，去 PBS 加入稀释好的 DCFH-DA，37孵育 20min，3-5min 摇匀一次使充分安装探针，PBS 洗三次，流式仪测细胞内氧自由基含量。3.6 Elisa 检测 Caspase-3细胞以 1106/孔的接种量接种于 6 孔培养板上。药物分组处理后，加入不含 EDTA的胰酶消化，加培养基终止消化，
19、提取细胞,PBS 洗三次，加微量 PBS 反复冻融三次，每次半小时，使细胞离解，细胞液检测 Caspase-3 含量，取试剂盒至于室温平衡 30min，再取酶标板按照标准品的次序加 50l 于空白孔，空白孔加 50l 样品，空白 50lPBS，在每个空加 100l 酶标记溶液（不含空白孔） ，封口 37 培养箱孵育 1h（时间可适当延长） ，反复充分洗 5 次，拍干，各加 50lA.B 显色剂，避光 37孵育 15min，加 50l 终止液，450nm 检测 OD 值。4 实验结果4.1 蜂胶黄酮对细胞凋亡的影响蜂胶黄酮作用 2h 后加入终浓度为 140mol/L H2O2作用 24h 后做
20、TUNEL 原位细胞凋亡染色，结果图 1 所示，蜂胶黄酮组颜色明显低于 H2O2损伤组，说明蜂胶黄酮的凋亡率比模型组明显降低。毕业设计（论文）4图 1 TUNEL 染色观察蜂胶黄酮对 H2O2损伤保护作用(A 空白对照组200 B H 2O2损伤组100 C 蜂胶黄酮保护组100) 4.2 流式细胞仪法检测细胞周期与空白组比较，给予 H2O2后，G0/G1 期细胞明显增多，G2/M、S 期细胞明显减少（P0.01),细胞增殖降低，而蜂胶黄酮组 G0/G1 期细胞明显减少，G2/M、S 期细胞明显增多，说明蜂胶黄酮具有促进细胞增殖（P0.05)。其中蜂胶黄酮组 S 期细胞增加较多，说明蜂胶黄酮可
21、能会促进细胞有丝分裂。结果见表 1、图 2。表 1 蜂胶黄酮对细胞周期的影响分组 G0/G1 G2/M S 增殖指数（PI ）空白对照组 47.623.2* 17.311.71* 35.072.51* 52.383.22*模型组（H 2O2140mol/L） 63.342.5 10.750.98 23.423.55 34.173.81蜂胶高剂量组（ 200 mg/L） 54.611.62* 8.970.84 34.481.54* 45.391.61*蜂胶中剂量组（ 100 mg/L） 57.851.23* 9.921.11 32.171.40* 41.151.23*蜂胶低剂量组（ 50 mg/
22、L） 61.831.00 8.891.79 29.291.04 38.182.42毕业设计（论文）5图 2 蜂胶黄酮对细胞周期的影响（A 空白组 B 模型组 C 蜂胶黄酮高剂量组 D 蜂胶黄酮中剂量组 E 蜂胶黄酮低剂量组） 4.3 蜂胶黄酮对细胞内活性氧水平的影响与空白组比较，给予 H2O2后，细胞内活性氧水平明显提高（P0.05),而蜂胶黄酮各剂量组能明显降低细胞内活性氧水平（P0.01)，且具有剂量依赖性，结果见表 2、图 3。表 2 蜂胶黄酮对细胞内活性氧水平的影响(xs, n=3) 注：与模型组比较*P0.05，*P0.01。组别 活性氧( mg/ml )空白组 76.361.83*
23、模型组（ H 2O2140mol/L） 171.7924.01蜂胶黄酮高剂量组（ 200 mg/L） 82.7514.73*蜂胶黄酮中剂量组（ 100 mg/L） 103.2715.20*蜂胶黄酮低剂量组（ 50 mg/L ） 151.9626.70*毕业设计（论文）6图 3 蜂胶黄酮对细胞内活性氧水平的影响（A 空白组 B 模型组 C 蜂胶黄酮高剂量组 D 蜂胶黄酮中剂量组 E 蜂胶黄酮低剂量组）4.4 蜂胶黄酮对细胞内 Caspase-3 蛋白含量的影响与空白组比较，给予 H2O2后，细胞内 Caspase-3 蛋白含量明显提高（P0.05),而蜂胶黄酮各剂量组能明显降低细胞内 Caspase-3 蛋白含量（P0.01)，说明蜂胶黄酮可抑制凋亡因子的产生。结果见表 3。表 3 蜂胶黄酮对细胞内 Caspase-3 蛋白含量的影响(xs, n=3)注： 与模型组比较*P0.05，*P0.01。组别 Caspase-3( ng/ml )空白组 7.743.09*模型组（ H 2O2140mol/L） 34.631.19蜂胶黄酮高剂量组（ 200 mg/L） 13.984.13*蜂胶黄酮中剂量组（ 100 mg/L） 25.563.19*蜂胶黄酮低剂量组（ 50 mg/L ）29.792.46*
