1、第六章 再生,第一节 再生概述第二节 水螅的再生、重建和模式第三节 涡虫的再生 第四节 虾蟹的再生第五节 海参的再生 第六节 脊椎动物肢体再生第七节 主要器官的再生,一、再生的概念二、认识三、再生的分类,第一节 再生概述,一、概念,再生（regeneration）：指生物体以现存的细胞和组织替代衰老或修复失去的细胞和组织的过程，是生物保存自己，保存后代的一种能力。,二、认识,生命的所有水平包括器官水平、细胞水平及分子水平上都能发生再生 。器官水平肝脏细胞水平血细胞分子水平酶,植物细胞具有全能性，每个细胞可以长成一个完整的个体。部分动物细胞具有再生能力。生物“全息”属性是再生的基础。即细胞核的全
2、能性决定个体完整性的重建。,三、再生的分类,1、生理性再生 2、修复性再生（创伤性再生） 3、繁殖再生,1、生理性再生,对变性和衰老的生物分子和细胞组织的清除与更新的现象 。如血细胞、上皮细胞等。生理性再生的范畴和内容不同。水螅间质干细胞可产生成体各种细胞。但多数受限，如神经细胞不能修复。终生维持的一种再生。,2、修复性再生,多细胞生物机体或组织受到创伤后，可以自动地对失去的结构进行构建和恢复。低等海绵、腔肠、涡虫、环节动物、棘皮动物（海星）几乎可以修复身体所有缺失。高等动物低得多，如骨折后的愈合、皮肤划伤等的修复等。与进化无关，秀丽线虫再生能力低。,3、繁殖再生,天然存在的有机体的克隆。自我
3、克隆方式有几种如分裂（涡虫、环节动物）、出芽（水螅）、多细胞被囊体（海绵的芽球、苔藓虫的休眠卵）。,四、再生的机制（低等动物）,变形再生（morphallaxis）新建再生（微变态再生）（epimorphosis）,变形再生,没有新的生长，主要通过尚存的组织细胞去分化重新构建和组织结构的重新界定，建立个体的再生过程，形成体积较小的新个体。如水螅。,新建再生,通过细胞分裂等生长方式重建新的结构，受伤部位的其他组织细胞并不直接介入再生过程。 干细胞是最常见的再生方式，通过干细胞或祖细胞的分裂、分化。如表皮干细胞、骨骼肌干细胞、肝脏干细胞等，脑和脊髓中也发现神经干细胞。,再生是转分化、细胞迁移和细胞
4、增殖的结合（综合分析）,干细胞有分裂、分化的能力。细胞有明显的迁移过程，到组织需要的地方。已分化的细胞可去分化。,第二节 水螅的再生模式,一、水螅变形再生二、水螅新建再生,一、水螅变形再生,1、水螅变形再生实验2、分散再重聚实验3、移植实验4、解释,变形再生实验将水螅身体的中间部分切下1/20的环形体柱，这个切下的体柱将在上端产生头，下端形成尾。这种横切体柱的再生不需要细胞分裂，仅靠尚存的细胞重建一个正常的体积很小的水螅。经过喂养，细胞增殖，长大，完成再生过程。,4、解释,细胞保持它们以前所在位置的记忆，新形成的结构是细胞以前在身体上所获得的相对位置信息作用的结果。位置值因子抑制子浓度,位置值
5、因子,是头部和足部细胞本身具有的，从头到足浓度逐渐降低，决定位于头部的细胞在移植中仍形成头，足也是如此。,抑制子浓度,由头部生成，从头到足逐渐降低，作用是抑制头部再生。在同一区域，抑制子浓度总是略高于位置值的最低值，所以正常情况下，不当的头部不会产生。去掉头部，导致抑制子浓度下降，位置值也相应提高到头部区域的位置值，使得抑制子浓度小于位置值的浓度，新的头部产生。,二、水螅新建再生一种成体未分化细胞，位于上皮细胞间质中，能形成任何一种细胞，如神经细胞、刺细胞、腺细胞甚至配子。形成神经细胞区别与哺乳动物，这是水螅可以永生的基础。位于消化管壁的上皮细胞虽已分化，但有分裂能力。水螅体上皮肌细胞能去分化
6、，恢复分裂能力，产生多种类型的细胞，包括神经细胞和生殖细胞。,第三节 涡虫的再生,涡虫可以被横切或者纵切，切下的每一部分都能再生丢失的部分。切割后，在切割表面形成芽基，失去的部分就从芽基上长出来，但剩余部分重建，体积缩小。,第四节 昆虫、虾蟹附肢的再生,动物通过自体切割（autotomy）即有机体部分身体的自残和脱落如蜥蜴的尾巴、节肢动物的腿，以逃避天地。蜕皮后再生出新的附肢，有时结构不完整。 再生的机制参考两栖类。,第五节 海参的再生,一、横切再生二、内脏器官再生三、表皮再生四、海参再生的机制,一、横切再生,纵切不能存活横切？1/2、前1/3、后1/31/2，全部死亡；前1/3，后段成活率：
7、29.2%，减重65%后1/3，前段成活率: 45.8%，减重66%,二、内脏器官再生,消化道再生过程消化道再生的组织学消化道再生的细胞来源消化道再生过程中的能量代谢温度对消化道再生的影响消化道再生过程中特殊表达的因子排脏的影响因素,消化道再生过程研究,对刺参腹腔注射0.35M KCl溶液2-4ml（剂量为个体重的2%左右），1-2min后刺参排脏。将排脏的刺参和对照组（未诱导排脏的正常刺参）分别放在水槽内培养，实验进行70d。,排脏后每7d取4-6个样品观察刺参再生情况。样品在6%MgCl2溶液中麻醉1.5-2h后，沿腹中线的右侧解剖。,原基形成阶段 1-7d肠腔形成阶段 8-21d分化阶段
8、 22-42d生长阶段 43-70d,消化道再生过程中体重变化,第010d：体重呈下降趋势，第10d体重最低仅为43.96g；第10d15d，体重略有升高，但不明显（P0.05）；第15d25d，体重处于稳定状态，无明显的增长或降低；第25d60d，刺参体重逐渐增加；再生结束时（60d），刺参体重为61.35g，是对照组的63.26%。,天数（d）Time,体重（g）Weight,消化道再生过程中生化组成的变化,实验组刺参体壁中的粗蛋白、粗脂肪、粗灰分和能值在再生结束时较对照组均有所下降，分别降低了15.58%，22.58，4.63%和24.71%。,对照组和实验组刺参体生化组成比较Compa
9、ration of biochemical compositions of A.japonicus selenka between control group to trial group,刺参排脏的评价,排脏后刺参体重明显降低，生化组成发生很大变化，生长受到影响。一些环境因子实验，由于刺参内脏的排出，不得不终止。可重演胚胎发育过程中消化道等器官的发生，为组织工程研究打下基础，刺参可作为消化管再生的模型动物。,排脏的影响因素,物理因素：挤压、缺氧；化学因素：各种重金属离子；盐度？pH?,三、表皮再生研究,表皮再生组织学表皮再生细胞起源,人工创伤的形成用无菌解剖刀刮除刺参背部体壁的深褐色角质层和
10、上皮细胞层，露出均一的乳白色结缔组织。创伤面积约55 mm2，而后将实验刺参放入水槽中培育。实验进行21天。,刺参体壁从外向内主要有4层：表皮、结缔组织、肌肉组织和体腔上皮。表皮由角质层和多层上皮细胞组成。,四、体壁再生,手术后1d，仿刺参体壁已去除，疏松结缔组织直接暴露，创伤面凹陷，附近有成纤维细胞和胶原纤维聚集（图1）。手术后3d，创伤处结缔组织外层有上皮细胞聚集，细胞排列杂乱疏松（图2）。手术后4d，创伤处上皮细胞数量增加，并形成一薄层，细胞排列仍不规则。靠近表层的结缔组织疏松，与内层结缔组织间形成一条带状间隙（图版3）。,四、体壁再生,手术后7d，新生表皮层增厚，上皮细胞密集， 与结缔
11、组织连接紧密。表皮外层出现角质层。间隙带内的成纤维细胞和胶原纤维增多，排列逐渐均匀（图4）。手术后11d，上皮细胞层和角质层厚度接近正常组织，只是上皮细胞排列仍显凌乱。结缔组织间隙带基本弥合（图5）。手术后21d，上皮层细胞数量和排列同正常组织，结缔组织分布均匀（图版6）。,海参再生过程的分子调控,2006年段晶晶等采用mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）对仿刺参消化道的再生进行了分子生物学研究。在肠道再生的第6、9、15和24天取样，对基因的差异表达进行分析，结果表明再生15天为基因表达量高峰；经测序和比对，最终得到与已知肌球蛋白重链10基因具有较高同源性的基因序列在内的12条肠道再生相
12、关EST序列,并提交到GenBank数据库中，登陆序列号为Ex453801-Ex453812。,消化道再生,2007年陈秋实等应用mRNA差异显示技术对仿刺参正常表皮和手术后再生48h、72h的表皮组织的差异表达进行了分析，共得到133条差异条带。对其中31条进行测序发现3个片段分别与已知基因真核细胞翻译起始因子 eIF4G、血管内皮生长因子CD151基因、拓扑异构酶I（ Topo I）具有较高的同源性。,1、mRNA差异显示技术,3,2、抑制性消减杂交技术（SSH),2010年 张慧敏等利用抑制性消减杂交技术对仿刺参体壁再生过程的相关基因进行了研究。以完好仿刺参体壁作为对照组，手术创伤后再生
13、24h，48h，72h，96h，120h后5个时间段的体壁作为实验组，构建了消减cDNA文库。,对文库中768个克隆进行斑点杂交筛选，共得到292个阳性克隆片段，其中105个阳性克隆在对照组中上调表达，187个阳性克隆在再生组中上调表达。,共768个克隆,187,105,476,193个克隆进行测序，测序结果进行BLAST检索分析。发现20个克隆与已知基因序列高度同源。,未测出3%,未比对上6%,已知功能基因15%,潜在功能基因76%,100个克隆进行测序，将得到的序列和NCBI中脊椎动物和非脊椎动物的蛋白序列比对（blastx，核酸和蛋白）,未测出3%,未比对上6%,已知功能基因15%,潜在
14、功能基因76%,2010年王雪利用同源克隆对仿刺参表皮生长因子受体EGFR基因进行克隆；并采用荧光定量Real-time PCR技术对该基因在仿刺参不同组织中的表达及其在表皮再生不同阶段的表达进行了分析。,3、同源克隆与Real-time PCR表达分析,2011年赵祥吉利用SSH消减文库得到的EST片段，采用SMART-RACE法 ，从仿刺参体腔细胞中克隆得到了细胞凋亡相关基因26S蛋白酶调节亚基s7基因，并对其表达部位进行分析。,4、SMART-RACE与Real-time PCR表达分析,应用SMART-RACE法 ， 王艳枫从仿刺参体壁中克隆出转录翻译相关基因核糖体蛋白RPL17、RP
15、L30两个基因，并采用Real-time PCR对该基因在不同组织中的表达进行了研究。,4、SMART-RACE法与Real-time PCR表达分析,五、肌肉组织的再生,体腔膜细胞成为新的肌肉组织手术缝合技术用于海参体壁,至25d，对照组累计死亡31头，死亡率达51.7%。实验组没有出现明显高峰，化皮的个体有些逐渐恢复，试验期间共死亡3头，死亡率为5.0%。实验用海参60只。,六、再生机制,1、变形再生 2、新建再生,第六节 两栖类附肢再生,一、 附肢再生过程 二、调控,一、 附肢再生过程,1、创伤修复 附肢截断后，表皮迁移覆盖住伤口，1-2天完成。伤口愈合后，表皮细胞增殖，形成多层的细胞团
16、，在截断附肢的顶端形成圆锥状膨大，为表皮帽。创伤处出现发炎反应，炎症反应消失后，表皮下形成瘢痕组织。2、组织破坏和去分化 残留附肢中出现大片组织溶解。创伤表面下的区域释放胶原酶，使存在的组织细胞去分化，软骨和骨细胞呈现胚胎间质细胞形态，排列松散。,一、 附肢再生过程,3、再生芽基的形成 这些去分化的细胞在顶外胚层形成一突起称芽基。此时再生的附肢形成一个上皮-间质系统，与胚胎器官分化相似。芽基细胞增殖，形成新肢体。4、形态发生和分化 芽基分化为软骨，并伸向远端，软骨骨化成骨。肌肉形成包围软骨，血管晚些时候从残肢伸向新生组织，被截断的神经的轴突伸入芽基，神经组织在控制附肢再生中起重要作用。,二、调
17、控,1、细胞周期因子的调控 2、神经的作用 3、表皮的作用 4、激素的作用,1、细胞周期因子的调控,细胞周期因子具有调控细胞增殖和分化的双重功能。细胞分裂主要受周期蛋白依赖性激酶（CDK）的调控，CDK作用于视网膜瘤蛋白（pRB），有活性的pRB与转录因子E2F结合，使后者无法激活与细胞分裂相关基因的转录，因此不具备分裂能力。当pRB磷酸化后失去活性，释放出E2F，E2F在核定位后激活相关基因的转录，促进细胞增殖。 细胞分化与pRB有关。当CDK活性受到周期蛋白激酶抑制子（CKI）抑制时，有活性的pRB通过另外的效应子激活促分化转录因子，促进细胞分化。,2、神经的作用,胚芽的分裂增生依赖于神经
18、的支持，神经能为胚芽的生长提供再生促进因子，如神经胶质生长因子（GGF）、成纤维生长因子（FGF）。神经对起始再生很重要。但附肢分化和形态发生不依赖神经。,3、表皮的作用,顶表皮帽能促进细胞有丝分裂，以促进芽基形成和以后的附肢再生。,4、激素的作用,将垂体前叶切除，阻止两栖类附肢再生。垂体激素只作用于再生的起始阶段。参与的激素可能是生长激素、催乳素和甲状腺素。,第七节 主要器官的再生,一、肝脏的再生 二、表皮再生,一、肝脏的再生,1、再生方式 2、肝细胞的分裂增殖 3、再生的调控,1、再生方式,剩余细胞的分裂增殖；干细胞增殖和分化；门管周围肝细胞的过度生长。当正常肝细胞的增殖不能完全补偿丢失的
19、细胞时，干细胞才开始增殖分化。如果前两种方式被完全抑制，才采用第三种细胞生长增大。,2、肝脏细胞的分裂增殖,组成肝组织中的所有细胞都有分裂能力。如肝细胞、胆小管上皮细胞、肝巨嗜细胞等。分裂能力很强，一个肝细胞至少分裂34次，产生1.71010个细胞。有人统计：一个大鼠的肝细胞可以分裂成50个正常肝脏所需要的细胞。,3、肝脏再生的调控,修复过程中大部分的肝细胞边分裂边行使正常的功能。如血糖调控、蛋白合成分泌胆汁等。1- 5min，尿激酶（uPA）活性剧增；30 min，肝细胞质膜超级化；5h，胆小管发生形态改变，胆汁分泌量下降。,3、肝脏再生的调控,结合胰岛素样生长因子I （IGF-I）、II（
20、IGF-II）蛋白，上升到原来水平的100倍；与细胞分裂相关的蛋白和酶，如胸苷激酶、组蛋白、周期蛋白、CDK表达发生变化；出现胚胎标记基因的表达如甲胎蛋白（AFP），醛缩酶胚胎异构酶、丙酮酸激酶等。,二、皮肤的再生,皮肤是人体最大的器官，有抵御微生物入侵和紫外线辐射、防止水分丢失，调节体温的作用，同时也是免疫系统的组成部分之一。成体皮肤在损伤后1-2周修复，但伤口愈合后会形成伤疤。胚胎皮肤的修复再生不产生疤痕。皮肤由两层组织组成，表皮层，包括角质层和上皮层，深层是真皮，由富含胶原蛋白的结缔组织组成，为表皮提供支撑和营养。皮肤损伤后，主要由表皮干细胞或定向祖细胞的增殖以及上皮细胞转化为角质层细胞
21、。,1、表皮再生过程,血液凝结炎症细胞向伤口聚集伤口处的上皮再生,血液凝结,伤口损伤到真皮，被割断的血管渗出血液，立即凝集成血块，将伤口覆盖，凝结的血块主要是纤维蛋白，少量血浆蛋白，起两方面的作用：保护裸露伤口，提供表皮修复时细胞迁移的临时基质，储存大量的细胞素和生长因子，启动伤口的愈合和修复。,炎症细胞向伤口聚集,损伤后几分钟，血液中的炎症细胞如嗜中性粒细胞、单核细胞、白细胞等向皮肤被损伤部位集中，炎症细胞分泌蛋白水解酶和多种活性氧，杀灭细菌等微生物，吞噬基质残渣，同时还分泌促进细胞增殖的多种生长因子。,伤口处的表皮再生,真皮层中的成纤维细胞分裂增殖，迁移到临时基质，填补丢失的真皮层。大量新
22、的血管和神经在伤口边缘形成。表皮干细胞起更重要的作用。干细胞位于表皮基底层，约占基底细胞的1-10%，干细胞在受到各种细胞因子包括白细胞介素（IL）、干细胞因子（CSF）、表皮细胞生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等作用下，部分干细胞脱离干细胞群，开始分化，先形成定向祖细胞，然后定向祖细胞多次分裂，形成上皮细胞。,伤口的收缩,在各种因子的启动下，临近伤口的成纤维细胞在皮肤损伤后不久就立即开始增殖，3-4天开始迁移到由凝集的血块组成的临时基质，并重新建立富含胶原蛋白的基质。一周后，临时基质全部由激活的成纤维细胞所替代，一部分成纤维细胞开始转化为肌成纤维细胞，表达平滑肌肌动蛋白，有很强的收缩力，结缔组织体积变小，导致伤口的收缩变小。,2、生长因子在皮肤再生过程中的作用,已发现14种生长因子，调控炎症细胞向伤口处聚集、角质形成细胞的运动和分裂、结缔组织的收缩和血管的生成。,举例；角质细胞运动和增殖生长因子 来源 靶细胞和作用EGF 血小板 角质形成细胞运动和增殖TGF 巨嗜细胞 角质形成细胞运动和增殖HB-EGF 巨嗜细胞 角质形成细胞、成纤维细 胞增殖,主要研究内容,高等动物再生因子组织工程低等动物再生研究,
