1、热休克蛋白与免疫(Heat Shock Protein and Immunity) 一、 概 述热休克蛋白(heat shock protein, HSP)是一具有重要生理功能，参与免疫应答的高度保守的蛋白质分子大家族；根据其分子量的大小和同源程度，可将其分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子 HSP 等几个家族。生理、病理(如创伤和感染)及环境因素(如温度突然升高)等都可诱导一切细胞包括原核细胞和真核细胞产生 HSP，故又称应激蛋白(stress protein，SP)。HSP 的生物学功能广泛，不仅表现在应激条件下维持细胞必需的蛋白质空间构象，保护细胞生命活动，以确保
2、细胞生存，而且在蛋白质折叠、跨膜运输、转位、细胞骨架及核骨架稳定等基本功能方面发挥重要作用，以调节这些蛋白质的活性和功能，而自身又不参与大分子蛋白质的组成，故 HSP 又称“分子伴侣”(molecular chaperon)。最先发现 HSP 的是 Ritossa(1962 年)，他观察到正常果蝇暴露高温导致休克后，其唾液腺染色体变得疏松膨胀，对此现象的的原因他未能作深入的研究。12 年后，Tissieres等(1974 年)证实增高温度使果蝇染色体蓬松是由于热休克激发染色体内基因转录合成特异蛋白质引起的，遂将该蛋白称为热休克蛋白(HSP)。自 1982 年在冷泉港召开了第一次热应激蛋白国际会
3、议，世界上各国对 HSP 的研究蓬勃发展起来了。Nover(1984 年)与 Soger 等(1987 年)先后阐明编码这种蛋白质的序列、基因结构及位点，如编码 HSP70 的基因在人类MHC 基因位点图上介于补体成分与肿瘤坏死因子(TNF)之间，在大鼠中则靠近 MHC-类抗原基因，在小鼠中，HSP84 基因与 MHC 连锁。除了温度的刺激作用以外，发现各种有害的理化因素，如氧化剂、重金属、乙醇或代谢抑制物等亦可促使 HSP 的合成增加。在机体遭遇组织损伤、病原体感染、炎症或遇有热原性的某些细胞因子(IL-1、IL-2、TNF、IFN)的刺激，皆会伤害细胞，使其蛋白质构型发生改变及功能消退，从
4、而引起细胞的应激反应，编码合成 HSP，以保护细胞和对抗有害因子。Ames 等(1986 年)或 Filds 等(1986 年)分别用小剂量 H2O2预先处理能高表达 HSP 的细胞内感染的鼠伤寒沙门氏菌，使其应激合成 HSP，结果能耐受致死量 H2O2或高热度攻击而不死；另一方面用同量的 H2O2预先处理缺乏 HSP 基因表达的感染该菌的变异株，随后用高剂量的 H2O2或热攻击，结果病原体和感染细胞皆被灭活，此因缺乏产生 HSP 或 SP 之故。Srivastava(1996 年)从甲基胆蒽诱发的小鼠纤维瘤细胞上分离获取了 HSP70，并证实可作为一种肿瘤转移性抗原诱发宿主的抗肿瘤免疫反应。
5、Tamura 等(1993 年)也以 H-ras 转化的小鼠纤维肉瘤细胞 W31 上证实其表达 HSP70，并发现一种 CD8-CD4-双阴性 T 细胞介导了HSP70 诱发的抗肿瘤免疫反应，这种 CD8-CD4-双阴性 T 细胞后来被证实为 T 细胞。近年来证实 HSP 及其相关复合物是 T 细胞能识别的配体。特别是近十几年来，发现某些 HSP 具有分子伴侣的作用后，使 HSP 的研究工作产生了一次飞跃，因而成为目前生命科学的热点课题，HSP 广泛分布于生物界，在动物、植物、微生物及人类中普遍发现了 HSP，其功能也是多种多样的。二、 HSP 的分类(一) HSP 分类的依据 HSP 按其同
6、源程度及分子量大小可分为：HSP110 家族，HSP90家族，HSP70 家族，HSP60 家族、小分子 HSP 家族及泛素(ubiquitin,Ub,是广泛分布于细胞浆及细胞核中的小分子蛋白，有结合 DNA 的功能)家族。分族的方法是先将放射性核素标记的各种必要氨基酸加于拟检测的细胞群中进行温育，加热或应激处理，然后作 SDS-PAGE 凝胶电泳分离，以放射自显影进行检测鉴定，根据生成的蛋白质的分子量，以千道尔顿(kD)单位对 HSP 命名，如 HSP60，即此种 HSP 的相对分子量为 60kD。由于不同细胞产生的各族HSP 及其成员间常有 40%70%以上的序列同源或类似，故必要时需做
7、Western blot 进一步鉴定。(二) HSP 家族及其成员 应用上述的方法，可以将 HSP 分为不同的家族及成员，具体见表1131 。表 1131HSP 的家族、成员及其主要功能HJ*8家族主要成员主要生理功能主要免疫功能HSP90HSP90HSP87HSP84HSP83 阻止类固醇受体结合至 DNA，酪氨酸激酶磷酸化肿瘤防护及自身免疫性HSP70gRP80 gRP78PBP72/74BiPHSP70HSC70 蛋白质折叠、去折叠、转运、多聚复合体装配 Ig 装配，MHC 类抗原处理，多种病原体抗原，自身免疫性HSP60HSP65HSP60HSP58GroEL 蛋白质折叠、去折叠、多聚
8、复合体装配多种病原体抗原，自身免疫性小 HSPHSC35HSP28HSP27HSP25HSP22Ub蛋白质降解 MHC 类抗原处理 淋巴细胞归巢，自身免疫性HJ*2注：PBP72/74 是由 HSP70 派生的肽结合蛋白(peptide binding protein)；BiP(binding protein)是结合蛋白，主要结合 Ig 重链进行装配； HSC(heat shock potein cognat)，指组成型的 HSP70；GroEL 相关蛋白是 Q 热、梅毒、结核、麻风等许多微生物感染的主要抗原。HJ同一家族的成员，除分子大小相似外，还具有一些共同特征。不同种属生物有相似的HSP
9、 家族。在系统发育中，某一特定家族的氨基酸顺序与功能极为保守。同源性上可达 50%以上。例如分枝杆菌的 HSP65 的 296420 位氨基酸残基与大肠杆菌的 HSP65 有 65%的序列同源，用单抗检测也有明显的交叉性反应，表明两者抗原性相似，而且它们与正常人和动物细胞内的自身抗原也有模拟的类似性。三、 HSP 的特性(一) 结构的保守性 HSP 是由核基因编码的保守蛋白质，是生物界进化最保守的成分，已知人的真核细胞与细菌等原核细胞甚至非细胞型的病原体之间，在生物种系进化史上至少相距约 15 亿年，但是它们迄今受热休克或应激产生的 HSP 或 SP 都有显著的同源性(hamology)，即相
10、差极大的不同种生物细胞产生的这类蛋白，分子序列绝大部分都相同或类似，绝少有进化演变的遗传变异。例如由各种分枝杆菌产生的 HSP65 与由人细胞、寄生虫及其他细菌产生的 HSP65，用 Western blot 检测有 50%以上的氨基酸序列同源，用 McAb检测有明显交叉反应，表明它们之间有相同的抗原性，表明 HSP 的本质是进化最保守的蛋白质。(二) 诱生因素的多样性 除热度外，凡能引起细胞或机体应激反应的有害因素都会诱生 HSP(或 SP)，这些诱生因素包括：氧化剂(H 2O2、O -2、氧自由基)，重金属(铅、砷、汞、钙等)，乙醇，氨基酸类似物，DNA 损伤，缺氧，病毒，细菌，寄生虫等病
11、原感染及炎症或吞噬细胞消毁病原性异物发生呼吸爆发放出 O-2及 H2O2等，皆会伤害细胞，致使细胞内蛋白质构型改变及功能消退，一方面抑制蛋白质的合成，同时启动 HSP 基因，产生热应激反应(heat stress response)，合成 HSP。(三) 可产生表达型与组成型 HSP 是一个多基因家族，除热应激诱导表达型外，还有组成型，即在常温状态时就能表达，其结构与功能和表达型基本相同。(四) 广泛参与机体的保护功能 参与有关蛋白质新生肽的折叠、亚基组装、细胞内跨膜运输、蛋白质降解及 DNA 和核损伤的修复等。(五) 自我调节功能 可以调节自身转录，翻译。其转录首先需要活化热激转录因子(HS
12、TF)，再与热激转录元件(HSE)相结合并磷酸化，然后开始转录，HSTF 与 HSE 的结合受HSP 的调节。例如，当细胞内 HSP70 升高时，即以阻遏蛋白的形式结合于 HSTF，使它不能与 HSE 结合，而限制了 HSP70 的继续表达；反之，当 HSP70 浓度下降到一定限度以下，不足以阻断 HSTF 与 HSE 结合，编码 HSP70 基因又开始重新转录继续合成 HSP70。四、 HSP 的生理功能(一) 细胞内分子伴侣功能 HSP 是祖先细胞遗留下来的保守的伴随细胞的一类相关蛋白，通过与具有不同功能的多种蛋白在细胞中形成复合体而参与有关蛋白质的折叠、转运和装配，将此种作用称为分子伴侣
13、(molecular chaperon)，又称分子伴娘或伴随分子。即HSP 不直接发挥生物学作用，而是通过改变和修饰其他蛋白，影响和调节其他蛋白质的功能，发挥间接的生物学作用。具有此功能的是 HSP 家族中的 HSP60、HSP70 和 HSP90 三个主要家族。 在生理状态下 HSP70 和 HSP60 主要参与蛋白质折叠、解折叠和组配，从而影响蛋白质的正常装配过程。二者多以解折叠形式存在于细胞浆和内质网，参与蛋白质转运到内质网(ER)和线粒体，影响和调节其它蛋白质的功能。HSP70 可转运蛋白到线粒体膜，并参与蛋白解折叠和插入膜内，通过改变和修饰新合成的多肽，防止不正确折叠。在线粒体内 H
14、SP60 结合蛋白参与蛋白的再折叠，并在以后装配成单体复合体。属于 HSP70 家族的 Ig 重链结合蛋白(BiP)能在内质网内与 Ig 重链结合，结合的时间是正当 Ig 重链与 Ig 轻链连接之际，这样就可防止在无 Ig 轻链存在的情况下，重链过早地自行装配。在缺少轻链的情况下，BiP 持续地与重链相结合并保留于内质网腔内，重链不再进一步装配成为完整的 Ig 分子。HSP90 能以 ATP 依赖方式抑制解折叠蛋白的聚集作用，在体外促进解折叠多肽的重新折叠。哺乳动物 HSP90 多以蛋白组配的形式与其它蛋白形成合成物。如钙调蛋白 R、蛋白激酶、类固醇 R 等均系非受体酪氨酸激酶，所以 HSP9
15、0 又被称为大众伴娘，是影响基质蛋白成熟的关键因子。图 1131HSP 在正常和应激细胞中的生理功能注：HSP 防止类固体在未与类固醇结合以前与核中 DNA 结合；HSP 使胞浆中蛋白质折叠，并转运至线粒体或内质网(ER)；蛋白折叠和(或)单体蛋白复合体装配；HSP 使去折叠蛋白降解；HSP 干扰应激(加热)所引起的蛋白去折叠(二) 细胞内家务管理功能 HSP 的家务管理功能(house keeping function)是指细胞(宿主细胞或病原体细胞)受到热休克(一般哺乳动物超过体温 23，各种病原体由 25转入 37的人或动物体)或应激反应伤害，致使细胞某些蛋白肽链伸展，失去螺旋结构和折叠
16、状态，改变了分子空间构型，甚至寡聚复合物解聚的时候，HSP60 或 HSP70 的诱生却能使蛋白肽链重新折叠，恢复螺旋构象，使之重聚，并将此蛋白分子移位至线粒体、内质网(ER)或叶绿体内，以维护细胞生存功能，这种作用称为家务管理功能。如果不能形成肽链的重新折叠，HSP 亦可加速降解蛋白的去除，因为如果细胞内留有降解蛋白，热将导致正反馈环路作用，而诱发 HSP 的合成。(三) 细胞内看守自卫功能 HSP90 系类固醇(甾体激素)受体(steroid receptor)的结合蛋白，参与甾体激素与受体的相互作用，主要参与蛋白转位和受体调节。当细胞受上述伤害生成 HSP90 时，与类固醇受体结合，使该
17、受体在与激素结合前处于失活状态，避免受体在结合相应激素前单独与细胞核 DNA 相结合。如果无 HSP90 存在，类固醇受体就比较容易与 DNA 结合，从而使甾体激素不能有效地与相应受体结合，而发挥正常功能，防止甾体激素与 DNA 之间发生过早的无意义的相互作用。HSP90 家族与其结合物还可激活蛋白激酶C 及蛋白酶活性，ATP 水解生成过氧化物岐化酶 E(SOD)等，能使细胞耐热，抗理化因素及反应性过氧化物伤害，以维护细胞自身的生物活性。除 HSP90 外，小分子 HSP 家族也具有细胞看守自卫功能，HSP27 主要参与微丝的稳定和细胞因子信号传导，能阴止应激状态下肌动蛋白和微丝的分裂，有利于
18、细胞骨架的稳定，它不仅对单个细胞产生应激耐受，而且通过内皮和上皮的屏障作用，对整个有机体起到必要的保护作用。Robaye 等(1989 年)发现 HSP28 的快速磷酸化对细胞产生立即的保护作用，并能维持很长时间。Aufricht 等(1998 年)证明，HSP25 和 HSP27 在肌动蛋白动力学的调节中起主要作用，其中 HSP25 对缺血后肌动蛋白细胞骨架的重组具有益处。(四) 协同淋巴细胞归巢功能 HSP 能协调导航淋巴细胞在机体内循环，小分子 HSP 家族中的泛素和 HSP90 中带有两个氨基酸分枝结构也相当于泛素，由这些小 HSP 分子组成淋巴细胞导航(归巢)受体(lymphocyt
19、e homing receptor)粘附淋巴细胞膜上，随淋巴细胞到达后高位内皮小静脉(HEV)管腔内，由该受体识别该处血管壁高位内皮细胞(HEV)，通过胞饮穿出血管外进入组织间隙淋巴管中以后，再由淋巴管返回血循环，不断循环，也可因之定位于周围淋巴器官的特定场所，即所谓归巢(homing)。HSP 的生理功能见图1131 。五、 HSP 在免疫应答中的作用细胞表面的抗原受体，如 Ig、SmIg、MHC-类分子、MHC-类分子、TCR/CD3 复合受体等是发生免疫应答的物质基础，HSP 参与抗原受体肽链的折叠，促进正确装配，阻止无功能中间体聚集，促使错误折叠的抗原受体的降解，HSP 通过此种方式保
20、证免疫应答的正常进行。(一) HSP 在外源性抗原加工递呈和 Th 细胞激发中的作用 HSP 能辅助抗原递呈细胞(M、树突状细胞、B 细胞等)处理和递呈抗原至 T 细胞。当抗原递呈细胞摄入抗原并进入细胞质内后，诱生伴随细胞中的 HSP70 族，并由此族 HSP 衍生出新的 HSP 家族成员，称为肽结合蛋白 72/74(PBP72/74)。这种蛋白质在抗原处理和递呈过程中起辅助作用，即由PBP72/74 与抗原和 ATP 结合，在胞质内蛋白酶的作用下，抗原裂解成为肽段，再由PBP72/74 将抗原肽段与细胞上的 MHC-类分子结合成为抗原肽-MHC 复合体，进而与 Th 细胞上的 TCR-CD3
21、 复合体结合，完成细胞递呈和抗原识别过程，诱发免疫应答。图 1132PBP72/74 在抗原加工和递呈中的作用PBP72/74 可以从抗原递呈细胞中分离出，在血清学与伴随分子/HSP70 家族蛋白极为相关，它们对多肽的结合和与 ATP 结合的活性相同，PBPB72/74 与 ATP 结合后能释放肽类。氨基酸的氨基末端测序研究结果表明，PBP72/74 属于 HSP70 家族成员之一，其分子结构中含有 ATP 结合功能区序列 GIDLG，可在所有的 HSP70 家族成员中发现，GIDLG 序列以外则在HSP70 家族成员中各不相同。PBP72/74 在抗原递呈细胞如 M 和 B 细胞上表达，但其
22、表达并不依赖于 MHC-类分子的表达。免疫电镜和流式细胞仪的研究资料表明，PBP72/74 定位于细胞膜、内质网腔和内质网。对 PBP72/74 特异的抗体能抑制 PBP72/74 的抗原处理和递呈作用，这个发现就构成了 PBP72/74 与抗原处理和递呈有关的间接证据。PBP72/74 对促使抗原肽和 MHC-类分子的结合，以输送已被处理的多肽至含有 MHC-类分子的部位，便于两者的结合均起到一定作用，很有可能在这个过程中，MHC-类分子与伴随分子 HSP72/74 结合，促使 MHC-类分子折叠，以能与已被处理的抗原相结合。此外，已被处理的多肽有必要将其由溶酶体中输送至含有 MHC-类分子
23、的场所，HSP 在输送此种抗原至细胞膜的过程中也起到了主要作用( 图 1132) 。(二) HSP 在内源性抗原加工递呈和 CTL 激发中的作用1. HSP 在内源性抗原加工递呈中的作用 HSP 在内源性抗原加工中作用的发现是长期肿瘤免疫研究的结果。Srivastava 等研究肿瘤细胞的抗原特异性时，用生化方法分离肿瘤细胞的蛋白溶解物，再分别研究各组保护小鼠抗活的肿瘤细胞攻击的能力时发现：注射HSP 提取物能使小鼠对该肿瘤细胞产生耐受，而对抗原性不同的肿瘤细胞则不产生耐受，而且来源于正常组织的 HSP 提取物也无保护作用，于是有人认为 HSP 具有免疫原性。但是，后来研究发现：从正常组织和抗原
24、性不同的肿瘤中获得的 HSP，通过 cDNA 序列比较，两者并无差异。野生型 HSP(HSP90，gP96)和肿瘤的 HSP(HSP90，gP96)序列相同，而且 HSP 也不表现遗传多态性，提示 HSP 本身并不具有免疫原性，可能是作为抗原肽的载体，真正具有免疫原性的应是 HSP 所携带的抗原肽。这一现象在病毒感染中也得到证实。目前已证实参与诱导肿瘤和病毒特异性免疫的 HSP 有 HSP70、HSP90 和 gP96。HSP70和 HSP90 主要存在于胞质溶胶中，而 gP96 主要位于内质网(ER)腔中。很多资料显示，HSP70 和 HSP90 在胞质溶胶中结合经多种蛋白酶(如 LMP)酶
25、解后的抗原片段，gP96 是 ER 腔中肽分子结合受体，促进 MHC-类分子与肽分子的结合。HSP 的作用不受限于肿瘤抗原和病毒抗原的差异。以 gP96 肽复合体激发肿瘤免疫反应，在免疫应答的激发(致敏)期和效应期去除 CD4+或 CD8+ T 细胞或 M，来研究参与此过程的细胞类型，结果发现，gP96-肽分子复合体免疫小鼠可激发 CD8+ T 细胞反应，M 在此过程中是必需的，而 CD4+ T 细胞反应不是必需的。该研究也提示 HSP 作为肽分子的载体参与 MHC-类分子介导的抗原加工途径。Srivastava 等推测 HSP 参与 MHC-类分子介导的内源性抗原加工过程是：抗原在胞质溶胶中
26、经低分子量多肽(LMP)等多种蛋白酶水解后，抗原片段经 HSP70 和 HSP90 以 ATP 依赖方式结合并转运至 ER 膜上的与抗原相关的转运蛋白(transporter associated with antigen processing, TAP)上，再经 TAP 转运到 ER 腔内，由 gP96 转运，最后与 MHC-类分子进行组装。在此过程中，肽分子经胞质溶胶及 ER 中的多种多肽酶依次进行修剪，直至适合 MHC-类分子肽结合槽，TAP 转运的肽分子长度是 912 个氨基酸(AA)，而 MHC-类分子结合肽分子的长度是 910 个氨基酸，那些通过 TAP 非依赖机制进入 ER 腔内
27、的抗原分子需要进行酶解和修剪，特别是一些胞膜蛋白，未经胞质溶胶中蛋白酶的处理，直接位于ER 腔内，也需要进行修剪。gP96 在肽修剪过程中的功能尚不甚清楚，但是 gP96 具有蛋白酶活性和 ATP 酶活性。有人推测，gP96 在 ER 腔内可能起着主动的修剪作用。他们认为一种可能是：gP96 结合前体肽分子后，先产生一个合适的羧基(C)端，以结合至 MHC-类分子的 C 端“口袋” ，再在 MHC-类分子上进行氨基(N)端修剪，产生适合 MHC 类分子结合的肽分子；另一种可能是：gP96 结合前体肽分子，通过 ER 腔内的酶对 N 端和 C 端进行修剪，gP96 具有保护肽分子免疫酶的破坏的作
28、用。按照以上推测，可以认为 gP96 结合肽分子并对其进行修剪的过程是内源性抗原加工的中间过程。HSP 在 MHC-类分子介导的抗原加工过程中的作用，已被越来越多的实验所证实，从而对 CTL 激发机制的研究起着推动作用。2. HSP 在 CTL 激发中的作用 在 CD4+ T 细胞的激活过程中，表达 MHC-类分子的职业抗原递呈细胞(professional APC)摄取和加工抗原，并以 MHC- 肽分子形式递呈给CD4+ T 细胞，从而激活 CD4+ T 细胞。这一过程中，需要职业 APC 参与，已成为共识。CD8+ T 细胞的激活，一直认为，表达 MHC-类分子形式递呈给 CD8+ T 细
29、胞，从而激活CD8+ T 细胞，并成为其靶细胞。CD8+ T 细胞的激活过程如果当真如此，则难以解释以下几个问题：(1) 即使病原体感染的细胞或突变的肿瘤细胞能递呈抗原，处女 CD8+ T 细胞在感染或肿瘤生长部位以外的地方难以遏制抗原，因为处女 T 细胞并不渗透到外围非淋巴组织，CD8+ T 细胞如何被激活？(2) 大多数有核细胞缺少 T 细胞激活所必须的共刺激分子，难以提供共刺激信号，又如何能直接激活 T 细胞？现在一致认为在 CD8+ T 细胞激活过程中也需要职业 APC 参与。诸多研究资料提示，在CD8+ T 细胞激活过程中，体内存在多种形式的职业递呈： 吞噬细胞可能存在一种不甚明了的
30、机制，将吞噬体中的蛋白质转至胞质溶胶中，进入 MHC-类分子介导的抗原加工途径；吞噬细胞可能通过消化溶酶体中的吞噬物，再将肽分子反吐到胞外，并结合到 MHC-类分子上；感染的细胞或肿瘤细胞溶解后，HSP-肽分子复合物释放出来，由吞噬细胞摄取，进入吞噬细胞的胞质溶胶中。在职业 APC 参与的 CD8+ T 细胞激活过程中，作为肽分子载体的 HSP 扮演着重要角色。感染的细胞或肿瘤细胞溶解后，HSP-肽分子复合体释放出来，结合到 M(此所谓职业 APC)上的某种受体(可能是 gP96 受体)，然后一起被转运到内体或相似的小室中，在此处，gP96进行降解，或通过其它 ATP 依赖的机制释放出肽分子，
31、而后肽分子进入 ER 腔，与 M 自己的 gP96 结合，再与 M 的 MHC-类分子结合，激活 CD8+ T 细胞。基于职业 APC 在 CTL 激发中的作用，研究发现肽分子冲击的职业 APC 可激发机体产生抗肿瘤的 CTL 反应，并有明显的抗肿瘤效果，并可能成为肿瘤免疫治疗的一种有效方法。HSP 作为分子伴娘，在 MHC-类分子介导的抗原加工和递呈过程中的作用已逐渐被认识，并对 CTL 的激活机制也有了新的认识，即正如前述的职业 APC 在激活中的重要作用，这方面的进展对肿瘤发生的认识和肿瘤治疗的研究开辟了新的思路。六、 HSP 与抗感染免疫(一) 感染对 HSP 基因表达的影响 在病原体
32、感染宿主后，宿主体内许多细胞的HSP(或 SP)表达增多。在原核生物界，可因噬菌体的感染而诱发。如大肠杆菌噬菌体 DNA的复制诱发大肠杆菌表达 HSP70 和 HSP20。Tang 等研究证明，调节伤寒沙门氏菌于 3045或 55，HSP58、HSP68 及 HSP88 表达显著增加。动物体内更是如此，Bahr 等报道链球菌可刺激宿主高表达 HSP70。通过 Western blot 发现感染伤寒沙门氏菌的患者血清中HSP58、HSP68 及 HSP88 高表达。类风湿关节炎(RA)患者的关节组织中大肠杆菌、分枝杆菌的 HSP60、HSP70 表达增加。真菌感染的患者血清中 HSP90 高表达
33、。牛痘病毒感染的鼠血清中，HSP72 表达增高。Oglesbee 等发现，狂犬病病毒感染能引起 HSP72 高表达。(二) HSP 对抗感染免疫的促进作用 HSP 不仅参与细胞正常的生长、发育和分化，而且当病原体侵入宿主时，病原体可生成 HSP；宿主细胞则通过改变基因表达方式，诱导 HSP的产生；此时，宿主细胞内其它基因表达受抑，故其它蛋白的合成减少，处于低反应状态，仅大量合成 HSP。虽然病原体与宿主细胞产生的 HSP 大多有共同的抗原决定簇，但它们有不同的作用，这些作用引起宿主细胞产生细胞免疫和体液免疫的正负反应。1. HSP 对非特异性抗感染免疫的促进作用病原体侵入宿主可引起 M 和淋巴
34、细胞释放细胞因子 IL-1、IL-2、IL-8、TNF 及 IFN 等，这些细胞因子能上调 HSP，激活 HSP 基因，促进 HSP 高表达，HSP 的高表达可抑制炎症细胞因子如 IL-1 等的转录，使之减少分泌，并降低循环中的含量。HSPs 的聚集对于 TNF- 的细胞毒效应提供细胞耐受，从而提高细胞对致死刺激的存活率。细胞内核因子-KB(NF-KB)的阻断可提高对 TNF- 的敏感性。在应激状态下，如暴露于放射线或 IL-1 等，可提高 HSP 的合成和激活前 NF-KB，使 TNF- 诱导的细胞凋亡被抑制，提示热耐受细胞可获得阻止开启细胞自杀途径的能力。因此，HSP 反应与调控内毒素耐受
35、细胞因子的产生和对细胞因子敏感性等方面有关，对宿主起到一定的非特异性保护作用。2. HSP 对特异性抗感染免疫的促进作用(1) 病原体 HSP 诱发体液介导免疫：HSP 可作为许多病原体的免疫优势抗原，诱发机体的抗体产生。在许多蠕虫、原虫和细菌感染中，HSP70 和 HSP60 家族常是诱发抗体产生的抗原。产生针对 HSP70 抗体的病原体，包括：恶性疟原虫、克氏锥虫，杜氏利什曼虫(黑热病)、硕大利什曼虫(皮肤利什曼病)、曼氏血吸虫、日本血吸虫(血吸虫病)、马来丝虫、盘旋尾丝虫、麻风杆菌、结核杆菌等。产生针对 HSP65 抗体的病原体包括：麻风杆菌、结核杆菌，贝纳立克次氏体、苍白密螺旋体(梅毒
36、)、嗜肺军团菌、布氏疏螺旋体、沙眼衣原体、铜绿色假单胞菌、大肠杆菌和其它革兰氏阴性菌等。(2) 病原体 HSP 诱发细胞介导免疫：结核病人及用结核杆菌免疫的小鼠体内均可检出对 HSP65 特异的 T 细胞存在。约有 10%20%能对结核杆菌起反应的 T 细胞为 HSP 特异性 T细胞，但是，HSP 特异性 T 细胞亦可见于正常健康个体之中，表明针对 HSP 产生的细胞免疫应答是针对与其它各种微生物所共有的抗原表位，而并非为结核杆菌所独有。HSP 特异性 T 细胞以及 HSP 特异性抗体均不能作为感染的指标，但可作为感染早期抵抗力的表现。各种微生物 HSP 间的交叉免疫力似可填补天然免疫力和对不
37、同病原体的特异性免疫应答之间的空白。用多种微生物的 HSP 反复多次刺激有可能诱发稳定的高水平免疫力。通过对纯化重组分枝杆菌 HSP65 及其合成片段的研究，发现了许多能被 T 细胞或 B 细胞识别的抗原表位。T 细胞决定簇包括种属特异和进化上保守的氨基酸序列。已发现用结核杆菌足垫免疫小鼠，能使引流淋巴结内 +T 细胞数目显著增加，给小鼠肺部喷射含有PPD 的气雾剂也能产生同样的效果。分枝杆菌 HSP65 与人的 HSP 及大肠杆菌 HSP 在氨基酸序列上有 50%的同源性，用大肠杆菌 GroEL 的 HSP 检测，发现多种 HSP65 反应性 +杂交瘤 T 细胞对这种抗原产生免疫应答，在新生
38、小鼠胸腺中有相当比例的 +T 细胞能识别进化上保守的 HSP 抗原。 T 细胞也能识别 HSP 和其它由自身 MHC 分子所递呈的小肽段分子。+T 细胞和T 细胞在 TCR 的结构上极为相似，故可以认为 +T 细胞识别 HSP 的方式与(相似。此外，分枝杆菌 HSP65 特异性 +T 细胞是由已变性或部分降解的 PPD 的刺激而产生的，较之天然抗原它们更易识别已被处理过的肽类。用与麻风杆菌 HSP65 的不同部分相应小段合成肽刺激 杂交瘤细胞，发现能为 T 细胞所识别的线性抗原表位。这样 T 细胞似乎也能识别相应的 groEL 相关 HSP。另外也发现 PPD/HSP65 反应性小鼠的 T 细
39、胞勿需多态性的自身 MHC 分子参与抗原递呈过程，对非多态性 Ib 分子(CD1、TL 和 Qa)特异的T 细胞远比能识别多态性 MHC-类分子的细胞常见。(3) HSP 对抗感染免疫的其它促进作用：病原体与宿主产生的 HSP 氨基酸序列同源性虽高于 50%，但抗原性并不完全相同，当 APC 只将病原体抗原递呈给抗原特异性 T 细胞时，会引起特异性抗感染免疫，而不会与宿主细胞的 HSP 发生反应；在细菌 HSP 中，HSP60、HSP70 和 HSP90 家族成员进化上最保守，不具有遗传多态性，这说明其与哺乳动物体对应物有高度序列同源性；同时发现它又是免疫原性蛋白，能与病原体连接成为免疫显性(
40、优势)抗原，产生抗体和/或细胞毒 T 细胞(CTL)，导致宿主对该病原体产生抗感染免疫，Bloemenda 等发现，大肠杆菌的提取物 OM-89 可引起 RA 患者体内 T 细胞对大肠杆菌和分枝杆菌的 HSP60 和 HSP70 产生激活并增高，具有抑制关节炎的作用；真菌在宿主体内产生的 HSP90，即为免疫显性抗原，可刺激人类产生抗真菌感染的相应抗体；念珠菌感染时，其 HSP90 诱生的细胞免疫仅有抗念珠菌感染的效果。由上述可见，HSP 普遍存在于所有细胞内，在各种有害因子刺激作用下，细胞通过改变基因表达方式，诱导 HSP 的产生，从而起动内源性保护机制。HSP 能引起自身免疫反应，而在感染
41、引起的免疫性疾病的发生发展中，HSP 具有防止感染应激引起的细胞损害和促进受损细胞恢复等重要作用。(三) HSP 引起的免疫病理作用 病原体与宿主 HSP 有广泛的序列同源性，二者可具有共同抗原，使病原体逃避宿主细胞的特异识别，从而得以生存和繁殖，对宿主造成伤害，并引起自身免疫病。1. HSP 诱导的致敏 T 细胞及抗体，在识别外来抗原时，同时识别自身成分，引起自身免疫反应。如细菌 HSP 与宿主体内组织的类似蛋白间发生交叉反应，可导致 RA 和系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫病。实验发现在 RA 关节滑液中，HSP60 的 IgA 和 IgG 抗体明显低于血清中该种抗体，此为分枝杆菌 HS
42、P60 的抗体，此抗体作为自身抗体与自身组织 HSP60结合造成局部抗体水平下降，是造成 RA 患者关节损伤免疫病理的关键。SLE 患者血清中发现 HSP90 IgG 型自身抗体与其发病有关。2. HSP 与病原体抗原和 MHC 分子结合成为免疫显性抗原，使宿主体内免疫动态平衡发生紊乱，引起自身免疫反应。3. HSP 引起细胞网络调控异常。病原体与宿主受剌激产生的 HSP 相同或类似，它与MHC-类或 MHC-类分子结合成为免疫显性自身抗原，递呈给自身反应性 T 细胞引起自身免疫反应。七、 HSP 与肿瘤免疫(一) HSP 参与肿瘤免疫的发现 早在 20 世纪 4060 年代，Gross 等已
43、发现用灭活的自体肿瘤细胞或灭活的近交系异体肿瘤细胞免疫大鼠，可诱导大鼠产生对同一肿瘤的移植排斥，且这种排斥作用仅对该肿瘤而不对其它肿瘤，具有很强的特异性，从而使人们推测在肿瘤细胞中存在肿瘤特异抗原，并试图将其提取出来，一些学者发现，某些从肿瘤组织提取的具有肿瘤特异免疫诱导作用的抗原与 HSP 有关，而 HSP 是已知在生物进化中高度保留的蛋白质，作为多变的肿瘤抗原的可能性较小。进一步研究发现，这些 HSP 是结合了多肽的 HSP，是 HSP-肽复合物，它们诱导免疫的特异性由其结合的多肽的特异性所决定，可见HSP 是作为一种肿瘤相关抗原诱导宿主的抗肿瘤免疫的。(二) HSP-肽复合物诱导肿瘤特异
44、免疫的作用 有关 HSP 参与肿瘤特异免疫的研究以Srivastava 等对 MCA 诱导的 BALB/c 小鼠肉瘤 MethA、CMS 5和 CMS13 中的 HSP70、HSP90 和gp96 的特异免疫诱导作用研究为代表。Srivastava 等分别从 MethA，CMS 5和 CMS13中提取HSP70、HSP90 及 gp96，用其分别免疫 BALB/c 小鼠，被免疫鼠产生了抗相应 HSP 来源细胞株之活细胞移植的能力，对照组正常组织来源的 HSP 不能诱导机体产生这种抗肿瘤移植能力。HSP 诱导的免疫具有很强的特异性。MethA 中的 gp96 诱导小鼠产生抗 McthA 的移植而
45、不抗 CMS5的移植，反之亦然。但 Palladino 发现 McthA 和 CMS13中的 gp96 诱导的免疫具有部分交叉反应，认为二者含有交叉抗原。肿瘤中的 HSP 可诱导肿瘤特异免疫首先使人们推测是编码 HSP 的基因发生突变，编码异常的 HSP 从而诱导肿瘤特异免疫。Srivastava 等比较 BALB/c 小鼠脾脏、肝脏及MethA、CMS5 肉瘤中 gp96 的 cDNA 序列，未见多态性；Moore 比较正常组织和肿瘤组织的HSP90 cDNA，也未见差异。从而否定了 HSP 基因突变导致肿瘤特异免疫的推测。那么，HSP 是否作为一种载体，结合肿瘤特异 Ag，进而诱导肿瘤特异
46、性免疫？Srivastava 取大约 3mg 纯化的来源于肿瘤组织的 gp96，用酸洗法(pH 值 2)从 gp96 分子上洗得一些多肽。这些多肽分子量在 4002 000 道尔顿之间，其中一个肽的序列测定表明，与 HSP 不同源。对 MethA 中的 HSP70 的研究，也得到类似结果。用酸洗后的“纯”HSP 免疫动物不能诱导机体抗肿瘤移植。此外，Blachere 从流感病毒感染细胞系中提出 gp96，洗脱其所结合的多肽，用这些多肽与流感病毒未感染的同一细胞系孵育，孵育后的细胞获得了对流感病毒感染细胞特异的 CTL 的敏感性。这些研究表明，HSP 除了“分子伴侣”作用外，可能还具有“伴侣抗原
47、肽”(chaperon antigenic peptides)的作用，从肿瘤提取的 HSP 事实上是结合了不同抗原肽的 HSP，是多种 HSP-肽复合物。(三) HSP-肽复合物诱导特异 CTL 中的作用 CTL 在肿瘤免疫中起重要作用。如何活化CTL 是近年来肿瘤免疫研究的热点之一。一般进入机体的外源性抗原主要诱导 MHC-类抗原限制的 CD4+ T 细胞反应，而体细胞内源性抗原可与 MHC-类抗原结合，通过高尔基器等结构而递呈到细胞表面，被相应 CD8+ T 细胞克隆所识别，并将其活化。HSP-肽复合物与一般外源性抗原不同，可诱导机体产生对其来源细胞具有杀伤活性的 CD8+ T 细胞(CT
48、L)，对肿瘤免疫具有重要意义。为探讨 HSP 的作用，Altmeyer A 等对 gp96 进行结构分析，发现它的 N-末端是信号肽，C-末端是一个 DKEL 序列。用免疫定位分析方法发现 gp96 分子可以在细胞表面表达，它不是膜蛋白的固有成分，gp96 与其它 HSP 可能被锚定在细胞表面，构成大分子复合物的一部分，协助复合物转运到细胞表面。实验证明 HSP 在 MHC-类分子限制的 T 细胞抗原递呈中介导了抗原肽的转运过程。Srivastava 用 MethA 中的 gp96 免疫 BALB/c 小鼠诱导了 CD8+ T 细胞反应，在免疫致敏阶段封闭体内 CD8+ T 细胞或 M，以及在
49、效应阶段封闭体内 CD8+ T 细胞、M 或 CD4+ T 细胞，均可使小鼠不产生对 MethA 移植的排斥，提示 gp96 诱导的免疫起主要作用的是CD8+ T 细胞，M 在诱导过程中亦不可缺少，可能起将 gp96 中的抗原肽递呈给 CD8+ T 细胞的作用。Udono 用 6138 肉瘤中的 gp96 免疫 C3HHen 小鼠，该小鼠产生了对 6138 肉瘤细胞有细胞毒作用的 T 细胞，这种细胞毒作用受 MHC-类抗原限制，提示为 CD8+的 CTL，而用这种 CTL 与 6139 肉瘤细胞(具有抗原特异性)作混和培养，未出现 MHC-类抗原限制的细胞毒作用，表明这种 CTL 具有肿瘤特异性。gp96 这种“伴移抗原肽”作用除对肿瘤外，对其它抗原也有作用，可能具有普遍意义，
