GBS核酸检测,GBS概述,GBS概述,B族链球菌(Group B Streptococcus,GBS)
学名无乳链球菌，革兰氏阳性链球菌，正常寄
居于阴道和直肠，属于条件致病菌。,在20世纪70年代，GBS已被证实为围产期母婴感染的主要致病菌之一，在围产医学中占有不可忽视的地位。,什么是围产期……,国外研究表明 ，不同地区、不同种族的妊娠晚期妇女GBS带菌率约为6.5％～36.0％，国内报道的妊娠妇女GBS带菌率为3.5%～32.4％，新生儿体表带菌率与母体带菌率相似。在一些特殊人群，如肥胖、糖耐量异常、多次妊娠以及性生活活跃的妇女中带菌率较高。,人群GBS带菌率,是指怀孕28 周到产后一周这一分娩前后的重要时期
围产期保健是指产前、产时和产后的一段时间内，对母亲、胎儿和新生儿进行一系列的保健工作，使母亲健康和胎儿、新生儿的成长发育得到很好的保护。,GBS对孕妇的影响,GBS感染是胎膜早破的重要发病因素
GBS对绒毛膜有较强吸附能力和穿透能力，接种2小时内即可吸附于母体组织，继而侵入绒毛膜，通过炎症细胞的吞噬作用及细菌产生的蛋白水解酶的直接侵袭，使胎膜局部张力减低，从而导致胎膜早破 。
GBS生殖道感染是导致早产的重要因素
GBS引起泌尿生殖道感染时，会引起磷脂酶A2和前列腺素及细胞因子的释放，刺激子宫收缩导致早产。
GBS是造成产褥感染的主要致病菌之一
产褥感染是指分娩时及产褥期生殖道受病原体感染，引起局部和全身的炎性应化。产褥感染发病率为1%～7.2%，是产妇死亡的原因之一 。,GBS对新生儿的影响,GBS感染是新生儿感染的主要原因
早发型感染
多见于出生后1周内。
母婴垂直传播是其主要传播途径。
主要临床表现为败血症（80%）、肺炎（7%）、脑膜炎（6%）；若治疗不及时，可引发远期后遗症，如智力发育迟缓、视觉听觉丧失等。,晚发型感染
多发生于出生1周后。
主要为水平传播：可能与院内感染或家庭接触有关。
常呈隐匿性发病，其特征表现为脑膜炎；1/3的晚发型疾病出现脑膜炎，故这些生存下来的新生儿中更易发生神经系统后遗症。,GBS的传播与感染,国内外GBS筛查现状,美国疾病控制中心(CDC) 制定了《围产期GBS预防指南》,该指南已经获得以下认可：
美国妇产科学院
美国儿科学会
美国护士助产士协会
美国家庭医生协会
美国微生物学会
美国流行病学会
美国药理学会,在我国，2011年，中华医学会妇产科学分会产科学组在《孕前和孕期保健指南(第1版)》中已将B族链球菌筛查作为一个备查项目。,《围产期GBS预防指南》指出,对所有孕妇于妊娠35～37 周进行GBS筛查，结果阳性者进行预防性治疗
以下情况应进行预防性治疗 ：
本次妊娠有GBS 菌尿
上次新生儿GBS 感染史
在妊娠37 周之前分娩
破膜时间超过18小时
分娩体温超过38.0度,GBS的筛查与预防,预防GBS疾病的抗生素使用方案举例:,《围产期GBS预防指南》指出：
GBS阳性患者应用抗生素进行预防性治疗
Boyer在1989年研究中指出，产时氨苄青霉素使用超过1小时就可以使得新生儿感染从28%减少到4%。LIN在2001年的研究中表明，与无产时应用抗生素相比，抗生素预防超过2小时的有效率是89%，不足2小时的有效率为71%。,挑战：我妈妈会进行IAP治疗吗？,《围产期GBS预防指南》,GBS检测方法比较,PCR介绍,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大扩增特定的DNA片段；可看作生物体外的特殊DNA复制。,什么是PCR……,PCR原理,PCR一般由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 。
②退火 ：（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
③延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端→5′端延伸，合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍;2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,PCR原理,PCR反应体系,PCR反应体系中的主要试剂有：,PCR扩增仪,PCR温度循环至关重要，PCR扩增仪各参数必须准确。
现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售PCR扩增仪。
国外厂家：Bio-Rad，ABI, Roche ……
国内厂家：杭州朗基 ，杭州博日……,PCR反应特点,特异性强：引物与模板DNA特异正确结合 ，碱基配对原则 ，Taq DNA聚合酶忠实性扩增
灵敏度高 ：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=10-6）水平
简便快速：一般在1～4 小时完成扩增反应
模板纯度要求低 ：不需要分离病毒/细菌/培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板,1. 每扩增一条DNA链，就切断一个探针
2. 每切断一个探针，就产生一个单位荧光信号
3. 荧光信号强度与结合探针的DNA分子数成正比,实时荧光PCR技术：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对模板进行分析的方法。,GBS核酸检测产品,荧光PCR检测B族链球菌（GBS）,,B族链球菌(GBS)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法),Taqman 探针实时PCR技术
选择B族链球菌基因组特异且无高频SNP位点的序列区域cAMP因子，设计特异性引物和探针
内参照系统排除PCR反应过程中可能的假阴性结果
UNG酶避免扩增污染物造成的假阳性
适用仪器：Roche LightCycler 480，ABI 7500，Bioer Line-Gene K等多色荧光PCR仪,产品特点,规格：20人份/盒
有效期：－18 ℃以下避光保存6个月
试剂：DNA提取液、GBS PCR反应液、GBS阳性对照品，空白对照品
标本类型：生殖道/直肠等部位带上皮细胞的分泌物标本,试剂盒介绍,溶血样本、保妇康栓、皮炎平对检测结果有显著影响，应尽量避免这些样本的检测。
其他常见干扰物质（粘液和脓液）以及常用药物（青霉素G、阿奇霉素、强力霉素及氧氟沙星、聚甲酚磺醛溶液、洁尔阴洗液、黄硝呋太尔制霉素阴道软胶囊、肛泰软膏、开塞露）均无明显影响。,待测样本在2-8℃保存不应超过24小时；-18℃以下保存不超过4天。,标本要求,标本保存,检测流程（ ＜ 2 h ）,DNA提取,1mL标本,沉淀+1mL生理盐水,沉淀+ 50μL DNA提取液,99-100 ℃加热10min,取上清至1.5mL离心管中保存,,,,,13,000 rpm
10 min,13,000 rpm
5 min,13,000 rpm
10 min,标本，GBS阳性对照品，空白对照品均需要提取DNA。,PCR体系配制 40 μL 体系：35 μL PCR反应液 + 5 μL DNA模板,PCR扩增
程序： 50℃ 2min 95℃ 5min,,,（ 95℃ 15s,60℃ 35s ）,45 cycles,,实时监测PCR扩增过程,FAM 通道 HEX通道,FAM通道检测结果：分析样本，空白对照品： Ct值不显示；阳性对照品： Ct<30.00；
HEX通道检测结果： 分析内参照基因，Ct≤35.00,阴性：样品的FAM通道无Ct值显示, HEX通道Ct≤35.00
阳性： 样品的FAM通道 Ct≤38.00， HEX通道Ct≤35.00
备注：若样品的FAM通道 38.00
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