1、1羧基化碳纳米管负载羟基喜树碱的制备、表征及肠吸收特性研究邓亚利 1，林芳花 2，何秀华 1，周莉玲 3*（1 华南农业大学制药工程系，广东 广州 510642；2 惠州学院生命科学系，广东 惠州 516007；3 广州中医药大学，广东 广州 510405 ）摘要 目的: 研究羧基化多壁碳纳米管负载羟基喜树碱（HCPT）的制备工艺，以及负载物(HCPT-MWCNTs-COOH )的肠吸收特性。方法: 比较球磨法、超声法与振荡法的吸附量差异，选择最优负载法；负载物采用 FIR、紫外光谱进行表征后，采用 HPLC 法测定其含量；采用离体外翻肠囊模型研究负载物在不同肠段的吸收特性，采用 HPLC 法
2、测定样品浓度，计算吸收速率常数（Ka）。结果: 冷冻球磨法负载量最高，为 12.5 g mg-1；紫外、红外图谱变化表明碳纳米管负载了 HCPT。肠吸收试验结果表明 HCPT 浓度上升，肠吸收速率常数呈线性增加；高浓度在十二指肠、空肠、回肠、结肠的 Ka 分别为：150.9、92.7、148.9、183.0 ngcm -2h-1。在各个肠段的 Ka 均无显著性差异。结论：负载物中 HCPT 溶解性增加并保护了内酯环，提高了肠透过速率；在小肠中为被动扩散吸收。关键词 羧基化碳纳米管；羟基喜树碱；离体外翻肠囊模型；肠吸收 1中图分类号 R944.9 文献标识码 A 文章编号Carboxylated
3、 carbon nanotubes10-hydroxy camptothecin preparation, characterization and intestinal absorption in vitroDENG Ya-li1, LIN Fang-hua2, HE Xiu-hua1, ZHOU Li-ling3*(1 Dept. of Pharmaceutical Engineering， South China Agriculture University， Guangzhou 510642， China; 2 Dept. of Life Science, Huizhou Univer
4、sity, Huizhou 516007, China; 3 Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405,China)Abstract Objective: To study carboxylated multi-walled carbon nanotubes load HCPT preparation process and its intestine absorption characteristics. Method: To compare the adsorption capacity of oscillatio
5、n method, milling method and ultrasonic method, and choose the best one for HCPT-MWCNTs-COOH, then FIR, UV spectroscopy to the characterization, HPLC 稿件编号 基金项目 国家自然科学基金（30672669）作者简介 邓亚利（ 1970-） ，女，博士，副主任药师，主要从事药物新剂型及新技术研究。Tel：13580399281；E-mail: 。通讯作者 *周莉玲，女，教授，博士生导师。 E-mail：。2spectroscopy to its c
6、ontent . The isolated everted intestine model was used to study the absorption in different regions of rat intestine(duodenum，jejunum，ileum，colon). The samples were collected at different time and determined with HPLC. Result: Ball milling method with frozen for preparing HCPT-MWCNTs-COOH was the be
7、st one. Its FIR and UV spectroscopy were different with HCPT or MWCNTs-COOH and its content were 12.5 g mg-1. The intestine absorption rate constant (Ka) increased along with HCPT concentration. The Ka had no significant difference between different regions of intestines(duodenum，jejunum，ileum，colon
8、), 150.9，92.7，148.9 and 183.0 ngcm-2h-1 respectively. Conclusion The dissolubility and absorption of HCPT-MWCNTs-COOH are better than HCPT. And it shows passive diffusion process. Key Words: Carboxylated carbon nanotubes; HCPT; isolated everted intestine model; intestine absorption羟基喜树碱（HCPT）是从我国内地特
9、有植物喜树的皮、果实中提取得到生物碱类抗癌药物，对治疗多种恶性肿瘤具有显著疗效 1。HCPT 是一种黄色粉末或结晶性粉末，不溶于水，极微溶于甲醇和无水乙醇，易溶于稀碱溶液。国内常用剂型为 HCPT 钠盐，其代谢较快，半衰期短；钠盐注射液不稳定，见光易分解，使疗效下降、不良反应增加。剂型研究方向为增加溶解性，实现对肿瘤组织的靶向性和缓释性，如微球、纳米粒、缓释片、脂质体等。马氏等制备了羟基喜树碱的环糊精包合物，突破了传统增加溶解度会破坏活性内酯结构这一难题 2。本研究以羧基化碳纳米管为载体，负载 HCPT。碳纳米管中空的圆柱状管体结构，功能化修饰后具有小分子药物、蛋白和基因转运的潜能，使所载生物
10、大分子更容易跨越细胞膜进入细胞核，发挥治疗疾病的作用 3。作为一种新型的药物载体，目前比较普遍的载药方法是共价连接和物理吸附。共价连接是利用化学反应使药物连接在碳纳米管上，药物的化学结构发生变化，可能会降低药效甚至出现副作用。而物理吸附则是利用碳纳米管大的比表面积优势，先将用生物大分子或极性小分子修饰的碳纳米管分散于溶剂中，同时将载送药物用溶剂溶解后，两者以一定比例混合，放置数小时或数天，挥干溶剂即可。物理吸附可以保持药物原有的结构，药物进入人体后也可维持原有的药效，也不会因结构的改变出现不必要的副作用。因此，物理吸附被认为是较为理想的载药方式 4,5。本研究以羧基化碳纳米管为载体，采用物理吸
11、附的方法制备负载物，并对其进行体外肠吸收试验，以考察负载物吸收速率，预测负载物在体内吸收情况，为羧基化碳纳米管作3为新型给药载体材料提供借鉴 6,7。1 材 料1.1 药品与试剂HCPT 对照品（供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号：100526-200301） ；HCPT 原料（黄石黄抗药业有限公司提供） ；羧基化多壁碳纳米管（纯度大于 95%，CVD方法生产，购自深圳市纳米港有限公司)。甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。Krebs-Ringers 肠营养液配制：NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、NaH 2PO4 0.32 g、NaHCO 3 1.37 g、葡萄糖 1.4 g
12、（临用前加入）加水至 1 L。1.2 实验动物清洁级 Wister 大鼠，雄性 (25010) g，南方医科大学实验动物中心提供（合格证号SCXK（粤） 2006-0015）1.3 实验仪器及色谱分析系统美国 Waters 600-2998 型高效液相色谱仪（四元高压梯度泵、手动进样、柱温箱，2998PAD 检测器、 Empower Pro 工作站） ；电子天平（FA1004N，上海精密科学仪器有限公司） ；OM-ISP2 行星式球磨机（南京大学仪器厂） ；傅立叶变换红外光谱仪（Nicolet 6700，赛默飞世尔科技公司） ；紫外可见分光光度仪（UV2300，上海天美科学仪器有限公司） ；循
13、环水式真空泵（SHZ-D，巩义市英培予华仪器厂） ；恒温磁力搅拌器（ 85-2，常州奥华仪器有限公司） ；台式高速冷冻离心机（TL-18M，上海市离心机械研究所）Waters Xbridge C18 柱（4.6 mm250mm，5 m） ；流速：1 mLmin-1，柱温：25 ，检测波长：266 nm；进样量：20 L；流动相：甲醇 -水 (48:52) (V/V)；理论塔板数不少于 4000。2 方 法2.1 MWCNTs-COOH 对 HCPT 的吸附曲线分别采用振荡吸附法、超声吸附法、球磨吸附法，比较三种方法的饱和吸附量和吸附平衡时间，从而为选择载药方法提供依据。采用紫外分光光度计对各个
14、时间段的药液吸光度进行检测，利用标准曲线法计算各吸光度值。配制 32 gmL-1 的 HCPT 溶液（甲醇：二氯甲烷 1:1 溶剂） ，在 200 - 400 nm 波长范围内扫描以确定最大吸收波长。分别精密移取 10mL、8mL、6mL 、4mL、2mL 该溶液于 5个 10 mL 量瓶中，甲醇定容后，在最大吸收波长处测定吸光度，拟合浓度与吸光度的线性方程。4分别精密称取三份羧基化碳纳米管 50 mg，加入 208 gmL-1 HCPT 溶液（甲醇：二氯甲烷 1:1 溶剂） 30 mL 于具塞锥形瓶中，一份直接放入振荡器中振荡（温度为 25，振频为 116） ；一份超声 10 min 后放入
15、振荡器；一份放入球磨罐中球磨 10 min（液氮保护下590 rpmmin-1） ，球磨后倒入锥形瓶，再放入振荡器。三份样品分别在各个时间点抽取 2 mL 溶液，再补加 2 mL 混合溶剂。吸取的样品放入离心管中 12000 rpm 离心 10 min，精密吸取上清液 1 mL，稀释 10 倍后，测定吸光度，并计算药物在 t 时间点的药物浓度 Ct。按公式计算: Qt =V(C 0- Ct )/m。式中 Q t 是 t 时刻溶质被吸附剂吸附的量（ gg-1） ，C 0 和 C t 分别是初始和 t 时间点溶液中 HCPT 的浓度(g L-1)，V 是溶液体积( L), m 是用于吸附试验的 M
16、WCNTs-COOH 质量 ( g )。相平衡参数 K=Cs/Ce, Cs 是指单位质量的碳纳米管吸附HCPT 的量(mmolg -1)，Ce 是指平衡时单位体积溶液中 HCPT 的量(mmolmL -1)8。2.2 HCPT-MWCNTs-COOH 的制备、表征及含量测定精密称取 HCPT 4 mg 超声溶解于 10 mL 甲醇：二氯甲烷（ 1:1）混合溶剂中，备用。精密称取 50 mg 的 MWCNTs-COOH 置于球磨罐中，分 3 次加入药液，每次加入约 3 mL；液氮保护下 590 rpmmin-1 球磨 10 min。将球磨后的混合物收集于具塞棕色三角瓶中（避光操作） ，放入振荡器
17、中振荡 0.5 h（温度为室温，振频为 116） 。将未吸附的药液过滤掉；滤饼放入培养皿，将有机溶剂挥干后加入 10 mL 纯水，研磨 5 min 后置于离心管内离心1h（12000 rpmmin-1） 。将离心后的上清液进行冷冻干燥，即得负载物，进行红外表征、紫外表征。精密称取 10 mg 负载物混悬于 10 mL 甲醇：二氯甲烷（ 1:1）混合溶剂中，超声 10 min 后混悬液在 12000 转下离心 4 小时，取上清液过 0.22 m 微孔滤膜，采用上述色谱条件测定 HCPT 含量。2.3 建立肠吸收样品 HPLC 测定方法2.3.1 对照品溶液的制备及线性关系考察配制 36.0 gm
18、L-1 的 HCPT 溶液（甲醇：二氯甲烷 1:1 溶剂） ，作为储备溶液。精密吸取储备液 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 分别置于 10 mL 量瓶中（高浓度） ；精密吸取储备液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 分别置于 100mL 量瓶中（低浓度） ，加甲醇稀释至刻度，摇匀。高浓度、低浓度进样量分别为 5L 和 20L ，记录色谱图, 以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标, 进行线性回归，即得高浓度、低浓度线性方程 9。2.3.2 专属性、精密度、稳定性考察分别对 HCPT 对照品、空白肠营养液、肠透过后样品进样，观察在 HCPT 出峰处有无5干扰以考察专属性。将配
19、制好的对照品溶液（36 gmL -1）1 d 内重复进样 5 次，连续进样 5 d， 进样量 5L，记录峰面积用于日内、日间精密度计算。 取十二指肠于 20 min 时的肠外翻样品，于 0，1，2，6，8 h 分别进样，记录峰面积以考察稳定性。2.4 肠吸收试验2.4.1 供试品溶液的制备负载物溶液的制备：精密称取负载物 76.82、115.03 、300.36 mg，加入至 50 mL 量瓶中，用约 30 mL 的 37的 K-R 肠营养液分散后，定容得高、中、低三个浓度溶液（按HCPT 计，为 19.21、28.76、75.09 gmL -1） ，备用。2.4.2 离体肠囊模型的肠吸收试验
20、大鼠随机分为 6 组，每组 4 只，实验前 15 h 禁食，自由饮水，20 %乌拉坦腹腔麻醉（5 Lg-1） ，待大鼠失去知觉后打开腹腔，分别迅速取出约 10 cm 长的十二指肠、空肠、回肠、结肠（十二指肠段从幽门开始，空肠段离幽门 15 cm 处开始，回肠段自盲肠上行 20 cm 开始，结肠段从盲肠后端开始，长度以试验结束后的实测值为准） 。小心将大鼠肠管同肠系膜剥离，放入 37 K-R 溶液中，冲洗，直到没有内容物流出，小心剥离肠段表面肠系膜和脂肪，冲洗干净后翻转，用手术线分别将翻转后的各肠段结扎成 10 cm 长的小囊，十二指肠、空肠、结肠、回肠的囊内分别加入 0.5、1.5、0.8、2
21、.3 mL 的 K-R 肠营养液平衡。5min 后，将翻转小肠囊分别放入 4 个装有 8 m L 相同药物浓度的含药 K-R 肠营养液且维持 37 恒温水浴的玻璃试管中，并持续通氧及二氧化碳混合气体以保持离体肠活性。分别在 20、40、60、80、100、120 min 时间点，用针管分别吸取各个肠囊中内液 0.2 m L 置于 0.5 m L 的 Ep 管内作为样品；肠囊中补加等体积、新鲜且 37 恒温的 Krebs-Ringers 肠营养液（0.2 m L） ，继续试验。样品处理方法：离体肠外翻样品在 4条件下 13000 rmin-1，离心 20 min，取上清液，氮气吹干，加 60%甲
22、醇 0.2 mL 溶解，用 0.22 m 滤膜过滤，取续滤液 20 L 进样，记录峰面积。试验结束后吸取试管内药液，测定其浓度。被考察的肠段剪开，测量其长度（L）和内径（r） ，计算药物肠吸收速率常数（Ka ） 。2.4.3 数据处理按（式一）计算不同浓度下 AC 各个时间点的单位肠管面积累积吸收量 Q：6（式一）ACivnQ12.0式中，Cn：第 n 个取样点测得的药物浓度（ gmL-1） ；Ci：第 i（i=n-1 ）个取样点测得的药物浓度（gmL -1） ；A ：肠管面积；V 为肠囊中加入的肠营养液体积。以 Qn 对 t做曲线，并对曲线中的直线部分进行回归，求出直线斜率，计算药物肠吸收速
23、率常数（Ka） （g cm-2h-1） 。数据以 SPSS 13.0 对数据进行分析，各组间数据比较采用单因素方差分析，P0.05认为具有统计学意义。3 结 果3.1 MWCNTs-COOH 对 HCPT 的吸附曲线紫外扫描的最大吸收波长为 265 nm（见图 2） ，确定为检测波长。紫外分光光度法的线性方程 y=0.0235x+0.0131（r=0.9996） ，表明浓度在 6.4032.0 gmL -1 间吸光度与浓度线性关系良好。振荡法、超声法、球磨法三种处理方法的相平衡参数 K 分别为468.1、471.2、690.8。吸附曲线如图 1 所示，吸附量依次为球磨法超声法震荡法。图 1 三
24、种方法的吸附曲线图3.2 HCPT-MWCNTs-COOH 的表征及含量测定负载物的紫外波长扫描图（图 2）可知，HCPT 的最大吸收波长在 215 nm 与 265 nm 处，而负载物在 250nm 处；比较 HCPT 原料、羧基化碳纳米管与负载物的红外图谱（图 3）可知，红外图谱发生了明显的改变，HCTP 在 1500-1750 cm-1 的三个尖峰消失，并且在 1500-400 cm-1 指纹区也发生改变。采用高效液相色谱法测定负载物含量为 12.50 gmg-1。7图 2 紫外扫描图 图 3 HCPT-MWCNTs-COOH 红外图谱3.3 建立肠吸收样品 HPLC 测定方法3.3.1
25、 线性与范围以峰面积（A）对浓度（X，g mg-1）进行回归，得到高浓度和低浓度的线性方程分别为：A=33680x+1887.3（ r=0.9998）与 A=134715x+448（r=0.9996） ，表明药物量在 36 -180 n g 之间与 7.2-36 n g 之间均与峰面积呈良好的线性关系。3.3.2 专属性、精密度、稳定性考察按照 1.3 项下色谱系统，得到 HCPT 对照品、空白肠营养液、样品的 HPLC 图（见图4） ，可知在 HCPT 出峰位置无干扰，分离度及峰型较好，HCPT 的保留时间在 16.49 min。计算得到 HCPT 日内及日间峰面积 RSD 分别为 1. 0
26、2%、1. 16% ，结果表明仪器精密度良好。稳定性考察实验，HCPT 的离体外翻肠囊法样品峰面积 RSD 为 1. 56% ，表明样品在 8 h 内稳定性较好。A BC 图 4 离体外翻肠囊法中 HCPT 的 HPLC 图A. 样品；B. 对照品；C. 空白肠营养液3.4 离体外翻肠囊法试验 8实验结果见表 1，以零级拟合较好，决定系数（R 2）均达到 0. 9 以上。斜率即为单位面积单位时间内的肠吸收速率（Ka） ，各肠段的 Ka 随着浓度的增加而增加，表明吸收机制为被动扩散。分别对不同浓度下各个肠段的吸收速率常数作单因素方差分析，以 P 0.05，统计结果表明各个肠段的吸收速率均无显著性
27、差异，说明负载物中的 HCPT 在小肠内不存在特殊的“吸收窗” 。十 二 指 肠00.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50 0.5 1 1.5 2 2.5t/h吸收量/gcm-2高 浓 度中 浓 度低 浓 度空 肠00.050.10.150.20.250.30.350.40 0.5 1 1.5 2 2.5t/h吸收量/gcm-2低 浓 度中 浓 度高 浓 度回 肠00.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50 0.5 1 1.5 2 2.5t/h吸收量/gcm-2低 浓 度中 浓 度高 浓 度结 肠00.050.10.150.20.2
28、50.30.350.40.450.50 0.5 1 1.5 2 2.5t/h吸收量/gcm-2低 浓 度中 浓 度高 浓 度图 4 HCPT 浓度对各个肠段吸收速率的影响表 1 HCPT 不同质量浓度下各肠段的吸收速率常数 Ka（ s，n=4，gcm -2h-1） x肠段 浓度gmL-1回归方程 R219.21 Q=0.042 0 t + 0.027 8 0.982 228.76 Q=0.058 2 t + 0.030 2 0.983 0十二指肠75.09 Q=0.150 9 t + 0.078 1 0.983 019.21 Q=0.024 3t + 0.016 4 0.990 528.76
29、Q=0.037 8 t + 0.023 9 0.989 9空肠75.09 Q=0.092 7 t + 0.064 4 0.992 519.21 Q=0.039 2 t +0.019 2 0.970 9回肠28.76 Q=0.060 4 t + 0.029 6 0.973 0975.09 Q=0.148 9 t+ 0.077 7 0.963 219.21 Q=0.047 8 t +0.004 6 0.973 528.76 Q=0.0726 t + 0.0085 0.971 2结肠75.09 Q=0.183 0 t+ 0.020 5 0.962 54 讨论4.1 关于负载物的制备工艺振荡法、超声法
30、、球磨法三种处理方法的相平衡参数、相平衡时间表明，球磨法负载量高，达平衡时间短；超声法与球磨法的达平衡时间相当，约为 30 min，但负载量小；振荡法达到相平衡需要更多时间，其载药量在平衡后与超声法相当。究其原因可能是，在负载药物时，碳纳米管常缠绕在一起，不同打开缠绕的方法，裸露的管壁面积不同，故而载药量不同。球磨的机械力大，使纠缠在一起的碳纳米管易于充分展开；同时在液氮保护下的冷冻球磨，碳纳米管的脆性增强，更利于截断碳纳米管，使药物更容易地吸附到管壁上。超声方法利用超声波的空化作用及辐射传播的高频波，使液体高速往复振动，从而使混悬在液体里面的碳纳米管分散开，与球磨法相比，效果较差。而震荡吸附
31、，在药物吸附前没有打开纠缠在一起的碳纳米管，故吸附量最小。4.2 关于羧基化碳纳米管提高 HCPT 水溶性HCPT 油水均不易溶的特点，增加其水溶解度成为需要解决的主要问题。利用羧基化碳纳米管的中空结构、水溶性，将 HCPT 制备成负载物后，增加其水溶性并提高固有结构的稳定性，使不溶于肠营养液的 HCPT，制成负载物后能溶于肠营养液，并提高了肠透过速率，预示其体内胃肠道给药吸收良好，可以制备成口服制剂。 5 结 论冷冻球磨法因机械力强，增加碳纳米管脆性而易于截断，故在羧基化碳纳米管负载HCPT 制备工艺中采用，红外光谱、紫外光谱表明负载物制备成功。负载物增加了 HCPT的溶解性，其肠吸收速率（
32、Ka）提高。羧基化碳纳米管可以作为难溶性药物的载体材料，制备成胃肠道给药系统。参考文献1 代鲁平, 宋春霞, 邵先祥, 张 耀. 抗癌药物喜树碱类衍生物的研究进展J. 中国药学杂10志, 2010,45(23):1813.2 马学琴, 董 琳, 李国姗, 付雪起艳. 环糊精的包合作用对羟基喜树碱活性内酯结构的保护J. 中国新药杂志, 2010,19(14):1270-1274.3 Ji SR, Liu C, Zhang B, et al. Carbon nanotubes in cancer diagnosis and therapy J, Biochimica et Biophysica A
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