1、本 科 毕 业 论 文题 目非抗性筛选生长抑素基因疫苗对育肥猪的免疫应答研究姓 名 学 号专 业 动物科学指导教师 职 称中国武汉目 录华中农业大学本科毕业论文摘 要 .I关键词 .IAbstract.IKeywords.I前言 .11 材料与方法 .21.1 材料 .21.1.1 质粒和菌株 .21.1.2 实验试剂 .21.1.3 实验仪器 .21.1.4 实验动物 .21.2 疫苗准备和免疫方法 .21.2.1 疫苗准备 .21.2.2 免疫方法 .21.3 血样制备 .31.4 抗生长抑素抗体检测 .32 结果与分析 .32.1 非抗性筛选生长抑素免疫育肥猪后试验组与对照组抗体水平比较
2、 .32.2 不同剂量的 PGS/2SSasd 质粒免疫各组育肥猪抗体水平 .43 讨论 .43.1 非抗性筛选生长抑素试验组与对照组之间的抗体效价比较。 .43.2 免疫剂量对免疫效果的影响 .54 小结 .5参考文献 .6致 谢 .7摘 要 华中农业大学本科毕业论文将 90 只 60 日龄育肥猪均分为 6 组，T 1-T4 组用非抗性筛选生长抑素基因疫苗pGS/2SS-asd 免疫，剂量浓度分别是 2108 CFU/mL，210 9 CFU/mL，210 10 CFU/mL，2 1011 CFU/mL；C 1 和 C2 组为对照组，分别免疫 C500 空菌和 PBS。整个试验共免疫三次，每
3、次免疫间隔 4 周。ELISA 抗体检测结果显示：试验组在免疫初期抗体水平高于对照组，但是免疫后期差异不明显，不同免疫剂量组之间的抗体水平差异不明显。总之，用新型生长抑素基因疫苗免疫育肥猪在免疫初期可以检测到高水平的抗生长抑素抗体，推测出此 DNA 疫苗免疫大动物可以很好地促进动物的生长。关键词pGS/2SS-asd；生长抑素；减毒沙门氏菌；基因疫苗；育肥猪AbstractA total of 90 commercial pigs at the age of 60 days were divided into 6 groups. Animals in GroupC2 were orally a
4、dministered with PBS as a black control,What were administered GroupC1 is C500-salmonella.GroupT1 to GroupT4 were immunized with pGS/2SS-asd ,the density of dos of GroupT1 is 2108 CFU/mL,GroupT2 is 2109 CFU/mL，GroupT 3 is 21010 CFU/mL and GroupT4 is 21011 CFU/mL；Three times immunizing,the interval o
5、f immunizing toties quoties is 4 weeks.The results of ELISA antibody detection show that:The test Group have a higher level of anitiboty in the initial stage of immunization. But the difference with them were not obviously in the later stage.the difference of the level of anitibody that from GroupT1
6、 to GroupT4 is not obviously too.In all, use the gene vaccine of pGS/2SS-asd can get high abtibody of the SS from the analyze of the ELISA results. Conclude that this kind of DNA vaccine can accelerate the growth rate of the big animal.KeywordspGS/2SS-asd; somatostatin; attenuated Salmonella; geneti
7、c vaccine ; pig前言华中农业大学本科毕业论文生长抑素（somatostatin，SS ）是下丘脑释放的 14 肽激素，在动物体内具有广泛的抑制作用，特别是对生长及免疫反应具有明显的影响 1，应用生长抑素主动或被动免疫动物，所产生的抗体与 SS 结合，能阻断 SS 与受体作用；同时在肝脏的作用下，加速循环中 SS 的清除，从而促进 GH 等多种激素的释放，加快动物的生长 2-5。国外已报道应用 SS 抗血清被动免疫或化学合成 SS 制成免疫原主动免疫牛、绵羊等家畜，可以显著提高增重效果。国内杜念兴等已完成了在大肠杆菌中表达的基因工程亚单位苗、痘苗病毒表达的活载体苗等 SS 基因工程
8、苗的制备，其中由痘苗病毒表达的 SS 基因工程苗已开发成为激生 I 号、激生 II 号等商品化产品。激生 I 号苗对肉猪、肉羊、肉牛均有一定的增重效应，可使肉猪增重提高 5%-10%，饲料报酬提高 5%-20%，肉羊平均体重提 10%-12%。 6-7然而，以上合成肽及活载体苗都存在免疫持续时间短，生产成本高，基因工程表达产物纯化繁杂等不足，此外痘苗病毒还有可能产生毒力回升，造成极大的安全隐患。由于生长抑素分子量小(1658 kDa)，免疫原性弱，生长抑素常规免疫时都要与蛋白载体偶联或与蛋白基因等重组以增强生长抑素的免疫原性。近来，大量的研究证实乙肝表面抗原（HbsAg）S 区的第 112 与
9、 l13 氨基酸密码之间可以插入 10-20 个氨基酸残基的 DNA 片段，S 区的 3末端也可以嵌合外源基因片段，都不影响多聚体颗粒的形成，并且能将外源抗原决定簇呈现在颗粒外表面 8-9。鉴于此，曹少先构建了双拷贝生长抑素 DNA 疫苗 pcS/2SS，免疫后大鼠后，抗体阳性率达到 60%10。但是该表达载体都是以抗性基因作为选择压力的，虽然在体外的分子生物学研究中非常有用，但在人和动植物体内无法实现，而且含抗药基因的质粒是导致临床抗药菌株播散的主要原因之一；同时抗生素的使用是基因工程产品制备过程中造成潜在痕量过敏现象发生的重要来源。染色体-质粒平衡致死系统的出现很好的解决了这个难题，它的宿
10、主菌通常是一类染色体突变体，突变的基因是细菌的管家基因，因其编码的产物为细菌生长繁殖所必需，故该基因的缺陷必然导致细菌死亡，该缺陷型菌株表现为不能在基本培养基上生长 12-13；当导入带有其完整基因的互补质粒后，质粒与缺陷型菌株即以遗传互补的方式共同构成染色体-质粒平衡致死系统，含有互补质粒的缺陷菌可在基本培养基上生长14。此时，互补质粒对其宿主菌的生长成为必需，一旦质粒丢失，细菌则由于不能合华中农业大学本科毕业论文成必需物质而死亡，因此，凡是能在基本培养基上生长的缺陷菌株必定含有重组质粒。鉴于此，本实验室将平衡致死体系引入生长抑素基因疫苗，构建了非抗性筛选的生长抑素真核表达质粒 pGS/2S
11、S-asd，并转化至缺失 asd 基因的减毒猪霍乱沙门氏菌C500 中。本研究的目的就是将该新型疫苗免疫育肥猪，通过间接 ELISA 法检测抗生长抑素抗体，探讨其免疫效果 15。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 质粒和菌株 缺失asd 基因的减毒猪霍乱沙门氏菌C500和pGS/2SS -asd质粒 11均由实试验室保存。pGS/2SS -asd质粒的构建图如下：pGS/2-asd498 bpNheIHindISEcoRIMCFasdV1.1.2 实验试剂 PBS溶菌液为 pH 7.4、10mmol/L的磷酸盐缓冲液，LB培养基为胰化蛋白胨、酵母提取物和氯化钠组成的液体培养基，DAP（二氨基
12、庚二酸）过滤除菌，包被缓冲液为 pH 9.6、50 mmol/L碳酸盐缓冲液，封闭液为5%的脱脂牛奶溶液，PBS稀释液为pH 7.2、10mmol/L的磷酸盐缓冲液，兔抗猪IgG-HRP，洗涤液为0.05%吐温-20水溶液，TMB显色液，2 mol/L硫酸终止液。1.1.3 实验仪器 华中农业大学本科毕业论文恒温水浴摇床；酶标仪；恒温培养箱；冷冻离心机；微量加样器。1.1.4 实验动物 60日龄育肥猪，选自武汉附近商品化猪场。1.2 疫苗准备和免疫方法1.2.1 疫苗准备 挑取PGS/2SS asd和C500 单菌落分别接种于液体LB 培养基，37，200 r/min振摇培养至OD 600为0
13、.3-0.4，4 3000 r/min离心10 min，弃上清，用灭菌的PBS调整细菌浓度至210 11 CFU/mL，备用。1.2.2 免疫方法 选60日龄育肥猪90只，均分为6组，每组15只。第1组（T 1）灌注PGS/2SS -asd菌液，浓度为210 8 CFU/mL，第 2组（T 2）灌注PGS/2SS-asd菌液，浓度为210 9 CFU/mL，第3组（T 3）灌注PGS/2SS -asd菌液，浓度为210 10 CFU/mL，第4组（T 4）灌注PGS/SS -asd菌液，浓度为 21011 CFU/mL，第5组（C 1）灌注C500空菌组，第6组（C 2）为空白对照组，灌注灭菌
14、PBS溶液。分别于免疫前12h和4h禁食、禁水，并在免疫前30 min，预先灌注（5mL/只）7.5%的NaHCO 3以中和胃酸，然后进行免疫，剂量为10ml/只。初次免疫4周后以相同剂量、相同方法加强免疫一次，再次免疫4周后以相同剂量、相同方法再加强免疫一次。1.3血样制备每次免疫1周后对育肥猪进行颈静脉采血，血液收集后，室温静置3 h，4冰箱过夜，然后3000 r/min离心30 min，分离血清，分装后置于20 冰箱备用 16。1.4 抗生长抑素抗体检测包被生长抑素抗原每孔100ng/100L，4过夜，弃反应液，用PBST液洗3次；加封闭液100L/孔，37反应1.5h，弃反应液，用PB
15、ST洗涤3次；1/25,1/50,1/100, 1/200,1/400, 1/800,1/1600的浓度梯度（用封闭液稀释）加待测血清100L/孔，同时设对照孔（调零孔：不加任何反应液；非特异性吸附孔：用PBS缓冲液代替血清，37反应1 h，弃反应液，洗涤3次；加兔抗猪IgG-HRP（1：2000稀释），每孔100L，37反应1 h，弃反应液，洗涤 3次；加底物液，每孔150L ，37 反应25 min；加2 mol/L华中农业大学本科毕业论文硫酸终止反应，每孔50L；OD450读数。2 结果与分析 2.1非抗性筛选生长抑素免疫育肥猪后试验组与对照组抗体水平比较 通过间接ELISA法对各个试验
16、组和对照组的血样进行检测，用滴度倒数的平均值来表示。由图1可以看出：初免后一周，试验组的抗体效价水平明显高于对照组，第二次免疫后，试验组的抗体效价水平下降，水平在C 2对照组与C 1对照组之间。第三次免疫后，试验组的抗体效价水平继续下降，最终下降到与对照组几乎同一水平。0501001502002503001w 5w 9wWeeks after primer immunizationReciprocal of titreT1-4C1C2图1 试验组与对照组抗SS抗体水平检测说明：T 1-4为试验组分别免疫不同浓度的生长抑素（SS）基因融合真核表达质粒PGS/2SS asd，C 1,C2组为对照组
17、，分别免疫 C500空菌与PBS，每组结果均用滴度的倒数平均值表示。2.2 不同剂量的 PGS/2SSasd 质粒免疫各组育肥猪抗体水平通过间接ELISA法对不同免疫剂量的血样进行检测，用滴度倒数的平均值来表示。图2显示：初次免疫一周后，T 1组抗体效价最高，第二次加强免疫之后， T3和T 4组的抗体效价有所提高，效价水平在T 1,T2组之上。在初次免疫一周至五周的这段时间里，T3,T4组的抗体效价表现出较明显的上升趋势，T 1和 T2组的抗体效价表现出下降的趋势，特别是T 1组。第三次免疫后，4组抗体效价均呈现下降趋势，初免后第九周， T1,T2组效价水平最低，T 3组效价水平高于T 2组。
18、华中农业大学本科毕业论文0501001502002503003504001w 5w 9wWeeks after primer immunizationReciprocal of titreT1T2T3T4图 2 不同剂量试验组抗 SS 抗体水平检测说明：T 1-T4为实验组分别免疫不同浓度的生长抑素（SS）基因融合真核表达质粒 pGS/2SS asd，浓度依次为：210 8 CFU/mL；210 9 CFU/mL；210 10 CFU/mL；210 11 CFU/mL，每组结果均用滴度的倒数平均值表示。3 讨论3.1 非抗性筛选生长抑素试验组与对照组之间的抗体效价比较。从试验结果图 1 可以看
19、出，非抗性筛选生长抑素 pGS/2SS-asd 作为一种重组型的基因疫苗能够有效的刺激生长育肥猪产生抗生长抑素的抗体。从而在理论与实际上验证了生长抑素的促生长工作原理.从试验分析图中得出：所有试验组的抗体水平在生长初期即 70 日龄-90 日龄期间能够有效的刺激机体产生抗体且高于试验对照组的平均水平，而在 90 日龄-150 日龄即出栏前期，生长抑素抗体效价出现回落，且低于试验对照组的平均水平。原因可能有以下主要两点：1，育肥猪在生长后期可能自身生长激素增加，因此相对于外源性基因免疫而引起的反应应答不明显。2，免疫剂量不够。我们的华中农业大学本科毕业论文育肥猪免疫试验是在大量的实验室模式动物（
20、小白鼠）的基础之上而进行的扩大性生产试验，舒邓群等 17利用 GM-CSF 与 SS 的融合表达质粒在大鼠与小鼠的动物试验基础上已经确定了 2108 CFU/mL 是比较合适的免疫剂量。而未有试验提及育肥猪生长试验，加之本身研究生长抑素基因疫苗的研究较少。而未有文献提及适合的免疫剂量，因此此次试验也是为以后的扩大性生产试验摸索条件。3.2 免疫剂量对免疫效果的影响国外学者曾以减毒沙门氏菌为载体在真核细胞中成功地表达了 lacZ 基因、绿色荧光蛋白(GFP) 基因、HIV- gp140 基因、李斯特菌溶血素基因等 18-21，结果证实：利用减毒沙门氏菌作为载体传递 DNA 疫苗具有良好的免疫原性
21、。本文正是以减毒的猪霍乱沙门氏菌为载体传递生长抑素基因，并取得了较理想的免疫效果。基因免疫的剂量取决于疫苗的转染效率和抗原提呈的效率，而它们又受多方面因素的影响。本研究表明剂量的不同在一定程度上增加了抗体水平，在前期即 70 日龄-90 日龄期间 T1 组（210 8 CFU/mL）抗体效价最高，而在后期降至低点。T 3,T4 组在后期免疫应答水平达到较高。因此不能简单的定论高剂量或者低剂量为育肥猪的合适免疫剂量。具体免疫条件与免疫周期还需要进一步的摸索。4 小结本研究表明用 pGS/2SS-asd 基因疫苗免疫育肥猪在免疫初期可以检测到高水平的抗生长抑素抗体。进一步推测出此 DNA 疫苗免疫
22、大动物可以很好地促进动物的生长，在动物促生长方面具有相当大的应用前景，但是 pGS/2SS-asd 基因疫苗的安全性以及最适免疫剂量还有待进一步的研究。参考文献1. Spencer GSG, Garssen GJ. Increased growth in lambs following immunization against somatostatin: Preliminary observations. Anim Prod, 1981, 32: 376华中农业大学本科毕业论文2. Spencer GSG, Garssen GJ, Hart IC. A novel approach to gr
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