1、固定化细胞技术综述及其应用张弘扬 1401024103 高娟丽 1401024122天津农学院 农学与资源环境 生物技术（1）班摘要 固定化细胞是将动植物或微生物细胞固定于合适的不溶性载体上的一种技术 ，它既可以提高生产效率和生产能力、延长生产周期，又易于细胞的分离和回收。在生物、医药、环境保护、食品工业等方面得到了广泛应用。本文主要介绍了固定化细胞技术的方法，载体的选择与应用，综述了固定化细胞技术在工业、环境中的应用，并对其发展前景进行展望。关键词 细胞固定化 固定化方法 细胞固定载体 生物反应器 酒精发酵 环境治理固定化技术包括固定化酶技术与固定化细胞技术。固定化细胞技术起步较晚，在 20
2、 世 70 年代后才从固定化酶技术发展而来，它是指通过物理或化学的方法将分散、游离的微生物细胞固定在某一限定空间区域内，以提高微生物细胞的浓度，使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。相对于固定化酶技术，该方法不需把酶从细胞中提取出来，且无需纯化，酶活力损失小。目前，固定化细胞技术的应用范围涵盖生物学、生化工程、有机化学、合成化学、高分子化学、食品与发酵工业、环境净化、能源生产等多个领域，已经成为生物技术中十分活跃的跨学科研究领域。本文主要对该技术及其应用进行了简单介绍，并对其发展前景进行展望。一、生物细胞固定化技术1、细胞固定化的原理及方法固定化技术是使生物催化剂更广泛、更有效应用的一种重要
3、手段，任何一种限制生物催化剂自由流动的技术都可以用于制备固定化生物催化剂。由于细胞的种类多种多样，大小和特性各不相同，故此细胞固定化的方法有很多种。Karel 等人将其归纳为表面吸附、多介质包埋、隔离和自凝集 4 大类；王建龙把目前常用的固定化方法分为吸附法、包埋法、胶联法和截留法；杨文英等介绍了吸附法、包埋法、共价结合法、胶联法、多孔物质包络法、超过滤法、多种固定化方法联用等 7 种常用方法；成庆利等按有无外加载体将细胞固定化方法分为有载体固定化法和无载体固定化法 2 种；张磊等按照固定化载体与方式的不同将其分为吸附法、包埋法、共价结合法和胶联法。1传统的细胞固定化方法有四大类：包埋法、吸附
4、法、交联法、共价结合（偶联）法。包埋法：利用物理方法将细胞包埋在多空载体内部而制成固定化细胞的方法称为包埋法。包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定方法。包埋法反应条件温和，酶蛋白结构极少受改变，而且固定化时保护剂的存在不影响酶的包埋产率。此方法对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。不过包埋法仅适用于小分子底物和产物的酶，而且由于底物和产物扩散受阻，酶的反应速率可能受到影响。吸附法：利用各种吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定的方法称为吸附法。用于细胞固定化的吸附剂主要有硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体、和中空纤维等。按吸附
5、原理又可分为物理吸附和离子吸附两种。吸附法的优点是操作简便、价廉、条件温和，对细胞活性影响小，但缺点是细胞结合不牢且数目有限，条件变化时易脱落。交联法：交联法又称无载固定化法，是一种不用载体的工艺，通过化学、物理手段使生物体细胞间彼此附着交联。化学交联法它一般是利用醛类、胺类等具有双功能或多功能基团的交联剂与生物体之间形成共价键相互联结形成不溶性的大分子而加以固定，所使用的交联剂主要有戊二醛、聚乙烯酞胺、表氯醇等等。物理交联法在是指在微生物培养过程中，适当改变细胞悬浮液的培养条件(如离子强度、温度、pH 值等)，使微生物细胞之间发生直接作用而颗粒化或絮凝来实现固定化，即利用微生物自身的自絮凝能
6、力形成颗粒的一种固定化技术。该法操作简便，但在较剧烈条件下进行，一般固定化细胞活性不高，因此该方法的推广应用受到了一定的限制。共价结合（偶联）法。共价结合法是细胞表面上官能团和固相支持物表面的反应基团形成化学共价键连接，从而固定微生物。该方法固定化微生物稳定性好，不易脱落，但限制了微生物的活性，同时反应激烈，操作与控制复杂苛刻，并且成本较高。尽管固定化方法多种多样，但没有一种理想的、普遍适用的方法。化学固定化法（包括化学交联法和共价结合法）涉及细胞的化学修饰，但化学试剂的毒性对细胞会有损害，因此，不适用于制备固定化活细胞。但由于细胞与细胞或细胞与载体间的结合力强，所以操作稳定性高。交联法和聚电
7、解质复合包埋法的突出优点是可以获得很高的细胞密度，但由于缺乏良好的机械强度而不能得到广泛应用。2、固定化细胞的载体载体材料的性质很大程度上决定了微生物的附着固定和生长代谢状态，微生物量的多少也与载体材料的结构有关。因此固定化细胞的载体是细胞固定化技术能否成功的关键因素。2.1 载体的一般要求通常情况下，一个理想的优良载体应具有以下特性：固定化操作方便，成型快；载体表面应具有化学活性集团,可以直接或经过活化后与生物分子偶联；载体应具备一定的容量,可以偶联足够的生物分子；载体的作用仅是使生物分子固定化,对生物分子无毒害作用，反应温和；载体应具有良好的生物相容性,对反应物和生成物的扩散阻力小；耐微生
8、物分解，使用时间长和重复使用次数多；载体原材料广泛而且成本低廉。实际上，很少有一种载体材料能满足上述所有条件。通常总是根据工作性质去选择较为合适的载体材料。2.2 载体材料的影响因素一般情况下，固定化的速率受载体材料表面粗糙度和电荷的影响，载体材料的表面粗糙度越大，微生物的附着越稳定；同时载体材料表面的空隙能较好地保护微生物，免受水力负荷的损害。研究表明微生物表面一般带负电荷，使用表面带正电荷的材料作为固定化载体能中和微生物表面的负电荷，可加速固定化速度，在液相中更易于微生物向载体表面的传输。2.3 载体材料的分类目前，固定化技术所使用的载体材料主要有：天然载体材料、合成高分子载体材料、人造无
9、机载体材料、复合载体材料等2。（1）天然载体材料天然载体材料包括天然无机载体材料和天然有机载体材料两大类。其中，利用沙粒、沸石、硅藻土等制作为天然无机载体材料，此类载体在水中不易流化，表面积较小，吸附的微生物量少，因而一般作为辅助材料。天然有机载体材料主要利用琼脂、海藻酸盐等天然多糖类材料，这些材料均具有良好的生物相容性、反应温和性、无毒性，多在研究和应用中被选用，其中又以海藻酸钠应用最为广泛3。但天然有机载体的缺陷是其制作固定化小球其强度稳定性较低，传质能力差，且易被微生物分解，故使用寿命较短，因此需及时更新制备，以补充降解所耗。（2）合成高分子有机载体材料在实验和研究中常采用的是聚乙烯醇（
10、PVA）、聚乙二醇（PEG）、聚氨酯（PU）等作为原材料。此类载体材料对微生物无毒害作用，反应温和，可提高微生物的存活率，相比于天然的载体材料，此类载体材料更不易被微生物降解，使用寿命更长，因此人们选用合成的高分子载体较多。聚乙烯醇是一种人工合成的有机多聚体凝胶，作为包埋载体有机械强度高，化学性能稳定、对微生物无毒、抗微生物分解能力强、价格低廉和使用寿命长等优点4。（3）人工制造的无机载体材料此类载体材料利用的是人为制造的微孔结构将微生物进行固定，由此提高了载体中的微生物浓度，从而达到更好的处理效果。常见的人造无机载体有活性炭、多孔陶瓷、微孔玻璃、泡沫金属等。这些材料对于微生物的毒性较低，机械
11、稳定性较高，因此提高了微生物对于废水的耐受性，同时由于他们不会被微生物所降解，因此使用寿命一般比较长。（4）复合载体材料由于有机载体材料和无机载体材料各有有缺点，而两类材料在许多性能方面互补，因此，利用组成和结构可调控的有机聚合物对传统无机载体材料进行改性修饰，制备兼具二者优良特性的负荷载体用于微生物固定化研究，受到了众多学者的青睐。3、固定化细胞的生物反应器固定化细胞生物反应器的分类方法很多，但主要按催化物的分布形式，结合反应器的机械结构进行分类。根据生物催化物在反应器内的分布形式可将生物反应器分为生物团块反应器和生物膜反应器5。生物团块是指细胞被包埋或固定为絮凝物或颗粒，以及自身形成的菌丝
12、球，采用的反应器包括机械搅拌式反应器、鼓泡塔反应器气升式反应器和环流反应器。生物膜是指微生物在支持物上形成的一层黏膜状物，采用的反应器有固定床（填充床）反应器、流化床反应器、生物转盘、渗滤器、膜反应器等。以下是几种常见的固定化细胞生物反应器。填充床反应器：在此反应器中，细胞固定于支持物表面或内部，支持物颗粒堆叠成床，培养基在床层间流动。填充床中单位体积细胞较多，由于混合效果不好，使得床内氧的传递、气体的排出、温度、pH 的控制较为困难。此外支持物颗粒破碎还会使填充床阻塞。流化床反应器：典型的流化床是利用流体（液体或气体）的能量使支持物颗粒处于悬浮状态。该反应器混合效果较好，但流体的剪切力和固体
13、化颗粒的碰撞常使支持物颗粒破损，另外，流体的剪切力学复杂使其扩大生产困难。膜反应器：膜固定化是采用具有一定孔径和选择透性的膜固定细胞。营养物质可以通过膜渗透到细胞中，细胞产生的次级代谢产物通过膜释放到培养液中。膜反应器主要有中空纤维反应器和螺旋卷绕反应器。与凝胶固定化相比，膜反应器的操作压下降较低，流体动力学易于控制，易于放大，而且提供更均匀的环境条件，同时还可以进行产物的及时分离以解除产物的反馈抑制，但构建膜反器的成本较高。2、固定化细胞技术应用实例固定化细胞技术应用目前还处于研发阶段，高性能载体的选择与研制、固定化细胞生物反应器性能的提高，固定化细胞生长环境的检测都有待发展。因此，大规模生
14、产应用受到限制。但是，世界各国把固定化细胞研究的成果应用于生产已产生了很大的经济价值。目前在食品、医药、环境处理等方面已经取得了初步的成果。（1）固定化酵母细胞在酒精发酵中的应用传统的葡萄酒生产多采用游离酵母细胞发酵，存在着发酵周期长、生产效率低下、不利于连续生产、酵母细胞不能重复使用、 生产成本较高等许多缺点，利用固定化细胞技术可以克服以上缺点，实现葡萄酒的快速低温连续发酵。低温发酵有利于提高酒度、改善葡萄酒的香气和抑制细菌生长,但同时也会减慢发酵速度,延长发酵周期。采用固定化酵母细胞进行连续发酵可以大幅度提高低温条件下酒精的生产能力，加快发酵进程。与游离细胞相比，固定化酵母细胞的活化能大大
15、降低，其在低温条件下对葡萄浆的发酵速度也显著加快。固定化酵母细胞连续发酵生产系统可连续操作而不污染，而且酒精生产能力也未见下降。同时，对所得酒样进行分析表明，固定化细胞连续发酵制得的葡萄酒总酸及挥发酸含量均低于游离细胞发酵制得的葡萄酒6。 （2）固定化细胞技术在环境治理上的应用 目前随着经济的发展，环境污染问题越来越明显，污水更是一个严峻的问题。过去的化学、物理污水处理都不理想，物理处理方法不彻底，化学处理方法会造成二次污染，而微生物在废水处理领域中具有独特的优越性，慢慢突显出了它的优势。由于微生物在自然状态下浓度不是很高，处理效果不是很好，而分离、筛选出优势菌种加以固定，增强了细胞对有毒或高
16、渗物质的承受能力和降解能力，因此细胞固定技术得到了广泛应用，可用于处理氨氮废水、难降解的有机废水、含重金属废水、有色废水等。它具有效率高、稳定性强、耐负荷、产污泥量少等优势。通过不断的研究和改进，固定化细胞技术在废水治理领域中已成为一项高效而实用的废水处理技术。例如宋昊等用海藻酸钠作为载体将一株降酚菌株进行固定化包埋。利用正交实验确定了该菌株固定化细胞制备的最优条件。研究表明，该降酚菌株的固定化细胞对苯酚的降解能力和耐受能力均大于游离细胞。该菌株的固定化细胞对废水中的 COD 也具有良好的降解效果7。 （3）固定化细胞技术在食用菌液体发酵领域的应用 目前固定化细胞技术在食用菌领域上的应用主要集
17、中在固定化菌体细胞发酵生产代谢产物方面。众多实验研究显示，采用该技术将菌体细胞固定化后，相比游离细胞不仅延长了菌种的应用时间，且发酵得到的目标产物均有小幅提高，为发展食用菌连续化、自动化生产提供了技术支持8。宋秋兰发明了一种利用循环式填充床反应器发酵生产灵芝多糖的专利技术。主要将灵芝菌体细胞固定在循环式填充床反应器细胞固定化载体上，通过循环管道使发酵液处于流动状态，对固定化细胞进行循环发酵。细胞处于固定状态下，进行液体深层发酵，增加了发酵的细胞密度和耐受毒害能力，同时提高了细胞分泌物的产量和含量，且固定化细胞可反复利用9。三、前景展望固定化细胞技术因其优点受到广泛的关注，在应用中显示了明显的优
18、势，但是目前不够成熟，还处于研究探索阶段。固定化方法的改进、寻求更优良更适合于固定化的载体材料、优良菌种选育、高效固定化生物反应器的研制、多细胞固定化生产的研究等是实现固定化细胞技术大规模应用的重要途径，随着生物、材料等技术的不断发展进步，固定化细胞技术研究将会有更进一步的发展，获得更广泛的应用。参 考 文 献1生物固定化技术及应用.朱启忠编.化学工业出版社2宋向阳,余世袁. 生物细胞固定化技术及研究进展J. 化工时刊,2000,(11):37-39.3王秀娟,张坤生,任云霞,姚俊. 海藻酸钠凝胶特性的研究J. 食品工业科技,2008,(02):259-262.4陈功,王联结. 不同方法制备
19、PVA 载体进行固定化细胞发酵酒精的研究J. 食品科学,2007,(06):249-251.5郭晓燕,徐尔尼. 固定化细胞生物反应器的应用及研究进展J. 食品工业科技,2006,(05):191-194.6王思新,焦中高,孙治军. 固定化细胞技术在果酒生产中的应用J. 中国食物与营养,2003,(01):41-43.7 宋昊,何泽超,降酚菌株的固定化细胞处理含酚废水的性能研究J.环境污染治理技术与设备,2006.06(09):37-40.8石小霞,褚可成,陈志梅,薛林贵. 固定化细胞技术及其应用J. 食品工业科技,2010,(12):380-382+385.9宋秋兰.利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法.中国:200810218713P. 2009- 03- 11
