1、 Treatment of rat cranial defect with autogenetic minimal morselized bone and allogenic cellsMA Song, YAN JingLong, LIN Xin, PAN HaiTao, WANG XinTao, YANG XianShengDepartment of Orthopaedics, Tiantan Hospital, Capital Medical University,Beijing 100050, China, Department of Orthopaedics, First Affili
2、ated Hospital, Harbin Medical University, Harbin 150001, China【Abstract】 AIM: To investigate the combined treatment effects of autogenetic minimal morselized bone and allogenic cells on rat cranial defect. METHODS: Cranial defect in rat models was repaired with autogenetic minimal morselized bone gr
3、aft and allogenic cell transplantationosteoblasts or marrow stormal cells (MSC) . X ray was taken to understand the union condition, and RTPCR was performed to examine the mRNA expressions of TGF1 and bFGF. RESULTS: In the order of combined treatment group A (morselized bone and osteoblast graft), c
4、ombined treatment group B(morselized bone and MSC graft), combined treatment group C(minimal morselized bone only), the union time of cranial defect prolonged as (7.330.44) wk, (8.670.69) wk and (11.671.52) wk, and the expression of TGF1 and bFGF emerged in the order (P0.05 between every 2 groups).
5、CONCLUSION: The combined therapy of minimal morselized bone and allogenic cells accelerate the repairment of cranial defect and the expression of cell factors.【Keywords】 cranial defect; bone transplantation; cell transplantation; minimal morselized bone【摘要】 目的： 观察自体微小颗粒骨复合骨髓基质细胞（MSC）或成骨细胞移植修复大鼠骨缺损的治
6、疗效果. 方法： 制作大鼠颅骨缺损动物模型，培养同种异体新生大鼠的MSC 及成骨细胞，复合自体颗粒骨后植入骨缺损区，X 线摄片观察骨愈合情况；RTPCR检测转化生长因子 1（TGF1） ，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达水平. 结果： 植入微小颗粒骨复合成骨细胞组颅骨缺损愈合最快（7.330.44） wk，TGF1, bFGF 表达出现早，与其他两组比较差异显著（P0.05）. 植入微小颗粒骨复合 MSC 组颅骨缺损愈合时间居中（8.670.69） wk，TGF1, bFGF 表达早于单纯微小颗粒骨组（ P0.05）. 单纯微小颗粒骨植入组颅骨缺损愈合慢（11.671.52） wk，TG
7、F1, bFGF 表达出现晚. 结论：微小颗粒骨复合细胞移植修复颅骨缺损，细胞因子表达早，缺损愈合明显加快.【关键词】 颅骨缺损；骨移植；细胞移植；微小颗粒骨0 引言骨缺损的修复是骨科的研究热点之一，自体骨移植被认为是修复骨缺损的金标准，方法多采用块状或条状骨移植. 颗粒骨移植近年来正逐渐受到重视，广泛应用于关节翻修手术中1. 微小颗粒骨有利于骨折愈合也有报道2. 我们通过微小颗粒骨复合细胞移植修复大鼠颅骨缺损，观察骨愈合情况及在此过程中转化生长因子 1（TGF1）及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达情况，探讨修复骨缺损的有效方法.1 材料和方法1.1 材料出生 9 d 健康 SD 雄性
8、大鼠 144 只,体质量 200220 g 由哈尔滨医科大学附属第二医院动物室提供；DMEM 培养液购自美国 Gibco 公司； 150 mL/L 胎牛血清冲，CO2 培养箱，型胶原酶均购自美国 Sigma 公司.12 方法将大鼠随机分为 3 组：单纯微小颗粒骨植入组(第 1 组) ，微小颗粒骨复合骨髓基质细胞（marrow stormal cells, MSC)组( 第 2 组)，微小颗粒骨复合成骨细胞组(第 3 组) ，每组 48 只. SD 大鼠处死后 750 mL/L 乙醇浸泡 5 min，双侧股骨髓腔 DMEM 加 150 mL/L胎牛血清冲洗，冲洗液加入培养瓶中置入 CO2 培养箱
9、中培养 MSC. 取颅盖骨剪碎，以型胶原酶（1 g/L）消化法3培养成骨细胞. 每 3 d 换液 1 次，长满瓶后消化，12 传代.1.21 颅骨缺损的修复实验动物取髂嵴切口，取自体髂骨约 1000 mg 磨钻制成直径300500 m 的颗粒，分别取培养的 MSC 及成骨细胞，消化后调整计数 5108/L，取 5 mL 与颗粒骨混合后 37水浴震荡 90 min 备用. 颅骨正中切口，显露大鼠顶骨及额骨，左侧顶骨正中制作 5 mm 全层骨缺损，注意保持硬膜完整. 颗粒骨及细胞混合液离心，将离心管底复合的颗粒骨及细胞植入骨缺损区，缝合切口. 第 1 组： 单纯植入颗粒骨；第 2 组：植入颗粒骨及
10、 MSC；第 3 组植入颗粒骨及成骨细胞. 植入后 3, 5, 7, 9, 15, 21, 36 和 56 d 取材进行 TGF1 及 bFGF mRNA 检测. 第 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 和 16 wk 取颅骨进行 X 线摄片观察骨缺损愈合情况.122RTPCR TGF1 及 bFGF mRNA 检测骨组织研碎后按 TRIZOL 试剂盒说明进行组织 RNA 提取. 按文献4提供的序列由上海博亚公司合成引物. TGF1 序列： 上游引物： TACATTGACTTTAGGAAGGA；下游引物： ATCATGTTGGACAACTGATCC. 扩增产物长度 252 bp， a
11、ctin 扩增产物长度 500 bp. bFGF 序列： 上游引物： GCGACCCACACGTCAAACTACAGC；下游引物： ACTGCCCAGTTCGTTTCAGTGCCA. 扩增产物长度 231 bp，actin 扩增产物长度 500 bp. 按说明书进行反转录及 PCR 扩增. 产物 15 g/L 琼脂糖上电泳.2 结果颅骨缺损修复 X 线，第 3 组较早期既有成骨表现，骨缺损愈合时间为(7.33 0.44) wk，快于其他两组（P0.05）. 第 2 组缺损愈合时间为(8.670.69) wk,慢于第 3 组，快于第 1 组（P0.05）. 第 1 组愈合时间为(11.67 1.
12、52) wk. RTPCR 电泳结果显示，TGF1第 3 组表达时间早，高峰水平与其他两组接近；第 2 组表达时间较第 1 组早，高峰水平接近. bFGF 第 3 组骨钙素基因表达出现早，且表达水平高，高峰持续时间未延长；第 2 组表达高峰在 910 d，其高峰水平低于第 3 组；第 1 组表达高峰出现晚，表达水平较低 (图1，2).图 1 颗粒骨复合 MSC 缺损修复时 TGF1 mRNA 的表达 （略）图 2 颗粒骨复合 MSC 缺损修复 bFGFmRNA 的表达（略）3 讨论自体骨移植是治疗骨缺损的有效方法，近年微小颗粒骨移植有见报告. 我们发现复合成骨细胞后，微小颗粒骨修复骨缺损加快，
13、其 TGF1 基因表达高峰提前，表达水平也升高，同时 bFGF 表达高峰也提前. 复合基质细胞后成骨效果优于单纯微小颗粒骨移植，这两种基因的表达较单纯植入颗粒骨组提前. 本实验说明自体微小颗粒骨可以和细胞结合，进行复合移植修复骨缺损，移植细胞和颗粒骨可以协同作用，提高成骨效果.细胞和载体复合方法很多3-5 ，包括浸渍法、沉淀法、吸附法、凝胶法 、动态培养系统等. 5 mm 颅骨缺损动物模型是用于研究骨缺损治疗的标准模型 . 通过术后 X 线观察，我们发现复合成骨细胞后，微小颗粒骨修复骨缺损加快，复合基质细胞后成骨效果也优于单纯微小颗粒骨移植，说明移植后的同种异体细胞不但存活，而且发挥了作用.
14、本实验中未采用免疫抑制剂，同种异体移植也获得了较好效果.TGF 是人体内分布最广泛的细胞因子之一，在实验动物的骨折和临床中 TGF1 在骨折早期即出现在骨膜上,TFG1 促进骨折处 MSC 和成骨细胞的增殖，在骨缺损修复时也起相同作用. 在人类中最丰富的是酸性 FGF（FGF1）和碱性 FGF（FGF2，即 bFGF） 6-7. 在正常的伤口愈合和骨折愈合中发挥作用. bFGF 提高了脱钙骨的异位能骨成力，提高骨移植物及多孔羟基磷石的接合.参考文献：1 金倩;氯地酊联合激光治疗痤疮 158 例疗效观察J;广东医学;1997 年 10 期 2 董新亭,李卫莉,张随学;自拟粉刺消治疗痤疮 126
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