1、质粒的构建：1. 酶切反应按照 1ugDNA 需 1-10u 内切酶的用量，在反应体系中加入相应的 10缓冲液，内切酶的体积不得大于总体积的十分之一，ddH2O 补足体系，如需长时间消化，还需加入适量的BSA 已稳定内切酶活性。2. DNA 片断的回收欲回收的 DNA 片断经琼脂糖凝胶电泳分离后，切下所需片断所在的凝胶（胶的体积尽可能小） ，加入 3 倍体积的 BufferQX1,及适量的 QIAX(Glassmilk),5510 分钟，每隔 2 分钟涡旋 1 次，待凝胶完全溶解，12000 转离心 1 分钟，BufferQX1 洗涤沉淀 1 次以消除剩余凝胶.。再用 BufferB 洗涤沉淀
2、 2 次，将沉淀晾干，加入适当体积的 ddH2O,离心后收集上清，琼脂糖凝胶电泳确定回收效率。3. DNA 片断 3 凹端的补平于 Eppendorf 管中依次加入 DNA0.2-5ug,2mMdNTP2ul,人以一种酶切缓冲液（10）2ul,加水至 19ul。然后加入 1-5 单位 Klenow 酶，混匀后室温下反应 15 分钟。待补平反应结束后，于 65水浴 20 分钟使 Klenow 酶失活，电泳定量后即可用于连接反应或 -20保存备用。4. DNA 片断 3 凸端的补平于 Eppendorf 管中依次加入 DNA0.2-5ug,2mMdNTP2ul,人以一种酶切缓冲液（10 ）2ul。
3、 ,加水至 19ul。然后加入 1-2 单位 T4 噬菌体 DNA 聚合酶，12 温育 15 分钟，于75加热 10 分钟，使 T4 噬菌体 DNA 聚合酶灭活。5. 载体的脱磷酸化：载体质粒经内切酶酶切后可直接进行脱磷酸化处理。40ul 的酶切反应体系，景点永建车酶切完全后可加入 10CIAP（牛小肠碱性磷酸酶）缓冲液 5ul,水 4ul 和适量 CIAP 进行脱磷酸化反应。CIAP 的用量依载体 5 端磷酸的摩尔数及末端性质而定，对于 5 突出的末端，每 100pmol 5 末端磷酸需 1 单位 CIAP，对于 5 凹端或平末端，每 2pmol 5 端末端磷酸需 1 单位 CIAP,一般
4、2ug 5kb 的线性化质粒 DNA 约翰 1.4pmol 5 端磷酸。反应条件：1）5 突出末端：加入 CIAP 后于 37反应 30 分钟，再加另一小份 CIAP(加入量依 DNA 量而定)，继续反应 30 分钟。2）5 凹或平末端：加入 CIAP 后于 37反应 15分钟，56反应 15 分钟，再加另一小份 CIAP(加入量依 DNA 量而定)，又于 37反应 15分钟，56反应 15 分钟。反应结束后，加 300ulCIAP 反应终止液（10mM Tris-Cl pH 7.5,1mM EDTA pH7.5,200mM NaCl,0.5%SDS）,依次用酚、酚/ 氯仿和氯仿抽提，加 0.
5、5 倍体积 7M 醋酸铵，2 倍体积酒精沉淀，室温晾干，溶于适量 TE 缓冲液中。6. 连接反应用适当的内切酶酶解载体和插入片断，DNA 片断回收后电泳检查比较二者的浓度，按载体：插入片断 1：4-6 的比例将二者加入到连接反应体系中，加入 10连接缓冲液 1ul,补水至10ul,取出 1ul 作连接前对照，然后加入 1 单位的 T4DNA 连接酶（平末端连接加入 5 单位的 T4DNA 连接酶） ，12-14 水浴中过夜，平末端连接在 20-22进行。次日，转化大肠杆菌感受态细胞。7. 感受态大肠杆菌制备将宿主菌的单菌落接种到 5ml LB 培养基中，37振摇过夜，次日，取 1/50 体积的
6、过夜菌液接种到 50-100mlLB 培养基中，37振摇，待菌液 OD600 接近 0.3-0.4 时，于 4 4000 转离心 10 分钟，收集菌体，取原菌液体积的 1/5 体积预冷的 0.1M CaCl2 溶液，轻轻加至菌体中，冰浴上轻轻摇动离心管，使菌体缓慢散开，冰浴静置 20 分钟，4 离心，弃上清。重复上一次操作，同样条件离心收集菌体后，向菌体中加入 1/50 体积预冷的CaCl2,混匀，冰浴静置 12 小时后用于转化。感受态细胞于 4保存一周仍可维持较高效率，或加入 1/10 体积的 DMSO 冻存于-70保存。8. 转化取新鲜制备的感受态细胞溶液 100ul 置于 1.5ml 管
7、中，加入 5-10ul 连接反应液，轻轻混匀后，冰上静置 30 分钟，然后置于 42水浴中热休克 90 秒，加入 0.5ml LB 培养基，37振摇 40 分钟，然后接种于含氨卞青霉素的 LB 平板上，37孵箱培养 10-12 小时后观察菌落生长情况。或用快速转化法：取新鲜制备的感受态细胞溶液 100ul 置于 1.5ml 管中，加入 5-10ul 连接反应液，轻轻混匀后，冰上静置 5 分钟，然后涂布于经 37预热 2 小时的含氨卞青霉素的 LB 平板上，37孵箱培养 10-12 小时后观察菌落生长情况。该方法适用于质粒和粘端连接产物的转化。9. 质粒 DNA 的小量制备在 1.5mlEppe
8、ndorf 管中，加入过夜培养的转化细菌液， 12000 转离心 30 秒，弃上清，加入 100ul 溶液（25mM Tris-Cl pH8.0,10mM EDTA pH 8.0,50mMSucrose）震荡混匀，在加入 200ul 溶液（0.2M NaOH,1%SDS）混匀后室温变性 5 分钟，加入 150ul 溶液（3M KAC,pH4.6）混匀中和 5 分钟，12000 转离心 5 分钟，转移上清至另一Eppendorf 管中，加入 1ml 无水乙醇，-20静置 5 分钟，12000 转离心 5 分钟，70%乙醇洗沉淀一次，室温晾干，沉淀溶于 50ulTE 缓冲液中。10质粒 DNA 的
9、大量制备将宿主菌的单菌落接种到含适当抗菌素的 5ml LB 培养基中，37振摇培养过夜，次日，取 0.1ml 过夜菌液接种到含抗菌素的 25mlLB 培养基中，37振摇培养到 OD600 接近0.6，将 25ml 培养物转移至含抗菌素的 500mlLB 培养基中， 37振摇 2.5 小时（OD600约为 0.4） ，加入 2.5ml 氯霉素溶液（34mg/ml）, 37振摇培养过夜，于 4 4000 转离心10 分钟，收集菌体，用 20ml 含溶菌酶（5mg/ml）的溶液（25mM Tris-Cl pH8.0,10mM EDTA pH 8.0,50mMSucrose）悬浮细菌，室温静置 5 分
10、钟，加入新鲜配置的溶液（0.2M NaOH,1%SDS）40ml，冰上混匀变性 10 分钟，加入 30ml 溶液（3M KAC,pH4.6）中和 10 分钟。412000 转离心 20 分钟，转移上清至另一管中，加入 0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置 30 分钟，室温 12000 转离心 15 分钟，用 70%乙醇洗沉淀一次，室温晾干，沉淀溶于 8mlTE 缓冲液中,称取 8gCSCl 加至 DNA 溶液中，加入 0.6mlEB（10mg/ml）溶液中,于 20，45000 转离心 24 小时，用毛细管吸出质粒 DNA 区带。水饱和正丁醇抽提数次去除 EB，用 4 倍体积ddH2O 稀释含
11、 CSCl 的 DNA 溶液，再用 2.5 倍体积的无水乙醇沉淀 DNA,-20静置 1-2小时，于 4 15000 转离心 20 分钟，用 70%乙醇沉淀一次，室温晾干后，荣誉适量的（0.5-1ml）TE 缓冲液中，电泳检查 DNA 质量，读取 OD260 与 OD280，计算 DNA 浓度与纯度。电穿孔转染质粒 DNA1) 电穿孔前一天，以合适密度传代细胞，使细胞在转染前处于对数生长期。2) 胰酶消化收集贴壁细胞，离心收集细胞。用电转缓冲液洗细胞两次。电转缓冲液为磷酸缓冲液。3) 弃上清，用 0.5ml 电转缓冲液重悬细胞，细胞浓度最好在 2106-2107 之间。细胞悬液移入 0.4cm
12、 电转杯中，加入 5-40ug 质粒，轻弹混匀。置于冰上 10 分钟。4) 电击。对大部分哺乳动物细胞，电压为 250-400 伏，即 625-1000v/cm，电容为960uF。在此条件下，电击时间大约在 30-50 毫伏。不同的细胞电转的最适条件不同，细胞电击后死亡率在 40%-60%左右时转染效率最高。5) 电击结束后，将细胞置于冰上 10 分钟。有文献报道，电击前后置于冰上 10 分钟可提高转染效率。6) 电击后，细胞移入非选择性培养基培养。培养 24 小时后，计数，稀释 15 倍以上，用选择培养基培养。2-4 天换液，直至抗性克隆形成。如用于筛选单克隆，HeLa 细胞电击24 小时后计数，细胞用选择培养基（G418,0.5mg/ml）稀释，以 1000 细胞/孔的密度传于96 孔板。培养 10 天左右，既有克隆形成。
