1、1EB 病毒核酸检测试剂技术审查指导原则(征求意见稿)一、前言本指导原则旨在指导注册申请人对 EB 病毒核酸检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。本指导原则是针对 EB 病毒核酸检测试剂技术审查的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提
2、供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。二、适用范围本指导原则所述 EB 病毒核酸检测试剂指基于分子生物学相关方法的核酸检测技术，以 EB 病毒核酸序列为检测靶2标，对来自人体样本（如全血、血浆、血清等）中的 EB 病毒进行体外定量检测的试剂。结合临床表现和其他实验室指标，本类产品可用于 EB 病毒感染实验室诊断及临床应用。本指导原则适用于基于实时荧光 PCR（Real-time polymerase chain r
3、eaction, qPCR）等核酸检测方法的 EB 病毒核酸检测试剂。对于其他方法，可能部分要求不完全适用或本文所述内容不够全面，申请人可以根据产品特性对适用部分进行评价或补充其他的评价资料进行相应性能的验证，但需阐述不适用的理由，并说明替代方法的科学合理性。本指导原则适用于进行产品注册和相关许可事项变更的产品。三、注册申报资料要求（一）综述资料综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学及不同型别检出能力等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。对于本类申报产
4、品，应着重从样本类型、样本采集与制备方式、目标基因片段的选择、方法学特征等方面描述。（二）主要原材料的研究资料此类产品的主要原材料应包括 EB 病毒检测试剂的所有主要组成成分，如引物、探针、酶、反应缓冲液、提取成分等。如为申请人自行研制的主要原材料，申请人应对 EB 病毒目的基因序列确定、引物和探针选择、酶的选择和验证等实验过程予以详述；并提供对各主要原材料的性能研究资料，如:3外观、纯度、蛋白浓度、功能性研究等。制备完成的原料成品应进行质量检验以确认其符合标准要求，整个生产工艺应稳定可控。如为申请人外购主要原材料，应详述每一原材料外购方来源，提交外购方出具的原材料性能指标及质量控制资料，并详
5、述申请人对外购主要原材料的各指标质量要求以及确定该原材料作为本产品主要原材料的详细依据。1.核酸分离/纯化组分（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。2.PCR 组分的主要原料（包括引物、探针、各种酶及其他主要原料）的选择、制备、质量标准及实验研究资料，主要包括以下内容：2.1 脱氧三磷酸核苷（dNTP）核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP 、dGTP、dCTP 和dTTP；应提交对其纯 度、浓度、保存稳定性等的验证资料。2.2 引物由一定数量的 dNTP 构成的特定序列，通常采用 DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化，并对序列准确性、纯度、稳定性、功能
6、性实验等的验证。如为外购，应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）结果或高效液相色谱法（HPLC ）分析图谱 。2.3 探针特定的带有示踪物（标记物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测。合成后经 PAGE 或其他适宜方法纯化，在 5-端(和/或3-端 )进行标记，并经 HPLC 或其他适宜方法纯化，纯度应达4到 HPLC 纯。应提供合成机构出具的合成产物质检证明，如HPLC 分析 图谱，应对 探针的分子量、纯度及标记的荧光基团进行核实，并进行功能性试验验证。2.4 酶DNA 聚合酶，应具有 DNA 聚合酶活性，无
7、核酸内切酶活性，具热稳定性，如：94保温 1 小时后仍保持 50%活性。尿嘧啶 DNA 糖基化酶（UDG/UNG ），具有水解尿嘧啶糖苷键的活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性。逆转录酶，具逆转录酶活性，无核酸内切酶活性。应对酶活性进行合理验证。3.核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无脱氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。4. 企业内部参考品：企业内部参考品是保证产品性能稳定性以及检测值可溯源的重要构成之一。参考品研究应包括原料选择、制备过程、定值研究、评价指标、统计学分析等。建议采用灭活病毒的临床样本或培养后的病毒株建立参考品，并溯源至国际参考物质，不宜使用质粒。内标设置应
8、合理，质控品宜采用混合临床样本或病毒株或假病毒制备。内对照（内标）以对管内抑制可能造成的假阴性结果进行质控。申请人应对内标的引物、探针和模板的浓度做精确验证，保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线，不应对目的基因的检测造成竞争性抑制而导致假阴性，对内标的 Ct 应有明确的范围要求。质控品应参与样本核酸的平行提取，以对整个 PCR 反应过程、试剂/设备、交叉污染等环节进行合理质量控制。企5业应对各种质控品的 Ct 做出明确的范围要求。企业应提交详细的溯源性研究资料。企业制备的企业内部参考品、用于制备商品化校准品的储备液均应能够溯源至国际参考品。（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料基本生产工艺主要包括
9、：配制工作液、半成品检定、分装和包装。配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对 pH、电导率等关键参数进行有效控制。生产工艺研究的资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如样本类型、样本用量、试剂用量、反应条件、校准方法、质控方法、稳定性和有效期，提供确切的依据，主要包括以下内容：1.主要生产工艺介绍，可以图表方式表示。2.DNA 提取纯化方法优化，建议包含纯化步骤，内标、质控品均应全程参与提取纯化。3.确定最佳 PCR 反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP 浓度、阳离子浓度、样本量、加样量及反应体积等。4.确定 PCR 各阶段温度、时间及循环数
10、的研究资料。5.对于基线阈值（threshold）和阈值循环数（Ct）确定的研究资料。6.不同适用机型的反应条件的对比分析，如果有差异应分别详述。（四）分析性能研究资料申请人应提交生产者在产品研制或成品验证阶段对试6剂盒进行的所有性能验证的研究资料，对于每项分析性能的评价都应包括具体研究目的、实验设计、研究方法、可接受标准、实验数据、统计方法等详细资料。有关分析性能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验地点（实验室）、适用仪器、试剂规格、批号、临床样本来源等。分析性能评价的实验方法可以参考相关的美国临床实验室标准化协会批准指南（CLSI-EP）文件或国内有关体外诊断产品性能评估的指导
11、原则进行,建议着重对以下分析性能进行研究。1. EB DNA 提取病毒 DNA 提取主要有以下目的：富集目的基因浓度、保证目的基因序列的完整性、增加 PCR 模板溶液均一性、去除 PCR 抑制物，是决定 PCR 成败的关 键环节。因此，无论申报产品是否含有 DNA 分离/ 纯化的组分，企业都应对核酸提取的环节做详细的验证。临床标本中可能含有各式各样的PCR 抑制物，因此，对于 DNA 提取试剂的选择，除最大量分离出目的 DNA 外，还应有纯化步骤，尽可能去除 PCR 抑制物。目前常见的 DNA 分离纯化方法和改良方法各有优势和不足，申请人应结合申报产品的特性，合理选择 DNA 分离/纯化试剂，
12、并提供详细的验证资料（提取效率、与后续试验的配合等）。2.最低检出限与定量限（分析灵敏度）（1）最低检出限与定量限的确定建议使用国际参考品进行梯度稀释并多次检测，将具有95%以上阳性 检出率的病毒水平作为最低检出限。定量限应高于或等于检出限，将多次（至少 10 次）测量的结果符合试剂准确度要求的最低病毒水平作为定量限。7（2）最低检出限和定量限的验证申报试剂应在最低检出限或接近最低检出限、定量限的病毒浓度进行验证。企业应能够提供用于最低检出限/定量限验证的病毒株的来源、及浓度确认试验等信息。不同样本类型（如涉及），应分别评价最低检出限及定量限。3.线性范围线性范围确定的研究应使用高值临床样本或
13、病毒株按一定浓度加入血液基质中（由可溯源至国际参考品的方法定量）进行梯度稀释，稀释液应使用经确认为阴性的混合人血液样本，应包含不少于 9 个浓度（应包含接近最低检测限的临界值浓度），使用至少 3 个批次的试剂进行试验。通过评价一定范围内的线性关系及各水平的准确度确定该产品的线性范围。不同样本类型（如涉及），应分别评价线性范围。4. 准确度应使用国际参考物质或企业内部参考品和临床样本进行阳性/阴性符合率或者方法学比对研究。5.精密度应对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，评估重复性和重现性，包括运行内的变异和运行间、日内、日间、批次间、操作者间、仪器间和地点间的变异。建议设定合理的精密度评价周
14、期，例如为期 12 天的检测，每天由 2 人完成不少于 2 次的完整 检测，注意应包括核酸分离/纯化步骤。可采用临床样本进行试验，至少包含 3 个浓度水平：阴性样本、略高于最低检测限的弱阳性样本、中等阳性样本。86.特异性（1）交叉反应用于 EB DNA 检测试剂交叉反应验证的病原体种类主要考虑以下几方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状（推荐种类见表 1）。建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。通常，细菌感染的水平为 106 cfu/ml 或更高，病毒为 105 pfu/ml 或更高。申请人应提供所有用于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属/型别和 浓度确
15、认等试验资料。有关交叉反应验证的信息应以列表的方式在产品说明书的【产品性能指标】项中有所体现。表 1 用于交叉反应研究的微生物（推荐）微生物水痘-带状疱疹病毒人类免疫缺陷病毒*乙型肝炎病毒梅毒*巨细胞病毒人疱疹病毒 6 型人疱疹病毒 7 型人疱疹病毒 8 型单纯疱疹病毒 1 型单纯疱疹病毒 2 型甲型流感病毒*金黄色葡萄球菌9白色念珠菌腺病毒*为可选验证的交叉反应病原体。（2）干扰物质应针对不同样本类型，分别评价可能存在的干扰情况。建议在每种干扰物质的潜在最大浓度( “最差条件”)进行评价，并在待测物的医学决定水平进行检测。潜在的干扰物质包括内源性、外源性和其他已报道的干扰物质。样本应至少选取
16、全血（或血红蛋白和白细胞）、人白蛋白、胆红素、甘油三酯、系统性红斑狼疮患者血、抗核抗体、类风湿因子等进行验证，并注明对被测物不产生干扰的最高限值。7.其他需注意问题对于适用多个机型的产品，应提供如产品说明书【适用机型】项中所列的所有型号仪器的性能评估资料。如适用于不同样本类型，应提交对不同样本类型一致性的验证，包括不同抗凝剂、采血管（如涉及）的验证。（五）阳性判断值研究资料申请人应考虑不同地理区域流行病学背景以及人口统计学特征（包括性别、地域、种族等因素）的差异，选择具有代表性的样本建立阳性判断值，注意应纳入一定数量的弱阳性样本。建议申请人从临床意义的角度出发，合理设定灰区范围并详细说明确定的
17、依据，并提供灰区的确定资料。如采用其他研究方法，应说明其合理性。对于荧光实时 PCR 方法即为用于结果判读的 Ct 值的确10定资料，包括确定基线阈值（threshold）和阈值循环数（Ct）的研究资料等。另外，建议申请人考虑建立阳性判断值时使用的受试者样本对于目标人群的代表性，通过临床评价进一步验证和确认阳性判断值的准确性。（六）稳定性研究资料稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。前者主要包括实时稳定性（有效期）、运输稳定性、开瓶稳定性及冻融次数限制等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案
18、、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。应对样本稳定性进行研究，主要包括室温保存、冷藏和冷冻条件下的有效期验证，可以在合理的温度范围内选择温度点（温度范围），每间隔一定的时间段即对储存样本进行全性能的分析验证，从而确认不同类型样本的效期稳定性。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进行评价。试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。（七）临床评价资料临床试验的开展、方案的制定以及报告的撰写等均应符合相关法规及体外诊断试剂临床试验技术指导原则（国家食品药品监督管理总局通告 2014 年第 16 号）的要求。
