1、1第一章 蛋白类生物活性物质本章要点1. 免疫球蛋白的基本概念、分布、结构与组成2. 牛乳中的免疫球蛋白3. 免疫球蛋白的生物学功能4. 乳铁蛋白的基本性质、生物活性及其影响因素5. 乳铁蛋白的分离方法6. 溶菌酶的基本性质、加工适应性及其在食品中的应用免疫球蛋白作为重要的蛋白类生物活性物质，目前有着比较广泛的研究背景和应用潜力，乳铁蛋白和溶菌酶等作为具有抑菌蛋白已经得到广泛的关注，因此本章介绍了它们的基本概念、来源与分布、结构与组成、生物活性等。第一节 免疫球蛋白免疫球蛋白（Immunoglobulin ，简称 Ig）是一类具有抗体活性，能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。免疫球蛋白不仅存在
2、于血液中，还存在于体液、粘膜分泌液以及 B 淋巴细胞膜中。它是构成体液免疫作用的主要物质，与补体结合后可杀死细菌和病毒，因此，可增强机体的防御能力。目前，食物来源的免疫球蛋白主要是来自乳、蛋等畜产品。特别是近年来人们对牛初乳和蛋黄来源的免疫球蛋白研究开发的较多。在牛初乳和常乳中，Ig 总含量分别为 50 和 0.6mgmL，其中约 8086为 IgG。人乳免疫球蛋白主要以 IgA 为主，含量为 4.14.75gg。从鸡蛋黄中提取的免疫球蛋白为 IgY，是鸡血清 IgG 在孵卵过程中转移至鸡蛋黄中形成的，其生理活性与鸡血清 IgG 极为相似，相对分子质量 164000。其活性易受到温度、 pH
3、的影响。当温度在60以上、pHIgG2。在牛初乳和分娩前乳腺分泌物中， IgG1 占总乳清蛋白的近80，在初乳乳清中浓度超过 100mgmL。牛 IgM 通常以四链单体的五聚物形式存在，沉降系数为 19S，IgM 单体经 J 链连接予以 IgM 较高的抗原结合效价，在补体和吞噬细胞参与下，其杀菌、溶菌、激活补体和促吞噬等作用均显著强于IgG。脾脏是 IgM 的主要合成部位。IgM 分子质量大，不能通过血管壁，几乎全部分布于血液中，占血清 Ig 总量的 510。机体感染后血液中最早产生的 Ig 是 IgM。鉴于 IgM 在血清中的半衰期（5 天左右）比 IgG 短，所以血清中特异性 IgM 含量
4、增高提示有近期感染，临床上测定血清特异性 IgM 含量有助于早期诊断。目前已知天然血型抗体、类风湿因子和冷凝集素等均为 IgM 类抗体。1965 年前后，一些研究者在牛体和血清中发现了分泌型 IgA。牛 IgA 最有趣的特性在于它在乳汁中相对浓度较低。在大多数其他牛外分泌物中，IgA 均为一种主要的免疫球蛋白，但在牛初乳和常乳中含量相对较低。分泌型 IgA 为人初乳中含量最高的 Ig，初产、年轻妇女乳汁 IgA 浓度以较快速度下降。牛初乳中 IgG 可部分替代 IgA 的生物功能。血清型 IgA 和分泌型 IgA 不能通过胎盘。婴儿在出生 46 个月后才能自身合成 IgA，需从母亲乳汁中获得分
5、泌型 IgA，这对婴儿抵抗呼吸道和消化道病原微生物的感染具有重要意义。这是大力提倡7母乳喂养的重要原因之一。五、Ig 的生物学功能Ig 的生物学功能和抑菌特性如表 16、表 17 所示。以下简要介绍 Ig 的几个主要生物学功能。表 16 各种 Ig 的生物学功能功能 IgM IgD IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA1 IgA2 IgE活化补体（经典途径） 活化补体（旁路途径） 胎盘通过性 体外分泌 结合细胞中性粒细胞 嗜酸性粒细胞 ？ ？ 嗜碱性粒细胞 淋巴细胞 乳突细胞 血小板 ？巨噬细胞 生物功能 凝集反应的主体在淋巴细胞表面存在在血管外体液中含量最多，对异物反应在消化道、气
6、管表面存在，对异物反应表 17 Ig 能抑制的微生物和毒素微生物 毒素Shigella dysenter Influen virus（毒素）Shigella flexncri 1 Diptheria toxinShigella flexncri 6 Tetanus toxinShigella sonnei StreptolysinSalmonela Poli virus（毒素）Escherichia coli oill： B4Bacteroides fraglisStreptococciPneumococci（一）与相应抗原特异性结合免疫球蛋白最主要的功能是能与相应抗原特异性结合，在体外引起各
7、种抗原-抗体的反应。抗原可以是侵入人体的菌体、病毒或毒素，它们被 Ig 特异性结合后便丧失破坏机体健康的能力。需指出，若 Ig 发生变性，空间构象发生变化便可能无法与抗原发生特异性结合，即丧失了相应的抗病能力。（二）活化补体IgG13 和 IgM 与相应抗原结合后，可活化补体经典途径（Classical pathway，CP） ，即抗原抗体复合物刺激补体固有成分 C1C9 发生酶促连锁反应，产生一系列生物学效应，最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。通常 Ig 分子呈“T”型，与抗原结合后发生构型改变而呈“Y ”型，此时 IgG 分子中原来被掩盖的 CH2 功能区即补体结合点所在处得以暴露，从而
8、使 C19 与该区补体结合点结合，启动活化途径。8IgG13 的补体结合点位于 CH2 功能区，而 IgM 的补体结合点则位于 CH3 功能区。两类 Ig 活化补体的能力也有所不同，一般地，一个 IgM 分子就可活化补体经典途径。IgA 和 IgE 不能通过经典途径激活补体，但它们的凝聚物能活化补体旁路途径（Alternative pathway，AP） 。（三）结合细胞产生多种生物学效应免疫球蛋白（Ig）能够通过其 FC 段与多种细胞（表面具有相应 FC 受体）结合，从而产生多种不同的生物效应。（四）通过胎盘传递免疫力Ig 的转移方式，不同类型的 Ig 在不同的动物的母体和幼体间有不同的 I
9、g 转移方式，对于在多种病原菌中出生的幼体，母亲传递给幼体多种抑菌物质，Ig 是其中最主要的一种。第二节 乳铁蛋白近年来，乳铁蛋白（Lf）的研究受到广泛重视。1993 年在日本召开了第一届乳铁蛋白（Lf）的结构与功能的国际会议，会上研究者就 Lf 的铁结合机制、生物功能、医学临床应用和食品中的应用进行了探讨，这标志着 Lf 特有的生物学意义已受到世界范围的广泛重视。一、Lf 的基本性质（一）Lf 的基本结构和组成乳铁蛋白是一种天然蛋白质的降解物，存在于牛乳和母乳中。乳铁蛋白晶体呈红色，是一种铁结合性糖蛋白，相对分子质量为 771001500。牛乳铁蛋白的等电点（pI ）为 8，比乳铁蛋白高 2
10、 个 pH 单位。在 1 分子乳铁蛋白中，含有 2 个铁结合部位。其分子由单一肽键构成，谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和丙氨酸的含量较高；除含少量半胱氨酸外，几乎不含其他含硫氨基酸；终端含有一个丙氨酸基团。1939 年，Sorensen 等人在分离乳清蛋白时得到一种红色蛋白， Polis 等人在分离 Lp 时也得到部分纯化的红色蛋白，但直到 1959 年 Groves 用色谱法得到纯的红色物质后，才确认这种红色物质是一种含铁蛋白质，称之为乳铁蛋白（Lactoferrin，Lf） ，又称红蛋白。通过 Lf 的组成和氨基酸顺序分析，证明它是由转铁蛋白（Transferrin，Tf）演变而来。各种哺乳动物
11、（如人、羊、牛）的乳铁蛋白在氨基酸排列上有较小的差异。Lf 的相对分子质量是770002000，它是一种铁结合糖蛋白，1 分子 Lf 能结合两个 Fe3 离子，含 1516 个甘露糖，56个半乳糖，1011 个乙酰葡萄糖胺和 1 个唾液酸，其中中性糖 8.5，氨糖 2.7。乳清 Lf 和初乳 Lf 有相同的性质。X 光衍射实验（XRD）表明，其主体呈无柄银杏叶并列状结构，铁离子结合在两叶的切入部位，Fe 离子的间隔为 0.280.43m，椭圆形叶的大小为 0.55m0.35m0.35m 。乳铁蛋白由乳腺合成，分娩后乳腺合成 Lf 的能力减弱，故其含量在分娩几天后迅速下降。乳铁蛋白是由血清中转移
12、而来。现已证明乳铁蛋白有两种分子形态，相对分子质量为 86 000 和 82 000，其主要差别在于它们所含的糖类不同，经溴化氰切断和脱糖化实验证实 Lf 是以复相分子形式存在，它们的生理功能的差别尚不清楚。（二）Lf 的金属结合性质1 分子饱和 Lf 中含两个 Fe3 离子。乳铁蛋白不仅能结合 Fe3 ，且对 Cu2 也有结合作用，其结合能力也是每个 Lf 分子含两个 Cu2 。在乳铁蛋白和 Fe 或 Cu 形成络合物的过程中有碳酸氢盐的参与，Fe 或 Cu 和碳酸氢盐的比例为 11，碳酸氢盐的存在对络合物的生成有催化作用。维生素 C 对缺铁Lf 的饱和过程也有催化作用，维生素 C 的存在有
13、利于饱和 Lf 的形成，Tf 也有类似的性质。用 XRD 实验证实，Tf 的铁结合 2 个酪氨酸，1 个组氨酸， 1 个天冬氨酸和碳酸根，碳酸根上连接 1 个精氨酸和水分子，这种模式是否和 Lf 一样，尚需实验的进一步证实。9（三）Lf 的热力学性质对加热 Lf 的抗原性和其它生物活性进行分析的结果表明：缺铁乳铁蛋白 pH7 时胶凝，pH7 时不沉淀，pH4.0 时 90100 、5min 的加热，对 Lf 的铁结合能力、抗菌性没有影响；在pH2.03.0，100120，加热 5min 后，Lf 明显地降解，但其抑菌活性反而增强。对多种乳清蛋白的热变性温度的研究表明，饱和 Lf 有两个变性峰（
14、69.0和 83.5） ，不饱和 Lf有一个变性峰（64.7） 。第一个峰是一铁离子 Lf，第二个峰是二铁离子 Lf；一铁 Lf 和二铁 Lf 的变性焓分别是 2100kJmol 和 2900kJmol。二、Lf 的生物活性及其影响因素（一）Lf 的生物活性乳铁蛋白具有结合并转运铁的能力，到达人体肠道的特殊接受细胞中后再释放出铁，这样就能增强铁的吸收利用率，降低有效铁的使用量，减少铁的负面影响。乳铁蛋白对铁的结合，避免了人体内 OH有害物质的生成。超氧离子 O2和抗坏血酸盐或H2O2 反应能产生高反应活性的 OH，这种 OH被认为是一种对人体有害的物质，O 2 和 H2O2 的反应称之为 Ha
15、berWeiss 反应，它在过渡元素（如 Fe）的催化下进行反应。该反应的产物 OH能杀死几乎所有的微生物生物分子和诱导脂氧化。乳铁蛋白还有多种生物活性，归纳起来有以下几个方面：刺激肠道中铁的吸收。抑菌作用，抗病毒效应。调节吞噬细胞功能。调节发炎反应，抑制感染部位炎症。抑制由于 Fe2 引起的脂氧化，Fe 2 或 Fe3 的生物还原剂（如抗坏血酸盐）是脂氧化的诱导剂。（二）Lf 生物活性的影响因素乳铁蛋白的生物活性受多种因素的制约，盐类、铁含量、pH、抗体或其他免疫物质、介质等均有影响。它的铁含量对其抑菌作用有决定性作用，碳酸盐的存在可明显增强其抑菌能力，而柠檬酸盐的增加却明显减弱其抑菌能力。
16、另外，它的抑菌效果还与 pH 密切相关，在 pH7.4 时效果明显高于pH6.8，pH6 基本无抑菌作用。铁饱和程度的影响：乳铁蛋白的铁含量对抑菌有决定性作用，如从乳房炎中分离的大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌类在一定的合成介质中均被缺铁乳铁蛋白抑制，这种抑制作用因加入 Fe3+使其饱和而消失，说明了乳铁蛋白抑菌作用的铁依赖性，它的抗脂氧化有类似结果。盐类作用：在上述实验中，碳酸盐的存在可明显增强乳铁蛋白的抑菌能力，柠檬酸盐的增加明显减弱了缺铁乳铁蛋白对三种菌的抑制。乳汁的实际抑菌作用和其分泌的乳铁蛋白与柠檬酸盐的比例有关，其实质仍是二者竞争 Fe3+使微生物可对铁利用，因而减弱了抑制能力。pH 的
17、影响：乳铁蛋白的抑菌效果和 pH 密切相关，在 pH7.4 时效果明显高于 pH6.8，pH6 基本无抑菌作用。抗体或其它免疫物质间的协同作用：研究表明乳铁蛋白和 IgA 抑菌有协同作用，Sarllson 等人也得出相同结论。介质的作用：金黄色葡萄球菌用 I125 示踪蛋白实验表明：85能和 Lf 稳定结合，其它部分很少或不能结合，其介质以血液、胨琼脂较好，盐汁或富盐脱脂乳较差，最适 pH 为 4.07.0。形态：Lf 的生物活性和其形态有关，如 10水解的 Lf 有最好的抑菌效果，HPLC 法分析有 8种 Lf 的降解肽存在。动物的种类：Lf 的活性和动物的种类相关，人、牛、羊等乳汁中 Lf
18、 的含量和结构稍有不同，在许多体液、组织液（如唾液、鼻汁、胆汁、精液、泪等）均有 Lf 存在，它们在这些部分参与生物调解作用。10Lf 对多种病原菌有抑制作用，服用含 Lf 的食品或制剂，对抑制肠道的病原菌，增加有益菌类和平衡肠道菌群，均有较好的作用。三、Lf 的分离方法目前报道的 Lf 分离方法很多，主要有色谱法（吸附色谱法、离子交换色谱法、亲合色谱法、固定化单系抗体法等）和超滤法。色谱法的优点是分离效果好、纯度高，抗体被固定化可重复使用，其缺点是柱的制备工艺复杂，抗体成本昂贵，难以工业化生产。超滤法操作简便，费用相对较低，易于形成工业化规模，其缺点是乳铁蛋白纯度较低，膜需经常清洗。超滤法是
19、生产食品用乳铁蛋白最具实现工业化潜力的方法之一。第三节 溶菌酶溶菌酶（Lysozyme，Lz，EC（3.2.1.17） ）又称胞壁质酶（Muramidase）或 N乙酰胞壁质聚糖水解酶（NAcetyl muramide glycanohydralase） ，它于 1922 年由英国细菌学家 Fleming 在人的眼泪和唾液中发现并命名。它广泛存在于鸟、家禽的蛋清,哺乳动物的眼泪、唾液、血浆、尿、乳汁和组织（如肝肾）细胞中，其中以蛋清中含量最为丰富，而人的眼泪、唾液中的 Lz 活力远高于蛋清中 Lz 的活力。一、Lz 的基本性质Lz 是一种碱性球蛋白，广泛存在于鸟和家禽的蛋清中。其酶蛋白性质稳定
20、，对热稳定性很高。母乳中的 Lz 活力比鸡蛋清 Lz 高 3 倍，比牛乳 Lz 高 6 倍。 Lz 是由 129 个氨基酸组成，相对分子质量14 200，等电点为 pH10.711.0，分子内有 4 个二硫键交联，对热极为稳定。 Shahani 等人报告牛乳的 Lz 相对分子质量为 18 000，一级结构尚未确定。人乳 Lz 和 乳白蛋白的一级结构有 74是相同的，乳白蛋白是人乳中含量较多的蛋白质，它对于乳腺中乳糖的合成是必不可少的，是乳糖合成酶的辅酶。溶菌酶和 乳白蛋白在生物学上是同源的，但它们的三级结构有着很大的差异。Lz通过其肽键中第 35 位的谷氨酸和第 52 位的天门冬氨酸构成的活性
21、部位，水解破坏组成微生物细胞壁的 N乙酰葡萄糖胺与 N乙酰胞壁质酸间的 （1， 4）糖苷键，使菌体细胞壁溶解而起到杀死球菌的作用。Lz 在人血清中含量平均为 0.6l.0mg100mL，人初乳中达 40mg100mL，牛乳中的含量约为人乳的 13000，目前在人、猪、猫、兔、马、驴、猴乳中均发现有 Lz 存在，羊、山羊的乳中仅有微量的 Lz。二、Lz 的加工适应性（一）热稳定性Lz 在酸性 pH 下是稳定的，此时 100的加热对 Lz 仅有很小的活力损失。在 pH4.5（100，3min） 、pH5.29（100，3min ）下加热 Lz 是稳定的。一般认为 Lz 在酸性条件下稳定，在碱性条件不稳定。Genentech 和 Genoneor 两公司用遗传工程的方法生产出一种改性溶菌酶，此酶中有一种新的二硫键，这个键通过稳定酶的四级结构而增加了溶菌酶的热力学稳定性，使其在食品防腐方面更为有效。糖和聚烯烃类能增加 Lz 的热稳定性，NaCl 对 Lz 也有抗热变性作用，而且盐溶液的存在对 Lz 的活力是十分必要的。在低盐浓度时，Lz 的活化和离子强度密切相关，在高盐浓度时 Lz 的活力受到抑制，阳离子的价态愈高则其抑制作用愈强。具有COOH 和SH 3OH 基的多糖对 Lz 活力有抑制作用。
