1、内蒙古科技大学本科生毕业论文论文题目NF1AMINIGENE构建与鉴定学生姓名学号1168149122专业生物技术班级生技2011指导老师副教授内蒙古科技大学本科生毕业论文INF1AMINIGENE构建与鉴定摘要人类I型神经纤维瘤病NEUROFIBROMATOSISTYPEI，NF1是最常见常染色体的显性遗传性肿瘤疾病中的一种，其主要的发病机制为NF1基因的突变缺失。可变剪接剪接因子导致真核基因呈现复杂程度从而显示蛋白质拥有多样性。本论文主要论述了可变剪接的机理，NF1基因的结构与功能，以及NF1前体MRNA的编辑。本实验提取了人体外周血基因组DNA，设计了两对引物，利用PCR方法扩增NF1基
2、因并导入PCDNA31质粒载体从而构建了NF1AMINIGENE基因，为后续NF1的MRNA前体可变剪接以及调控NF1剪接因子的研究奠定了基础。关键词可变剪接；NF1基因；载体内蒙古科技大学本科生毕业论文IICONSTRUCTIONANDIDENTIFICATIONOFNF1AMINIGENEABSTRACTNEUROFIBROMATOSISTYPE1NF1ISONEOFTHEMOSTCOMMONHERITABLEAUTOSOMALDOMINANTDISORDERSALTERNATIVESPLICINGMODULATESTHEFUNCTIONOFNEUROFIBROMIN,THENF1GENE
3、PRODUCT,BYINSERTINGTHEINFRAMEEXON23AINTOTHEREGIONOFNF1MRNATHATENCODESTHEGTPASEACTIVATINGPROTEINRELATEDDOMAINTHISPAPERMAINLYDISCUSSESTHEMECHANISMOFALTERNATIVESPLICING,THESTRUCTUREANDFUNCTIONOFNF1GENE,WHICHINTRODUCESTHEVARIABLESPLICINGOFMRNAPRECURSORNF1ANDTHESPLICINGFACTOROFNF1VARIANTSPLICINGINTHEREGU
4、LATIONOFTHEVARIABLESPLICINGTHEEXTRACTIONOFTHEHUMANPERIPHERALBLOODGENOMICDNAPCRAMPLIFIEDTHENF1GENENF1GENEANDPCDNA31CARRIERSFORENZYMELINKEDCONSTRUCTTHENF1AMINEGENEGENETHISSTUDYLAIDAFOUNDATIONFORTHEFOLLOWINGRESEARCHONMRNANF1PRECURSORANDTHEREGULATIONOFNF1SPLICINGFACTORKEYWORDSALTERNATIVESPLICINGNF1GENEV
5、ACTOR内蒙古科技大学本科生毕业论文I目录摘要IABSTRACTII第一章文献综述111可变剪接的概述错误未定义书签。12可变剪接的主要形式错误未定义书签。13可变剪接的基本机制错误未定义书签。131剪接增强子与沉默子错误未定义书签。132剪接体的组装错误未定义书签。14可变剪接的生物学意义错误未定义书签。15NF1基因概述错误未定义书签。151NF1基因的结构错误未定义书签。152NF1基因的功能错误未定义书签。16NF1MRNA编辑错误未定义书签。17肿瘤抑制基因的前体MRNA可变剪接错误未定义书签。第二章引言错误未定义书签。第三章实验材料与方法131实验材料错误未定义书签。311材料处
6、理错误未定义书签。312实验主要化学试剂错误未定义书签。313实验主要仪器错误未定义书签。314试剂的配制错误未定义书签。315琼脂糖凝胶电泳试剂的配制错误未定义书签。32实验方法错误未定义书签。321人类基因组DNA的提取错误未定义书签。内蒙古科技大学本科生毕业论文II322NF1基因的PCR扩增错误未定义书签。3221引物的设计错误未定义书签。3222PCR反应体系（25L）的建立错误未定义书签。323浓度的测定及电泳检测错误未定义书签。3231浓度的测定错误未定义书签。3232琼脂糖凝胶电泳错误未定义书签。324PCR产物的纯化错误未定义书签。325PCDNA31载体提取与转化错误未定义
7、书签。3251PCDNA31质粒的小量提取（碱裂解法）错误未定义书签。3252PCDNA31质粒载体图谱错误未定义书签。3253大肠杆菌DH5感受态细胞的制备错误未定义书签。3254PCDNA31载体转化大肠杆菌DH5错误未定义书签。326NF1AMINIGENE基因的构建错误未定义书签。3261NF1基因与PCDNA31质粒载体双酶切错误未定义书签。3262双酶切产物的纯化错误未定义书签。3263酶连错误未定义书签。327重组质粒的提取试剂盒法错误未定义书签。328菌落PCR的鉴定错误未定义书签。3281重组质粒的PCR扩增错误未定义书签。3282重组质粒的酶切错误未定义书签。第四章结果讨论
8、与分析1741人类基因组的提取1742目的片段的扩增与纯化18421目的片段的扩增18422PCR产物的纯化19内蒙古科技大学本科生毕业论文III43PCDNA31载体的制备21431大肠杆菌DH5感受态细胞的制备21432PCDNA31质粒的小量提取（碱裂解法）2144NFIA基因目的片段和PCDNA31载体双酶切2245酶连2346重组质粒的鉴定23第五章结论及后续研究展望2551结论2552后续研究与展望28参考文献28致谢33内蒙古科技大学本科生毕业论文1第一章文献综述11可变剪接的概述一些MRNA前体通过某种特异性的剪接方式而产生具有特异性的MRNA剪接异构体被称为可变剪接，也叫选择
9、性剪接（ALTERNATIVESPLICING）1。对于一些成熟的MRNA是通过真核细胞核内可变剪接的剪接因子利用5端加帽、切除内含子、3末端加尾切割等一些基本的生物体加工，就形成了大家所共识的MRNA，这些物质从而可以参与选择性降解参与翻译同时形成复合物输出核外2。我们所熟知的MRNA可变剪接包括外显子剪接，外显子跳跃，互斥可变外显子等，可以使10000多个外显子不同程度发生可变剪接，这些众多的外显子位于人体绝大部分细胞和组织块中，丰富了人体系统的多样性。已有实验研究表明，一些剪接因子从人体的生长发育方面进行一些控制调节并产生生物学受体多样性以及复杂性等方面起决定性作用3。对于人类绝大部分可
10、变剪接的基因他们一方面表达与神经系统和免疫系统，另一方面则对转录调控以及信号转导所包括的突出兴奋性调节和离子通道动力学的调节4。对于这些基因异常的可变剪接可导致特异性剪接型和神经胶质瘤系统功能的异常MRNA的异位表达5。因此，此领域的研究越来越到人类的重视。12可变剪接的主要形式对于可变剪接的研究，不同时期有不同的可变剪接类型，本轮为可变剪接的类型是综合了以往的剪接研究大致分为七种类型如下如图11所示，分别为内含子保留A、可变5剪接位点B、可变3剪接位点C、外显子跳过D、互斥可变外显子E、可变启动子F和可变POLYAG6。内蒙古科技大学本科生毕业论文2图11可变剪接的基本类型13可变剪接的基本
11、机制131剪接增强子与沉默子MRNA的剪接是由剪接体实现的。内含子边界序列在剪接体组装过程中进行识别。它的保守性序列位于内含子的5和3边界，这段序列粘合度比较高7。许多隐蔽的类似的边界序列常常位于剪接体的内部，从而使MRNA剪接有一套正确的机制来防范。目前已发现，顺式作用序列元件可以辅助真假剪接位点的识别8。这些顺式作用原件与MRNA前体组成多聚体，从而调节剪接体的组装9。要保持这种剪接的平衡必须需要外显子的保留和跳过这些竞争的协调作用10。而这些调控元件其相对生物活性又由相应的因子包括剪接调控因子以及生物活性因子的结合来决定。许多ESES顺式作用元件其分子内包含SRP家族成员活性因子的结合位
12、点11。ESSS和ISSS分布于相应的剪接因子序列中，与反式作用因子例如核内不均一核糖核蛋白（HNRNP）与HNRNPS等家族成员结合抑制剪接的发生12。HNRNPS包含HNRNPA1、多聚嘧啶序列结合蛋白（PTBHNRNPI）、果蝇SXL基因等。由于反式作用因子不再与剪接因子协调作用反而抵抗剪接因子（如SNRNPS）结合到剪接识别位点，有的甚至是导致外显子环出，从而抑制剪接体的组装从而阻碍可变剪接的发生13。我们以果蝇TRAMRNA前体的可变剪接为例，对于雌性个体在TRAMRNA前体SXL蛋白处结合到上游3剪接位点的多聚嘧啶结合位点不在进行前进这样便阻止了U2AF的结合，抑制了该位点的剪接，
13、前体SXL蛋白与其下游的3剪接位点结合U2AF而非我们正常认为的SXL，所以该位点发生剪接。PTBHNRNPI的剪接抑制作用则是通过与AF正向结合14。而相对于HNRNPA1，它的的可变剪接调控作用是通过其与U2AF结合抑制SRP与剪接识别位点结合，这样双重作用使得剪内蒙古科技大学本科生毕业论文3接增强子与剪接沉默子在剪接体组装过程中发挥很重要的作用15。图12顺势作用原件结合MRNA对可变剪接调控示意图注各种剪接调控因子结合在外显子和内含子中的调控元件上矩形框是外显子,波浪线是内含子。132剪接体的组装剪接体的组装过程大致如下16首先是定型复合物（ECOMPLEX）的形成，U1SNRNP与5
14、剪接位点结合成二聚体并与RNARNP间的碱基配对，从而使SF1剪接因子不再附着于分支点结合蛋白，而是分支点结合蛋白与SF2去结合，达到形成二聚体的效果。U2SNRNP辅助因子小亚基（U2AF35）和U2AF65与U3AF65分别与多嘧啶序列结合C从而反馈剪接体，使其独立完成与U1SNRNP的组装。富含丝氨酸精氨酸蛋白（SRP）结合到外显子，首次完成SRP与U4SNRNP的复合，其次是U2SNRNP与分支点序列结合形成前剪接复合体（ACOMPLEX），完成内含子的切除与外显子的连接，形成剪接体（BCOMPLEX）17。如图12所示14可变剪接的生物学意义可变剪接是一种高效率产生基因组复杂程度与蛋
15、白质功能多样性的生物学机制。这种高频率、高丰度的生物学机制产生种属特异性剪接产物，可能不会对一些组织和细胞功能产生很大的影响，但是从理论角度更可能是保持特异基因的活性使基因呈现出高表达的状态，从而丰富了蛋白质组其在生物界功能的复杂性和其相对功能的多样性。同时，一些生物学家利用测序和微阵列分析的统计结果不同程度表明，在具有不同细胞分化类型切其蛋白功能复杂的组织块，如大脑、睾丸、乳腺，或者在经过自然选择的压力下需提供生物学竞争机制不同功能的组织或者个体细胞，例如人类免疫系统中，这些组织块和细胞上内蒙古科技大学本科生毕业论文4的正常的基因更易发生剪接体组装从而发生可变剪接，那么它们就会利用有限的基因
16、，从而去满足机体系统功能多样性以及适应性的需求18。例如，果蝇的雌性受体内MRNA的互调，可变互斥外显子等一些家族受体唐氏综合征细胞黏附分子参与其吞噬功能19。而对于一些我们常见的高等生物，其体内的转录产物前体MRNA可变剪接是一种相对于低等生物十分普遍的生物自然现象。当然了，其实并非我们所想象，具有编码功能与生物学活性功能的物质均为所有的可变剪接产生的。举个例子，与人类基因类似的大鼠，它的已知序列的基因组转录产物中，并不是像其他生物，它的转录物质就约三分之一的剪接产物不再产生蛋白质功能多样性而是引入前移的终止密码子（PTCS），从而不再翻译。大鼠体内的NMD这种生物分子则可能是一种监控可变剪
17、接以及诱导剪接因子包括剪接增强子与沉默子失活而发生错误的机制20。15NF1基因概述151NF1基因的结构I型神经纤维瘤病NEUROFIBROMATOSISTYPEI,NF1是最常见的显性遗传性疾病中的一种，影响着世界上1/3000的人口，它的临床特征表现不一21。20世纪90年代年前后发现一种基因在这种病人中缺失，即所谓的NF1基因。现在对NF1基因结构、产物及功能还有很多不清楚的地方，但对它的研究已经越来越受到重视，进展很快。NF1基因大约30KB，位于染色体17Q112区域，转录产物约1113KB。NF1基因位点的突变率为104，相对于一般单位点基因的突变率高约10倍，自发突变率非常高，
18、而3050的情况下都是新的突变，仅基因大小是不能解释NF1基因这种高突变率现象的，就基因大小来说比一般基因的突变率最多高出10倍，而实际上高出100倍，现在还没有资料能表明基因中存在有突变热点22。对于NF1基因中内含子与外显子之间界限的确切位置正在研究，但通过基因组内蒙古科技大学本科生毕业论文5SOUTHERNBLOT实验估计其外显子数目很多，不少于20个23。152NF1基因的功能NF1基因主要编码神经纤维瘤素，它是一个由多种氨基酸组成的蛋白质复合体。该物质物其相对分子质量32700，是一种肿瘤抑制剂。神经纤维瘤素其剪接外显子23A的NF1MRNA的主要功能区称之为GRD，它是由NF1基因
19、第2127A外显子编码提示RAS通路和CAMP通路，能够激活体内的RASGTPASE这种酶，因此所以说功能区GRD是RASMRNA前体信号转导的一种负性调节因子。其中23A外显子编码GTP酶激活蛋白相关的区域。研究表明，除负性调节活动之外，还可正向调节细胞CAMP的水平24。神经纤维瘤素23A外显子编码GTP酶激活蛋白可以通过激活RISP1途径调节星形细胞内经过环化后CAMP的生成，从而促进星形细胞的生长25。TATA盒结合蛋白相关因子2能结合于果蝇幼虫NF1的启动子区使其转录上调，从而使细胞内MRNA增加26。在可变剪接我们介绍了果蝇DXL蛋白，而最新的一项在果蝇雌性幼虫性染色体中的研究显示
20、，神经纤维瘤素是则是分贝与RAS2和RAS2的GAP相辅相成，那么可以认为NF1基因的缺失或者突变是在RAS2和RAS2的GAP中发生并可变剪接可导致雌性果蝇幼虫生长发育得到延缓与抑制27。研究认为，经纤维瘤素通过23A外显子从而去与微管蛋白的结合正向反馈功能区GRD的原因则可能与儿童智能障碍发生率高有关28。同时也有研究表明，NF1基因具有经典肿瘤抑制基因的特点，其突变位点可干扰信号通路并对肿瘤发生抑制作用29。图13NF1基因的结构示意图内蒙古科技大学本科生毕业论文6第二章引言基因异常的可变剪接对于生物体内的组织和细胞产生巨大的影响作用，一方面可导致神经系统功能的异常和脑特异性剪接型MRN
21、A的不正常表达，另一方面会对身体内的一些抑癌基因产生破坏作用，从而引发一些肿瘤癌疾病的发生。NF1基因的表达水平在多个水平上受到调控，导致了NF1基因MRNA和蛋白翻译水平的表达在短时间内即有较大变化。蛋白与NF1MRNA或蛋白产物结合会引起蛋白产物降解可被视为对NF1基因可变剪接表达的调控，目前仅有一种蛋白肿瘤抗原HUR已知可与NF1MRNA相互作用，在这里仅指NF123A外显子编码区域，HU蛋白可与肿瘤抗原发生作用38。由于该病的遗传学本质，近几年来，在新治疗方向的研究领域中主要在基因、生物两个方面39。对本病的分子生物学，并使得该病在分子生物学、基因药物、基因克隆治疗方面取得了长足的进步
22、，而其在分子水平的发病机制也初步了解清楚。本实验人体外周血取自于包头市第一附属医院，DNA的提取采用试剂盒法，提取人体外周血中的DNA，通过紫外分光光度仪测量DNA浓度，用样孔法琼脂糖横向电泳进一步检测提取的人类外周血全基因组DNA。经过多次试验筛选，优化优化再优化从而获得最优PCR体系和反应程序。然后将PCR产物用进行纯化，之后将纯化后的PCR产物和PCDNA31同时进行双酶切，进行酶连。酶连之后的重组产物涂布于含有氨苄青霉素的培养皿内，经过1216H,观察菌落是否长出。菌落长出，进行挑菌，摇菌过夜培养，接下来进行转化后质粒提取，最后一步质粒酶切和PCR，观察电泳图，是否与之前PCR扩增的产
23、物片段大小一致。从血液中提取了全基因组DNA，利用PCR方法扩增NF1A基因并转化到PCDNA31载体从而构建了NF1AMINIGENE基因，为后续NF1MRNA前体可变内蒙古科技大学本科生毕业论文7剪接的研究及治疗NF1疾病奠定基础。本实验基本技术路线如下DNA提取PCR扩增电泳检测PCR产物纯化电泳检测纯化产物双酶切电泳检测PCDNA31质粒提取质粒纯化电泳检测质粒双酶切电泳检测酶连DH5感受态细胞转化重组质粒提取，质粒PCR和酶切菌落鉴定，挑菌，摇菌图21实验技术路线示意图内蒙古科技大学本科生毕业论文8第三章实验材料与方法31实验材料311材料处理实验血液取自于包头市第一附属医院，血液中
24、一部分加有抗凝剂，一部分作为对照试验未加入抗凝剂。取血液过程中，把血液放在冰上，这样一方面可以保持血液的新鲜性，另一方面血液可以作为对照试验同时不会染菌。之后把血液包于纱布，经液氮快速冷冻后置于80冰箱保存以为备用。图31血液样品312实验主要化学试剂内蒙古科技大学本科生毕业论文9表31实验主要化学试剂药剂级别生产厂商酵母提取物分析纯OXOIDLTD,ENGLAND蛋白胨分析纯OXOIDLTD,ENGLAND琼脂分析纯JAPANBACTERIOLOGICAL无水CACL2分析纯天津市凯通化学试剂有限公司EDTA2NA分析纯AMRESCO,AMERICANACL分析纯北京化工厂琼脂糖分析纯JAP
25、ANBACTERIOLOGICAL无水乙醇分析纯北京化工厂TAG酶NEBDNTP混合液NEB313实验所用仪器分类表32实验主要仪器仪器名称编号公司制冰机XB70宁波格兰特有限公司加热恒温培养箱凝胶成像仪DHP9272上海一恒科技有限公司THZC1GENEGENIUS美国314试剂的配制（1）LB培养基胰蛋白胨2G，酵母提取物1G，NACL2G，琼脂（固体时加入03G）定容至200ML,121灭菌20MIN。4保存。（2）溶液II（现配现用）先加DDH2O132ML，再加10SDS150L，再加NAOH（10MOL/L）30L，4保存，无需灭菌。（3）溶液I取葡萄糖049G，加入TRISHCL
26、（1MOL/LPH80）125ML，加入EDTA（02MOL/L），再加入H2O定容至50ML,4保存，无需灭菌。（4）5MOL/LKAC（K3MOL/L；HAC5MOL/L）称取2944GKAC和3194ML内蒙古科技大学本科生毕业论文1036乙酸，加水溶解定容至100ML。（5）NAOH（10MOL/L）溶液取氢氧化钠40G，加入水95ML，再加H2O定容至100ML，室温保存，无需灭菌。（6）溶液III（在通风橱中进行）取KAC147G，加入冰乙酸575ML，再加H2O溶解后定容至50ML,4保存，无需灭菌。（7）SDS提取缓冲液称取1461GNACL用DEPC水溶解。315琼脂糖凝胶电
27、泳试剂的配制（1）10TAE电泳缓冲液（100ML）称取242GTRIS、372GEDTANA2H2O于100ML的烧杯中加DEPC水溶解，量取57ML冰乙酸于烧杯中混匀，定容至100ML灭菌后4保存。（2）EB（10MG/ML）100MG的EB溶于10ML水中，室温条件下避光保存。32实验方法321人类基因组DNA的提取伴随分子生物学技术的快速发展，基因分析在临床上得应用也更加广泛，提取DNA保证它的纯度，没有RNA，蛋白及其他酚类杂质，为后续的实验奠定基础。322NF1基因的PCR扩增3221引物的设计在校园网NCBI上找到人类NF1基因序列，采用GENETOOL软件在NF123A外显子上
28、游863BP到下游499BP处设计NF1A两对引物，从而进行NF1AMINIGENNE的构建，如下图所示上游引物ATAAGCTTCACATGAAAGCAATATCTGCC下游引物AGAAGCTTCGTACAAGCCAACATTPCR扩增后NF1A为1410BP。内蒙古科技大学本科生毕业论文11图3223A外显子上游863BP到下游499BP3222PCR反应体系（25L）的建立1采用分装法进行PCR扩增，经过多次筛选与优化，最终确定为25L反应体系。如下表所示表33PCR反应体系试剂体积BUFFER25LDNTP05L上游引物（10MOL/L）1L下游引物（10MOL/L）1LDNA模板3LM
29、G205LTAQDNA聚合酶05LDDH2O15L（2）PCR反应程序预变性9830SEC变性9815SEC退火58150SEC30个循环延伸72150SEC复性7210MIN4保存323浓度的测定及电泳检测3231浓度的测定吸取DNA提取液12L，在紫外可见分光光度计上测定DNA的浓度、OD260/OD280和OD260/OD230，根据这三个参考指标来判断提取的DNA好坏。内蒙古科技大学本科生毕业论文123232琼脂糖凝胶电泳324PCR产物的纯化325PCDNA31载体提取与转化3251PCDNA31质粒的小量提取（碱裂解法）实验基本步骤（1）取过夜培养的大肠杆菌菌液1ML于15MLEP
30、管中，410000RPM离心10MIN，弃上清。再加1MLECOLI菌液，10000RPM离心M8IN，弃上清。（2）加入预冷的溶液I150L，用移液枪轻轻打匀，立刻放到冰上。（3）加新配置的溶液II300L，用移液枪轻柔打匀45次（不能剧烈振荡，DNA容易断裂），放置于冰上4MIN。（4）加入400800L酚氯仿异戊醇，抽提5MIN，4，10000RPM，离心15MIN，转移上清至新的15MLEP管。（5）加入两倍体积的20预冷的无水乙醇，充分混匀，20沉淀30MIN到1H。离心弃上清。（6）乙醇洗涤，离心晾干。（7）加入50LTE溶解，琼脂糖凝胶电泳检测，检测过程中注意正负极的区分。325
31、2PCDNA31质粒载体图谱图31PCDNA31质粒载体图谱内蒙古科技大学本科生毕业论文133253制备大肠杆菌感受态细胞具体实验步骤（1）取1MLCOLI放入50MLLB液体培养基中，37200RPM，3H培养（最佳时机为对数生长期）。（2）预冷0LMOL/LCACL2，预冷15MLEP管中。（3）将扩配液倒入EP管中，冰浴半个小时。（4）4000RPM离心8MIN，轻轻弃上清，立即放入冰盒内。（5）加入10MLCACL2，立即放在冰上，半小时。（6）4000RPM离心8MIN，并轻轻混匀。（7）加入800L菌液，冷冻36小时。326NF1AMINIGENE基因的构建3261NF1基因与PC
32、DNA31质粒载体双酶切如下图所示NF1基因片段双酶切体系表34NF1基因片段双酶切体系反应组分体积DNA7LBUFFER2LBAMHI05LHINDIII05LDDH2O10L总体积20L注一般最后加入一般最后在冰上加入BAMHI，HINDIII。使液体集中于管底，37酶切12H。注一般最后加入一般最后在冰上加入BAMHI，HINDIII。混匀后短暂离心，使液体集中于管底，37酶切12H。内蒙古科技大学本科生毕业论文143262双酶切产物的纯化纯化过程中尽量在超净工作台内进行，以防止杂菌污染，在工作前，紫外杀菌半小时。3263酶连如下图所示将NF1基因与PCDNA31载体酶连体系表34NF1
33、基因与PCDNA31载体酶连体系反应组分体积NF1基因8LPCDNA316L10BUFFER3LT4DNALIGASE2LDDH2O6L总体积25L混匀后短暂离心，使液体集中于管底，37连接112H。327重组质粒的提取试剂盒法从平板中进行菌落挑菌培养，对菌落中的重组进行提取。在提取重组质粒时采用此试剂盒法，提取到的重组质粒纯度高，准备工作处理一些试剂，比如加入无水乙醇，贴上标签等。328菌落PCR的鉴定在上一步提取了菌落中的重组质粒，下一步将进行产物的鉴定。3281重组质粒的PCR扩增1在灭过菌的02ML离心管中依次加入下列试剂，轻轻混匀，短暂离心，在PCR仪上进行反应。内蒙古科技大学本科生
34、毕业论文15表35重组质粒的PCR反应体系试剂体积10PCRBUFFER25LDNTP05L上游引物（10MOL/L）1L下游引物（10MOL/L）1L重组质粒3LMG205LTAQDNA聚合酶05LDDH2O15L（2）PCR反应程序预变性9830SEC变性9815SEC退火58150SEC30个循环延伸72150SEC复性7210MIN4保存3282重组质粒的酶切（1）酶切体系表36NF1基因片段双酶切体系反应组分体积重组质粒7LBUFFER2LBAMHI05LHINDIII05LDDH2O10L总体积20L内蒙古科技大学本科生毕业论文16注一般最后加入一般最后在冰上加入BAMHI，HIN
35、DIII。内蒙古科技大学本科生毕业论文17第四章结果讨论与分析41人类基因组的提取实验室常见的提取DNA方法有碘化钾法、酚氯仿法、改良TRITONX100法、碘化钠以及试剂盒提取法等，经过多次试验和比较得出用试剂盒提取的DNA浓度纯度较高，这为后续试验质量用琼脂糖凝胶电泳进行验证如下图所示M12345610KB图41试剂盒法提取人类全基因组08琼脂糖凝胶电泳图M代表MARKER，图中13表示提取的DNA条带。分析在图41中可以看到提取的人类全基因组DNA是大于10KB的，说明提取的DNA是正确的。可以看到在加样孔2中DNA有拖尾现象这是由于跑胶时间有点长或者加样量太多的原因。提取DNA之后要进
36、行DNA浓度测定吸取DNA提取液12L，在紫外可见分光光度计上测定DNA的浓度、OD260/OD280和OD260/OD230，从图中可以看出比值均为18左右，说明提取的DNA纯度很高，浓度符合我们后续实验要求。如下图所示，均在18左右，说明提取的DNA纯度比较高，符合我们需要。内蒙古科技大学本科生毕业论文18图42DNA浓度测定42目的片段的扩增与纯化421目的片段的扩增原理聚合酶链式反应PCR）在体外95C高温时发生DNA双72链解旋为单链DNA，温度变为因此72C时以另一条DNA为模板合成互补单链。当温度达到58C左右时，DNA产物延伸。DNA聚合酶的原理是以单链DNA为模板通过片段DN
37、A启动合成。扩增后的产物自动在4C保存。通过温度变化控制从而去调控DNA的变性和复性以及延伸，与此同时控制时间。加入设计引物，以及DNA聚合酶、DNTP等一些物质，有些试剂含有MG2，有些则没有，没有则单独加入MG2，就可以完成特定基因的体外复制40。经过多次PCR试验得出最优体系跑出PCR电泳图。图43PCR扩增产物的浓度分析内蒙古科技大学本科生毕业论文19M123456710KB1410BP图44NF1APCR产物08琼脂糖凝胶电泳图M代表MARKER，图中16表示PCR扩增条带。分析在图43中可以看出目的片段扩增后，其A260和A280及其A260/A280值均符合预期需要，对比这两个值
38、时需要做对照实验，对照以前的数据，以及以前的DNA扩增后的浓度值。不断地优化，不断地筛选最优体系，最优浓度，这为后续实验做好铺垫，也能更熟练的掌握PCR仪技术，为后续工作打下扎实的基础。在图44中，M代表MARKER采用PCR产物条带清晰，未出现涂抹带，介于1KB与2KB之间，在NCBI中找到NF1A扩增后其片段大小为1410BP，从电泳图可以清晰的看到条带约为1410BP。422PCR产物的纯化由于提取的DNA经过PCR扩增得到NF1基因的目的片段中混有许多的其它其它生物大分子，比如蛋白质、多糖和脂类及酚类分子的污染应降低到最低程度，这会影响后续实验的操作，所以要对PCR产物进行纯化，纯化后
39、的PCR产物浓度图和琼脂糖凝胶电泳验证图如下所示内蒙古科技大学本科生毕业论文20图45PCR产物纯化后08琼脂糖凝胶电泳图M代表MARKER，图中12表示纯化后的目的片段条带。图46纯化后的PCR产物浓度图分析在图45中可以清晰的看到纯化后的PCR产物，条带良好，未呈现拖尾与弥散现象。M意思是MARKER，纯化后的条带介于MAKER1KB与2KB之间，符合片段大小。从图46中可以看出PCR产物的最大吸收波峰在240和280之间，DNA纯化后的浓度为598NG/L，纯化后的PCR产物浓度不高，与稀释次数和含有其他杂质有关，而A260/A280为13418说明其中含有蛋白或者酚类等杂质的影响。内蒙
40、古科技大学本科生毕业论文2143PCDNA31载体的制备431制备感受态细胞基本原理大肠杆菌转化试验技术关键就是制备感受态细胞，即应用一些科研上的特殊方法，（如电击法，CACL2处理）处理后，使大肠杆菌的细胞膜发生暂时的改变，处于能允许外源DNA分子进入的状态，叫做感受态细胞。CACL2转化的基本原理是建立在前人所做实验的基础上，经过多次优化实验得出。理论是是细菌在低温的时候，所谓低渗即0C，01MOL/LCACL2的溶液中，菌体细胞膨胀成球体形状，有一部分失去细胞壁，外来的DNA可形成抗DNASE的羟基磷酸钙复合物黏附于细胞的表面41。432PCDNA31质粒的小量提取（碱裂解法）基本原理质
41、粒是存在于某些细胞内换装的小分子DNA，由于整个细菌在高浓度盐离子的情况下大分子DNA会变性形成沉淀，而质粒会溶解在上清液中从而离心能提取出上清的质粒。本实验采取碱裂解法提取质粒，如下电泳图，在图片中可以清晰的看到质粒的两条带，最上面还有一条不清晰的线状带，这时由于量少的缘故。图47PCDNA31质粒08琼脂糖凝胶电泳图M代表MARKER，图中16表示PCDNA31质粒条带。10KB内蒙古科技大学本科生毕业论文2244NFIA基因目的片段和PCDNA31载体双酶切DNA是真核生物的遗传物质，由脱氧核苷酸组成，它是双链互补螺旋结构，定向酶切技术就是用限制性内切酶去切割DNA片段，由于酶具有专一性
42、，一种酶只能识别一种特定在生物分子中的脱氧核苷酸序列，所以可以用特异性生物分子去利用这种酶来切割相应的DNA片段，进而达到定向切割的目的。为下一步酶连做好铺垫。本实验采用用BAMHI和HINDIII进行酶切NF1基因和PCDNA31载体。实验过程中酶在冰上进行操作。为了减少实验误差，实验采用取所需每种材料总的体积，然后进行分装。在分装前进行混匀。M12M12M代表MARKER，左图1，2表示目的基因的酶切条带，右图则表示质粒酶切后的条带。图47NFIA基因的酶切图48PCDNA31载体酶切分析一下两张图均在08琼脂糖凝胶电泳下跑出的图。从图47可以看到NF1A基因经过BAMHI和HINDIII
43、双酶切后出现一条片段，由于这两种酶的酶切位点位于引物序列上，酶切过后会有三个片段，其中两条引物片段仅为1020BP，相对于目的片段量太少，在电泳图中无法看到，图中可以看到这条片段介于14KB与15KB之间说明酶切成功。在图48可以看出质粒酶切后在孔1中出现三条带，说明酶切没有成功，而在孔2中出现一条带说明酶切成功，这10KB10KB内蒙古科技大学本科生毕业论文23时由于在PCDNA31质粒载体酶切位点所决定的。BAMHI和HINDIII的酶切后的片段分为两条一条为5410BP，另一条为18BP，在电泳图中无法看到说明孔2质粒双酶切成功。45酶连根据酶连体系进行酶连，最好在超净台操作，酶连后，要
44、在16培养16H。将酶连完的重组基因导入大肠杆菌感受态细胞中，将重组基因涂在含有氨苄青霉素的LB培养基上生长。之后放在37恒温培养箱里，先是不含培养基的一面向上，两小时后倒置，过夜生长，如下图所示，重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞在含氨苄青霉素的LB培养基上生长。图49重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞在含氨苄青霉素的LB培养基上生长46重组质粒的鉴定将NF1A基因PCR产物纯化后与PCDNA31进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞。随机挑取白色菌落，在超净工作台内，提取质粒进行酶切和菌液PCR扩增，经过点样染胶之后电泳检测结果如图410所示内蒙古科技大学本科生毕业论文2410KBM1234M123M代
45、表MARKER，左图14代表酶切后的质粒条带，右图13表示质粒PCR条带。图410重组质粒酶切和PCR扩增后的08琼脂糖凝胶电泳图分析在涂有氨苄的平板内筛选单个白色菌落挑取在LB培养基中过夜培养，从而提取重组质粒。提取之后要对重组质粒进行鉴定。在图410左图，可以看到，重组质粒采用BAMHI和HINDIII双酶切后的电泳图，有两条带也有三条带，在孔2中，最下方有一条带位于MAKER1KB和2KB之间，很明显为NF1A目的基因。在右图中，重组质粒经PCR扩增后，条带清新，无任何杂带，也未出现在拖尾现象，片段大小与源DNA扩增后产物一致。从而鉴定重组质粒的构建是正确的。10KB内蒙古科技大学本科生
46、毕业论文25第五章结论及后续实验展望51结论通过查文献，统计资料发现在对于NF1的研究最早起于20世纪70年代。对于那个年代我们对于基因的研究还处于孟德尔式常染色体或者性染色体遗传的情况。在20世纪70年代，I型神经纤维瘤病发病机制并不清楚，病人的痛苦常常无法感受得到。来自全世界各地的生物医学家，展开对NF1疾病的研究。进入20世纪80年代，随着电子显微镜的应用与紫外可见光分光光度计的使用，以及细胞工程的发展，使人们渐渐认识到NF1这种基因的突变位点，以及突变效应。与此同时基因工程与分子生物学的快速发展，使人们从细胞水平的研究进入基因水平的研究。通过基因工程与分子生物学，人们渐渐意识到NF1这
47、种疾病的发病的机制。通过遗传学与生物医学的结合使人们渐渐清楚NF1从宏观水平进入到分子水平。人们不再单纯地去研究这种疾病的发病机制而是研究其相关疾病的突变位点以及突变频率。然而生物学家发现在这种发病的背后是NF1自身突变率较高，以及所编码的氨基酸密码子突变导致。进入20世纪90年代，由于基因测序的快速发展，以及电泳技术的快速应用，淘汰了以前过多的无用理论，从而进入基因时代。之后人们探究NF1基因转录后的MRNA其可变剪接及可变剪接的剪接因子对于MRNA的调控研究。之后人们发现在NF1转录后的MRNA其众多的外显子中有一个称之为23A外显子。在23A外显子出，人们惊奇的发现，此处蕴含着巨大奥秘。
48、它是NF1突变率最高的外显子，其主要编码HU蛋白，对此一些生物学家得出结论，它可能是NF1发病的主要原因。23A外显子出可变剪接的剪接体组装是非常复杂的。其中U2AF65扮演着重要角色。进入21世纪人们逐步揭开了NF1疾病的神秘面纱。其发病机制主要有两个。第一，其编码的23A外显子突变导致，NF1自身突变率非常高。第二，其转绿的MRNA翻译出的载脂蛋白的CAA密码子突变为终止密码子内蒙古科技大学本科生毕业论文26UAA。之后我们利用基因工程与分子生物学方法，逐步展开对其的验证。不断的查文献，采用先进的科学实验技术。去构建一个基因，这个基因具有NF1基因我们想去研究的位点与序列。开展这方面的实验
49、分为三个过程。第一个过程，构建引物。看大量的关于NF1基因的文献，从中国知网，NCBI等上找到NF1的引物序列，对引物进行分析研究其TM值。计算数据，统计数据。这里要感谢两位学长的帮助，以及生物信息学老师的知道。之后研究其酶切位点。所用的酶为BAMHI和HINDIII，要进一步分析两种酶合作使用的注意事项。这里呢，采用的是分装法。两种酶的酶切位点具有特异性。我们研究其并不是考虑其对引物构建的影响，而是为了后续实验的开展。其次，利用GENETOOL软件设计引物，利用了MATLAP软件。通过这两个软件的结合使用，我们构建了一对引物。最后，对构建的引物进行优化。在优化过程中，不断地将酶切位点前的的碱基序列替换，直到发现最佳碱基序列。第二的过程，开展实验。在开展实验之前，对实验仪器进行效验。使仪器保持高精准状态。首先，血液里提取全基因组。这里用到的是试剂盒法，这是我们不断优化实验的结果。这里要感谢生工生物工程的帮助。其次便是一系列的扩增。利用不同的延伸为度为起点，优化扩增体系。不断去发现各自的优缺点，最后综合起来进行反馈，从而获得最优扩增体系。接着就是质粒的提取，这
