1、无菌检查法概念 指用于检查药典要求无菌的药品、医疗 器具、原料、辅料及其他品种是否无菌 的一种方法。 若供试品符合无菌检查法的规定，仅表 明了供试品在该检验条件下未发现被微 生物污染。 无菌检查法概念 无菌检查是通过目检微生物在培养基中 的生长来判断结果。 无菌检验只能给出该批产品受污染的程 度。 无菌检验合格只能说明被测样品无菌， 不能证明整批样品无菌。 无菌检查的设施、环境、人员 检查环境应在洁净度 10000级下的局部洁 净度 100级的单项流空气区域内或 隔离系 统 中进行，其全过程必须严格遵守无菌 操作。 隔离系统按相关的要求进行验证，其内 部环境的洁净度须符合无菌检查的要求 。 无
2、菌检查的设施、环境、人员 规定应定期按医药工业洁净室（区） 悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法 的现行国家标准进行洁净度的验证。 日常检验还需对试验环境进行监控。 无菌检查的设施、环境、人员 无菌检查人员必须具备微生物专业知识 ，并经过无菌技术的培训。 无菌隔离系统 无菌隔离系统是一个不受外界环境影响的、可进行无菌操作的独 立环境系统。 使用隔离系统的优点：它能创造一个持续高效的高度无菌空间 ,保 护产品免受外源性污染，包括操作人员、操作环境及外包装等的 污染，确保操作环境及实验物品表面能达到无菌要求，防止出现 假阳性结果 ,保证 无菌实验结果的可靠性，从而实现一次检出的要 求；保护操作人员免
3、受实验过程中的有害物质带来的污染；放置 隔离器的环境洁净度不需要特殊要求，移动方便等优点 。 HTY无菌隔离系统 无菌检查用培养基的种类及用途 硫乙醇酸盐流体培养基 -培养好氧菌、 厌氧菌 改良马丁培养基 -培养真菌及好氧细菌 选择性培养基 -按硫乙醇酸盐流体培养 基或改良马丁培养基的处方及制法，在 培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂 或表面活性剂。 培养基的制备及装量 培养基可按处方制备，亦可使用按该处方生产 的符合规定的脱水培养基。 硫乙醇酸盐流体培养基的装量与容器高度的比 例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色） 不超过培养基深度 1/2。供试品接种前，培养 基氧化层颜色不得超过培养基深
4、度的 1/5，否 则，须经 100 水浴加热至粉红色消失（不超 过 20分钟），迅速冷却，只限加热一次。 培养基的储存 制备好的培养基应该保存在 2-25 、避光的 环境，若保存于非密闭容器中，一般在 3周 内使用；若保存于密闭容器中，一般可在 1 年内使用。 应结合实际情况进行验证，以确定培养基 有效期。 培养基的适用性检查 本检查可在供试品的无菌检查前或与供 试品的无菌检查同时进行。 无菌性检查 重要性：培养基无菌不合格将导致实验 的假阳性结果。 检查：每批培养基随机抽取不少于 5支或 5瓶，硫乙醇酸盐流体培养基置 30-35 培养，改良马丁培养基置 23-28 培养， 培养 14天，应无
5、菌生长。 培养基的适用性检查 灵敏度检查 菌种 硫乙醇酸盐流体培养基 金黄色葡萄球菌 生孢梭菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 改良马丁培养基 白色念珠菌 黑曲霉 培养基的适用性检查 菌种选择的原则 代表性、普遍性、易存活、低或非致病性、标准菌株 ( 或该药品中常见的污染菌 )。 金黄色葡萄球菌（代表革兰氏阳性菌）、铜绿色假单 胞菌（代表革兰氏阴性菌）、枯草芽孢杆菌（代表药 品中最常见或最易污染的菌）、生孢梭菌（代表厌氧 菌）、白色念珠菌（代表酵母菌）、黑曲霉（代表霉 菌）。 菌种的要求：不得超过 5代。采用适宜的菌种保藏方法 保存，以保证菌种的生物学特性。 加菌量 : 100cfu。 培养基的适
6、用性检查 菌液制备 试验菌 培养基 培养温度 培养时间 金黄色葡萄球菌 营养肉汤 30-35 18-24 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 硫乙醇酸盐流体 白色念珠球菌 改良马丁培养基 23-28 24-48 黑曲霉 改良马丁琼脂斜面 5-7天 培养基的适用性检查 培养基接种 试验菌 培养基 每管装量 接种管数 接种量 培养时间 金黄色葡萄球菌 硫乙醇酸盐 12 ml 2 支 1 ml 3 天 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 白色念珠球菌 改良马丁培养基 9 ml 2 支 1 ml 5 天 黑曲霉 其中硫乙醇酸盐及改良马丁培养基均有 1支不接种作为空白 接种量 100cfu（不能多）
7、 培养基的适用性检查 结果判断 空白对照应无菌生长，若加菌的培 养基管均生长良好，判该培养基的 灵敏度检查符合规定。 试验同时应做空白对照 培养基说明 无菌检验培养基所能支持生长的微生物 是有限的。 微生物种类繁多，这些微生物有广泛的 生长要求，如：营养、温度和氧等。 无菌检验培养基不可能支持所有微生物 的生长，选择了支持那些最有可能污染 药品和在药品中生长的微生物的营养的 培养基。 供试品的无菌检查法 无菌检查法包括直接接种法和薄膜过滤法。只 要供试品性状允许， 应优先采用薄膜过滤法。 进行供试品无菌检查时，所采用的检查方法和 检验条件应与验证的方法相同。 薄膜过滤法可以提高无菌检验的检出率
8、，特别 是抑菌性供试品，采用薄膜过滤法可以有效消 除供试品的抑菌性，提高检出率。 供试品的无菌检查法 -直接接种法 样品直接移入无菌培养基中。 每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品 体积不得大于培养基体积的 10%。 同时硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于 15ml，改良马丁培养基每管装量不少于 10ml。 培养基的用量和高度同方法验证试验。 每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。 供试品的无菌检查法 -薄膜过滤法 原理：薄膜过滤法是将供试品通过滤膜，微生物截留 于滤膜上，若有抑菌作用的药品同时使用冲洗液冲洗 滤膜上残留的供试品（如有残留会抑制微生物生长） ，然后，培养滤膜看其是否有微生
9、物生长。 选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性，水溶 性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。 油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。 使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。 供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每 张滤膜每次冲洗量为 100ml，且冲洗量不超过 1000ml， 以避免滤膜上的微生物受损伤。 过滤器应优先选择 封闭式 薄膜过滤）， 也可使用一般 薄膜过滤器。滤膜孔径不大于 0.45m ，直径约为 50mm 。 供试品的无菌检查法 检验数量 指一次检验所用供试品最小包装容器的数 量 采用薄膜过滤法应增加 1/2的最小检验数量作为阳性对 照；采用直接接种法
10、应增加供试品无菌检查时每个培 养基容器接种的样品量作为阳性对照。 检验量 指一次试验所用供试品总量（ g或 ml），若 每支（瓶）供试品装量按规定足够接种两份培养基， 则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养 基。采用薄膜过滤法时，检验量不应少于直接接种法 的供试品总量，只要供试品的特性允许，应将所有容 器内的全部内容物过滤 . 无菌检查的稀释液、冲洗液 无菌检验所用稀释液、冲洗液种类应对微生物无毒、 无抑制作用。稀释液用量、冲洗液冲洗次数及用量等 应当与验证合格的方法一致。每张滤膜每次冲洗量为 100ml，总冲洗量不宜过大（不超过 1000ml），用量过 多不仅容易破坏滤膜上截留的微生
11、物，而且对滤膜造 成损伤；但也不能太少，否则不能将供试品冲洗干净 ，无法消除抑菌性。 0.1%蛋白胨水溶液 PH7.0氯化钠 -蛋白胨缓冲液 如需要可加入表面活性剂或中和剂 ,应经方法验证证明 其有效性，并对细菌存活无影响。 供试品溶液的制备 水溶液供试品 取规定量，直接过滤，或混合至含适量稀释液的 无菌容器内，混匀，立即过滤。 如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用适量的 冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数不得少于三次。 冲洗后，如用封闭式薄膜过滤器，分别将 100ml硫 乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应 的滤筒内。 如果采用一般薄膜过滤器，取出滤膜，将其剪成 3 等份，分别置于含 50ml硫
12、乙醇酸盐流体培养基及 改良马丁培养基容器中，其中一份做阳性对照用 。 可溶于水的固体制剂供试品 取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签说明复 溶，然后照水溶液供试品项下的方法操作。 - 内酰胺类抗生素供试品 取规定量，按水溶液或固体制剂供试品的处理法 处理，过滤，用适宜的冲洗液冲洗滤膜。再用含 适量 - 内酰胺酶的冲洗液清除残留在滤筒、滤膜 上的抗生素后接种培养基，必要时培养基中可加 少量的 - 内酰胺酶；或将滤膜直接接入含适量 -内酰胺酶的培养基中。接种培养基的方法照水溶 液供试品项下的方法操作。 供试品溶液的制备 非水溶性制剂供试品 取规定量，直接过滤或混合溶于含聚山梨酯 80或 其它适宜乳
13、化剂的稀释液中，充分混合，立即过 滤。用含 0.1%-1%聚山梨酯 80的冲洗液冲洗滤膜至 少 3次。滤膜于含或不含聚山梨酯 80的培养基中培 养。培养基接种照水溶液供试品项下的方法操作 。 其他类供试品： 可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂供试 品 无菌气（喷）雾剂供试品 装有药物的注射器供试品 具有导管的医疗器具 (输血、输液袋等 )供试品 供试品溶液的制备 阳性对照试验 目的： 验证供试品经灭活后或用其它方式（稀 释、冲洗等）处理后是否仍有抑菌或杀菌的作用 ，确保检验条件符合要求，防止出现假阴性。 培养条件是否符合要求。 应根据供试品的特性选择阳性对照菌。 无抑菌及抗革兰阳性 -金黄色
14、葡萄球菌 抗革兰阴性 -大肠埃希菌 抗厌氧菌 -生孢梭菌 抗真菌 -白色念珠菌 阳性对照菌加量： 100cfu 阳性对照培养 48-72h 应生长良好。 阴性对照 不加样品的无菌检验 目的：确认无菌检验所用的稀释液、冲洗液、培 养基、青霉素酶、集菌器等物品及人员操作、检 验环境、仪器设备等是否有菌存在。 应取相应溶剂和稀释剂同法操作。 应与无菌检验同时做。 阴性对照不得有菌生长。 培养及观察 供试品无菌检查培养温度和时间非常重要，只 有在合适的温度和时间内微生物才能生长良好 。 培养 14天，如果培养基浑浊或培养 14天后从外 观不能判断是否长菌，可取该培养液适量转种 至同种培养基或划线接种于
15、斜面培养基上，培 养细菌 2天、真菌 3天，观察有无菌生长，或镜 检进行判断。 结果判断 前提 :阳性对照为阳性，阴性对照为阴性，无菌 检验方有效。 若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌 生长，判供试品 符合规定 。 若供试品中任何 1管显混浊并确证有菌生长， 判供试品 不符合规定 。 除非能充分证明，生长的微生物非供试品所含 。 当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果 无效 ： 对无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结 果不符合无菌检查法的要求； 回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的 因素； 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证有微生物 生长是因无菌试验中所使用的物品和（或
16、）无菌操 作技术不当引起的。 试验若经确认无效，应 重试 。重试时，重 新取 同量 供试品，依法重试，若无菌生长 ，判供试品符合规定，若有菌生长判供试 品不符合规定。 若供试品符合无菌检查法的规定，仅 表明了供试品在该检验条件下未发现 被微生物污染。 所有供试品管均无菌生长，方可判供 试品符合规定。 以一次检出为准，除非有证据充分证 明检出的微生物非供试品本身所致， 原检验结果无效，应重试。 无菌检验的局限性 本版药典无菌检查法指出：若供试品符合无菌检 查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未 发现被微生物污染。 药品要么是无菌的，要么就是非无菌的。药品是 否无菌的结论一直是以药典规定的无菌
17、检查抽样 和试验方法的结果作为判断依据。 无菌检查存在着很多局限性，最明显的是 无菌检 查方法本身 。不管样品是否有好的代表性，它的 结果总是存在不确定性。它是一个破坏性的试验 ，它与整个批的一个随机样品的统计选择性有关 。 无菌检验的局限性 从理论上来说，要确定某批产品的无菌性，应 对每个容器进行无菌检查。但是无菌试验对样 品是破坏性的，因此不可能对每一最小包装的 产品进行检查。 统计概率的局限性 ：对于低污染水平的产品 ，其局限性在统计学上更为明显。 检验条件的局限： 样品中污染的微生物的检 出受多种因数的影响，只有在各检验条件符合 污染微生物的修复和生长时，才能保证被检样 品的无菌检验结
18、果的准确性。 污染的检出率要比实际产品的污染率低 无菌检查存在检查失误的可能性 ：这可能是因 为污染菌浓度太低，或是污染菌生长太慢，或是 因为培养基不良等原因，在培养期间污染菌根本 就不生长。产品的染菌率愈小，错判合格的可能 性就愈大。 无菌检查的另外一个弊端， 即当无菌检查发现阳 性结果时，按照规定可以重新复查（这也是应该 的）。复查时尽管已经适当地加大了样本数量， 但再检出的几率就更低了。 所以在评价某个无菌制品的某个批的无菌状态时 ，仅依靠最终产品的无菌检查是不充分的，局限 性较大。对无菌制品来说，生产最终产品的所有 系统的工艺才是最重要的。 抽样 由于无菌检查法的统计学局限性，对于同一
19、 批的无菌分装的产品，应尽量抽取批生产开始 和结束或生产过程出现异常情况下的产品组成 样本进行检验。对于采用最终灭菌的产品，应 抽取每一灭菌柜中经验证过的可能存在灭菌不 彻底的点的产品组成样本进行检验。如果试验 结果判为无效，那么重试试验的样品应尽量取 与初试同一时间分装或同一灭菌位置的样品进 行检验。 休息一下 关于方法验证试验 为什么验证？ 验证什么？ 怎么验证？ 为什么验证 采用经过验证的方法，是分析测量科学的基本 要求，是各种法规遵循工作的基础。药品微生 物检查作为药品质量体系中的一个环节，应与 其他检验项目一样，对方法和条件进行考察， 以保证结果的科学性，如鉴别、含量测定。 验证的思
20、想其实早已贯彻于微生物检测的诸多 方面：无菌环境验证（尘埃粒子、浮游菌、沉 降菌检测）、灭菌器的验证、培养基灵敏度检 测、阴性对照、阳性对照等。 为什么验证 药典充分借鉴发达国家经验，将微生物检查方 法的验证实验进行了更加系统化的规定和要求 。验证实验伴随着整个实验过程，实验过程中 的每一个环节均应有合理的证明（验证），保 证其对结果判断没有影响。 有了系统的方法验证，可以避免以往因为阳性 菌选择不合理、方法不合理而造成的漏检、误 判，以保证结果的科学可靠，这一点无论对于 当前无菌检查的一次性报告，还是对于实验室 认证认可、以及新的药品注册管理办法的要求 都是相一致的。 为什么验证 验证的意义
21、：保证检验结果的准确、可 靠性及检验方法的完整性。 验证什么 微生物检验： 某种样品 采用 某种方法 得到一个检查结果 。 供试品影响 方法的有效性 验证什么 验证试验方案的设计需满足两方面的要 求：一方面，样品的预处理方式能有效 消除（或中和）样品的抑菌性；另一方 面，样品的预处理方式和检测过程以及 培养条件等均不会影响样品中的微生物 生长。 验证 药品微生物检查方法验证的一般程序与 环节 需前处理 不需前处理 去除抑菌作用有抑菌作用 无抑菌作用 样品 可以通过验 证实验判断 验证抑菌活性去除的有 效性，以及去除方法对 污染菌生长、检出影响 验证前处理方法对污染菌生长、检出影响 样品 有抑菌
22、作用 无抑菌作用 有抑菌作用 去除抑菌作用 验证抑菌活性去除的有 效性，以及去除方法对 污染菌生长、检出影响 去除抑菌作用 样品 验证抑菌活性去除的有 效性，以及去除方法对 污染菌生长、检出影响 去除抑菌作用样品 不需前处理 样品 需前处理 不需前处理 样品 需前处理 不需前处理 样品 需前处理 不需前处理 样品 无抑菌作用 有抑菌作用 需前处理 不需前处理 样品 无抑菌作用 有抑菌作用 需前处理 不需前处理 样品 需要验证的重点环节 验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中 的每一个环节均应有合理的证明（验证），保 证其对结果判断没有影响。 前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性 ，应在验
23、证范围内。已有标准规程（ SOP）和 充足实验证明的前处理方法可以直接采用，但 出现疑问应进一步研究提高。 供试品中抗菌活性的去除是当前验证工作的重 点。尤其强调应充分验证供试品本身对微生物 生长的影响。 验证的类型 前验证 : 建立药品的无菌检查法时，需 对供试品的抑细菌和抑真菌特性及无菌 检查方法的可靠性进行验证 再验证 : 修订的检验方法 ;供试品的组分 或原检验条件发生改变可能影响检验结 果时， 应重新验证 ；定期的方法验证 . 供试品中抗菌活性的去除 稀释法：降低供试品的相对浓度 薄膜法：利用体积差异分离 中和法：利用化学（生物）专属性灭活 离心法：利用沉降系数差异分离 抗菌活性去除
24、效果的检验 应根据供试品的特点，选择敏感菌株， 对供试品抗菌活性去除效果加以检验再 按药典要求全面验证，提高效率。 选择敏感菌株 间接方法：文献、技术资料（可靠） 直接方法：预实验（个体抑菌实验） 参考选择：一般中药选择枯草和金黄； 抗生素根据抗菌谱选择。 选择适宜的方法 可靠、稳定、简便 参考方法： 在样品许可的条件下 薄膜过滤，冲洗 什么时候不验证 已经验证过的、体系中没有变化因素的 不用验证的 参照质量体系中其他项目的执行情况 验证以后怎么办 按验证确立的方法进行供试品的无菌检 查。 验证资料的审查、复核与采纳。 方法验证与无菌检验标准建设。 结果总结与报告 综合分析实验中遇到的所有情况
25、，最终 形成一份详细、严谨、具有可操作性的 验证报告。 给出该品种的标准检验规程，以及各方 法操作的关键点，以供检验参考。 方法验证实验报告 标准的技术文件。 下次见！ 无菌检查方法的验证 验证的目的 : 在于确认（寻找）一种有效的检验方法，如 果样品（药品）中有一定数量的微生物存在，那么采用此 法可以使得样品（药品）中的微生物得以检出。 验证实验 检验条件 检验方法 样品量 检验规程 稀释液种类及体积 SOP 中和剂 培养基 培养时间 培养温度 影响无菌检验的因素 样品 /药品本身的特殊性 样品 /药品中添加的防腐 /抑菌剂 培养基的特性 培养条件 人员因素 验证试验可在供试品的无菌检查之
26、前或与供试品的无菌检查同时进行 。当同时进行时，若验证试验失败 ，那么供试品的无菌检查结果是不 成立的。 菌种的要求：不得超过 5代。采用适宜的方法保存。 l验证用菌株： 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢 杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉。 l选择的原则 :代表性 ,普遍性 ,易存活、低或非致病性 ,标 准菌株 (或该药品中常见的污染菌 )。 菌液制备：同培养基灵敏度试验方法 加菌量 : 100cfu。 验证方法：薄膜过滤法 将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲 洗， 在最后一次的冲洗液中加入小于 100 cfu的试验菌、过滤。取出滤膜接种至相应 的培养基中，或将培养基加至滤筒内。另 取
27、一装有同体积相同培养基的容器，加入 等量的试验菌，作为阳性对照，按规定温 度培养 3 5天。各试验菌同法操作。 结果判断： 与对照管比较，如含供试品各管中的试验菌均生 长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无 抑菌作用。按此法进行供试品的无菌检查。 如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢 或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条 件下有抑菌作用。 可采用增加冲洗量，增加培养基的用量，使用中 和剂或灭活剂；更换滤膜品种等方法消除供试品 的抑菌作用，并重新进行方法验证。 无菌操作过 程对消除抑菌有很大关系 各方法组合运用，效果更佳！ 样品处理 主要强调固体样品的溶解、转移、均匀分配问题。通
28、常将 规定取样量全部转移到 400 500ml稀释剂或者适宜溶液，再 进行分配。 冲洗方法 强调少量多次： 50ml/次； 强调充分振摇； 操作细节的标准规范，如集菌仪转速、冲洗过程中盖还是不 盖滤筒下口等等。 菌液加入 菌液组、供试品加菌液组严格一致。 无菌检查法验证实验要点 中和剂加入 不同中和剂加入方式可能效果不一样。直接加入培养 基中效果最好。但如果某些中和剂对微生物生长不利可考 虑其他步骤加入。 菌液加入 按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，主要是 考虑过滤器的有效性。而验证实验主要考虑滤膜 /滤器残 留抗菌物质对阳性菌生长的影响，可以与对照滤筒比较而 做出判断，所以验证实验中加
29、菌时机与方式只要与对照一 致即可。 无菌检查方法验证 通过验证最终确定：样品检验量，稀释液类 型、用量及样品浓度，薄膜过滤器类型，冲 洗液类型及冲洗次数，酶的浓度、加酶量及 加酶方式，阳性对照菌，培养基生产单位、 配制、消毒及用量，培养温度与时间等。 无菌检查方法验证 为了考察检验方法的稳定性和重现性，验证时，至 少需准备 3个不同批次的同类样品， 3名不同实验人 员分别进行 3次验证试验。 一旦验证合格，无菌检查方法必须严格按照验证合 格的程序进行，涉及到培养基的生产单位、配制、 灭菌及用量，稀释液、冲洗液的种类、配制、灭菌 及用量，青霉素酶的浓度、加入量、加入方式，菌 液制备及计数方式，集
30、菌器的规格型号、生产单位 ，集菌仪，培养温度，培养时间等均应与验证时所 用的仪器设备及物料一致。 验证试验应注意的问题 样品的选择（是否有抑菌性） 样品必须无菌合格 供试液浓度的选择（浓度不能太高） 充分振荡 试验菌株测试的顺序（先验证敏感菌） 菌液的加法（最后一次冲洗液加入） 培养基的用量 三次平行试验 验证试验记录 总的要求：详细、严谨、可操作性 供试品信息 检验数量和检验量：按照无菌检查的量确定 供试品处理、供试品溶液的制备 检验方法（选择直接接种法说明理由） 实验用菌：代数、稀释级、计数 培养基信息 检验条件：主要是冲洗条件（冲洗液、冲洗次 数、量，必要时说明滤膜材质、仪器、泵速等 条
31、件）。 需要中和、酶处理等特殊处理方法的需说明 逐日记录各菌的生长情况 验证试验结论 采用的方法：薄膜过滤法 /直接接种法 供试品检验量及处理、制备情况 关键实验点：如冲洗条件、中和、酶处理等 因素。 阳性对照菌的选择 薄膜过滤法加菌的时机 按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液， 而验证试验主要考虑滤膜 /滤器残留抗菌物质 对阳性菌的生长的影响，可以与对照滤器比较 而作出判断，所以验证试验中加菌时机与方式 只要与对照一致即可。 验证及资料中常见的问题 薄膜过滤法滤膜材质选择 普通滤膜 有机膜 低吸附滤膜 1.根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质 。 2.应保证滤膜在过滤前后的完整性。 3.采
32、用全封闭过滤器注意观察膜的状态，某 些油性供试品或采用蓖麻油等作为溶媒的供 试品可以损伤普通滤膜。 敏感菌株与阳性对照菌 阳性对照菌不是验证试验选定的敏感菌株 问题：降低了阳性对照菌的意义，实际工作中 抑制枯草芽孢杆菌的样品很多（敏感菌株）， 但阳性对照只能选择金黄色葡萄球菌。 稀释液选择的问题 药典附录无菌检查法规定的稀释液和冲洗液只 有 2种，即 0.1%蛋白胨水溶液和 PH7.0氯化钠 - 蛋白胨缓冲液。但各药品项下却规定用 0.9%的 氯化钠溶液做为稀释液， 采用经验证合格的适 宜的溶液作为稀释剂、冲洗液。 理论上使用 0.1%蛋白胨水溶液和 PH7.0氯化钠 - 蛋白胨缓冲液做为稀释
33、液和冲洗液效果更好， 因为这 2种溶液具有修复已损伤的微生物的作 用，可以提高检出率。 薄膜过滤法和直接接种法 如：一般供试品（无特殊说明）采用直接接种法 某厂家胸腺五肽注射液为普通注射剂，完全可以 采用薄膜过滤法，生产单位进行的无菌检查验证 法为直接接种法。 也有的厂家把两种方法的验证都写上，结论中也 没有说明采用那种方法。 无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法，只要 供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。 修订：改为薄膜过滤法重新进行验证。 问题：方法选择错误 问题：冲洗条件、冲洗量的选择 有些验证资料中，对非抑菌性供试品也采用 大量的冲洗， 100ml/次 *10次 /膜，增加了出 现误差的
34、机会。 1. 对膜的损伤 2. 检验方法繁琐，大大增加检验人员的工 作量（检验要按照已经验证的方法进行） 3. 验证试验方法选择总的原则是由易到难 冲洗不一定为 100ml/次，可少量多次，如 50ml/次， 注意充分振摇。 对于抑菌性较强的供试品，可以先用适宜的稀释液 稀释后再过滤，以减少膜的吸附 , 减少冲洗量。如 ：抗生素品种取规定量，混合至含适量稀释液（如 500ml等 )的无菌容器中，然后再过滤。 对于抑菌性较强的注射用无菌粉末或固体原料，一 定要充分溶解、混合均匀。 抗菌药可以根据其抗菌谱选择敏感菌先进行预试验 ，找到合适的条件再进行其他菌的实验。 采用开放式薄膜过滤器：滤膜分成几
35、份与取样量、 冲洗条件的选择有关，建议尽量与无菌检查法一致 （最常见为 3等分）。 方法描述不够详细，没有可操作性 如：某产品验证资料内容 “ 将规定量的供试 品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次冲 洗液中加入小于 100CFU的试验菌，过滤。取 出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养集中，或 将培养基加至滤筒中 ” 。 验证的目的是为了 “ 照此检查法和检查条件 进行供试品的无菌检查 ” ，方法确立后，以 后该产品就可以采用该方法进行检验。 修订：应记录取样量、（稀释方法）、冲洗 液、冲洗量（冲洗条件）等。 无菌检查方法验证操作过程 供试品溶液制备： 取无菌供试品约 10g，用无菌注射器吸取 适量
36、pH7.0氯化钠 -蛋白胨缓冲液将其溶 解，全量移至 500ml的 pH7.0氯化钠 -蛋白 胨缓冲液中，充分溶解摇匀后制成 2%青 霉素钠供试品溶液 。 无菌检查方法验证操作过程 冲洗量确定： 根据供试品的特性首先选择对供试品敏感的 菌确定冲洗量，同时确定阳性对照菌。 将供试品溶液按薄膜过滤法过滤，并用 pH7.0 氯化钠 -蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗量约为 100ml，共冲洗 3次，并在最后一次冲洗液中加入 小于 100cfu的菌，然后在滤筒中加入 100ml硫乙醇 酸盐流体培养基，放置 30-35 恒温室培养 5天观察 结果；另取上述供试品溶液，按以上方法操作， 但冲洗次数为 4次（
37、每次 100 ml），同时进行阳性 对照。 无菌检查方法验证操作过程 冲洗量 （ ml） 培养时间（天）1 2 3 4 5 0 300 400 阳性对 照 - + - + - - - - + + + + + + + + + + + + 无菌检查方法验证操作过程 A组（试验组） 将供试品溶液按薄膜过滤法过滤，并用 pH7.0氯 化钠 -蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗量约为 100ml ，共冲洗 4次，并在最后一次冲洗液中逐一 加入小于 100cfu的金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、 大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉 ，最后在 4个加有细菌的滤筒中分别加入 100ml 硫 乙醇酸盐流体培养基
38、，放置 30-35 恒温室培养 5 天观察结果；在 2个加有真菌的滤筒中分别加入 100ml 改良马丁培养基，放置 23-28 恒温室培 养 5天观察结果。 培养基中加青霉素酶，每 100ml 培养基加 2ml 酶 。 无菌检查方法验证操作过程 B组（缓冲液对照组） 不加供试品，用等量 500ml pH7.0氯化钠 -蛋白胨缓冲液 替代 供试品溶液，操作同 A组（试验组）。 C组（阳性对照组） 取 4个装有 100ml硫乙醇酸盐流体培养基的滤筒，逐一加入 与 A组（试验组）等量的金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、大肠 埃希菌、枯草芽孢杆菌，放置 30-35 恒温室培养 5天观察 结果；取 2个装有 1
39、00ml改良马丁培养基的滤筒，逐一加入 与等 A组（试验组）量的白色念珠菌、黑曲霉，放置 23- 28 恒温室培养 5天观察结果。 D组（阴性对照组） 同供试品无菌检查，阴性对照均应无菌生长。 验证时为了保证实验的成功率，最好首先 进行 B组（缓冲液对照组）， C组（阳性对 照组） ， D组（阴性对照组）三组实验验证 因为稀释剂对照组实验不符合要求，那么 试验组也就没意义了，所以必须是稀释剂 对照组符合要求后，试验组才能进行。 无菌检查方法验证结果分析 结果分析： 阴性对照均呈阴性，验证方有效。说明本次验证所用供试品 及相关物品均无菌，且验证操作正确，无污染事件发生。 如果 A组与 B组的微生
40、物生长数量和生长时间一致，表明该样 品的预处理方式能有效消除样品的抑菌性； 如果 B组与 C组的微生物生长数量和生长时间一致，表明样品 预处理所用稀释液、冲洗液、中和剂的毒性，检测程序和培 养条件等均不会影响微生物的生长。 微生 物 验证 日期 批 号 试验组 缓冲液对照组 阳性对照组 培 养 时 间（天） 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 金黄色 葡萄球 菌 生孢 梭菌 大肠 埃希 菌 枯草 芽孢 杆菌 白色 念珠 菌 黑曲 霉 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
41、 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +- + + + + + + + + - + + + + + + + +- + + + + + + + +- + + + + + + + +- + + + + + + + +- + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - 验证试验失败后，则说明供试品的该检验 量在该检验条件下有抑菌作用。可采用增 加冲洗量，增加培养基的用量，使用中和 剂或灭活剂；更换滤膜品种等方法消除供 试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。 全部验证必须按照批准的验证方案进行， 验证结束后应该及时汇总验证数据记录和 验证报告，然后根据验证程序编写无菌检 验 SOP。
