1、花生黑腐病菌分子检测技 术与杀菌剂筛选 指导老师：潘汝谦 申请人 :金程远 2019/9/20 1 项目的意义 花生是世界上最重要的油料作物之一 我国花生种植面积居世界第二位，总产量居世界第一位 花生黑腐病（ Cylindrocladium black rot of peanut）是为 害花生的最严重的毁灭性病害之一 我国将花生黑腐病 Cylindrocladium parasiticum列为国家进 境植物检疫性植物病害 我国对花生黑腐病的检测技术和防治方法还没有深入的研 究，很多问题尚需解决 为中国华南地区花生黑腐病防治等提供理论与实践基础 遏制花生黑腐病的蔓延，保护我国花生和大豆产业 20
2、19/9/20 2 现状分析 花生黑腐病（ Cylindrocladium black rot of peanut）是为 害花生的最严重的 毁灭性病害 之一，迄今没有满意的防治 手段。 1965 美国 1968 日本 2009 中国 设计检测花生黑腐病菌的特异引物，建立常规 PCR技术， 快速准确地检测潜在花生黑腐病菌的分子检测方法。筛选 出对花生黑腐病菌有较好抑制作用的杀菌剂，并试验性进 行温室药效试验。建立嘧菌酯对花生黑腐病菌敏感性基线 都有较好的理论和现实意义。 2019/9/20 3 County Location Lat Long USA Terry 102.19 33.18 Ter
3、rell -96.28 32.7 Castle Hayne -77.89 34.39 Martin -77.93 34.21 Bladen -78.56 34.68 Florence -79.71 34.18 Charleston -80.01 32.77 Midville, -82.23 32.81 Tifton 83.51 31.45 Raleigh -78.64 35.74 Clayton -78.46 35.65 Bertie -76.96 36.02 Japan Tsukuba 140.06 36.02 Chiba 140.1 35.59 Iwate 141.09 39.63 Iba
4、raki 140.06 36.19 Gumma 138.64 36.38 Saitama 139.25 35.94 Nagano 137.98 36.13 Kyoto 135.74 34.94 Tokushima 134.54 34.04 Australia Kingaroy 151.8 -26.62 Tolga 145.48 -17.23 Vietnam mid-lands 105.77 20.81 表 1 花生黑腐病菌世界分布范围 注：花生黑腐病菌主要分布于美国、日本、韩国、印度尼西亚、斯里兰卡、巴西、澳大利亚、喀麦隆和洪都拉斯等 20多个国家和地区。该表仅显示文献明确记载的地区。 201
5、9/9/20 4 图 1 花生黑腐病菌主要分布国家 2019/9/20 5 项目简介 本项目以我国新发现的花生黑腐病为研究对象，融合植物 病理学、分子生物学和杀菌剂学的研究技术，开展花生黑 腐病 检测技术 与 防治方法 的研究。设计检测花生黑腐病菌 的 特异引物 ，建立常规 PCR技术，快速准确地检测潜在花 生黑腐病菌的分子检测方法。测量 20多种杀菌剂对花生黑 腐病菌的抑菌作用，得出不同杀菌剂的 EC50。 筛选 出对花 生黑腐病菌有较好抑制作用的 杀菌剂 ，并试验性进行温室 药效试验。建立嘧菌酯对花生黑腐病菌 敏感性基线 等均属 国内首创。因此，本研究将为中国华南地区花生黑腐病防 治等提供
6、理论与实践基础。可以设想，如能取得预期效果 ，经过良好设计的基础研究后，可进一步了解花生黑腐病 入侵为害等核心科学问题，及时遏制花生黑腐病的蔓延， 保护我国花生和大豆产业。 项目研究目标 2019/9/20 6 1965 花生黑腐病由病原真菌 Cylindrocladium parasiticum (Bell Crous et al., 1993)引起，属于半知菌亚门的柱 枝双孢霉属，病原菌最早由 Bell和 Sobers于 1965年在美国 Georgia州发现和报道，该病菌侵染花生的茎基部、荚果和 根系，受侵染部位常常变黑腐烂，最终导致全株萎焉和死 亡 12。该病害短时间内在美国迅速蔓延扩
7、展和流行，造成 的产量损失超过 50%3。 现状分析 2019/9/20 7 1968 花生黑腐病菌的寄主十分广泛，可以侵染花生、大豆、红三叶、 美丽鹧鸪豆、紫花苜蓿和猪屎豆等十几种豆科植物。 花生黑腐病菌在大豆上引起的病害通常称为大豆红冠腐病 （ Soybean red crown rot）。 1968年在日本千叶县首次发现该病，这 是世界上最早的关于花生黑腐病菌为害大豆的报道 5。该病害在 全日本各地区广泛发生，且为害严重，成为日本大豆的重要病害 6。 在中国江苏、云南和广东等地区曾报道发现大豆红冠腐病 8910 。花生黑腐病菌可侵染镰果灯心草，这种豆科杂草是危害美国东 南部大豆产业的恶性
8、杂草 11。花生黑腐病菌还可侵染蓝莓、番木 瓜、猕猴桃和花烛等非豆科植物 12131415。 现状分析 2019/9/20 8 2009 2009年，潘汝谦等在广东省多个花生产区报道发现花生黑 腐病，部分地区危害严重，根据花生黑腐病在世界主要分 布现状，我国华南地区正是适宜花生黑腐病发生的地区， 所以，应该警惕花生黑腐病的入侵 19。 现状分析 2019/9/20 9 项目研究 目标 1. 利 用特异引物，建立常规 PCR体系，快速准确地检测潜 在花生黑腐病菌的分子检测方法。试验性开展多重 PCR 和实时 PCR技术检测花生黑腐病菌。 2. 测 量 30多种杀菌剂对花生黑腐病菌的 EC50。
9、3. 建 立嘧菌酯对花生黑腐病菌敏感性基线。 4. 在 核心期刊上发 表较高 水平论文 12篇。 2019/9/20 10 项目研究内容 1. 设 计检测花生黑腐病菌的特异引物，建立常规 PCR技术 ，快速准确地检测潜在花生 黑腐 病 菌的 分子检测方 法。 2. 测 量 30多种杀菌剂制剂和 10种杀菌剂原药对花生黑腐病菌 的抑菌作用，得出不同杀菌剂的 EC50。筛选出对花生黑 腐病菌有较好抑制作用的杀菌剂，并试验性进行温室药 效试验 。 3. 建 立嘧菌酯对花生黑腐病菌敏感性基线。 2019/9/20 11 1.供试的 40个菌株，其中花生根腐病类 12个，由华南农业大 学杀菌剂与抗菌化合
10、物研究室提供。其编号、种名、采集地 点及寄主详见表 2-1。 Code no. Species Origin Host 1 Diplodia gossypina Guangdong Peanut 2 Rhizoctonia solani Guangdong Peanut 3 Sclerotium rolfsii Jiangxi Peanut 4 Aspergillus niger Guangdong Peanut 5 Pythium myriotylum Guangdong Peanut 6 Fusarium solani Guangdong Peanut 7 Fusarium oxyspor
11、um Guangdong Peanut 8 Rhizopus arrhizus Guangdong Peanut 9 Selerotinia miyabeana Guangdong Peanut 10 Sphaceloma arachidis Guangdong Peanut 11 Verticillium dahliae Guangdong Peanut 12 Macrophomina phaseolina Guangdong Peanut 13 Neocosmospora vasinfecta Jiangxi Peanut 14 Fusarium oxysporum f. sp. cube
12、nse Guangdong Banana 15 Thielaviopsis paradoxa Guangdong Pineapple 16 Colletotrichum musae Guangdong Banana 17 Colletotrichum gloesporioides Guangdong Mango 18 Penicillium italicum Guangdong Orange 19 Penicillium digitatum Guangdong Orange 20 Fusarium oxyporum f. sp. niveum Guangdong Watermelon 21 C
13、urvularia lunata Guangdong Corn 22 Peronophythora litchii Guangdong Lichi 23 Rhizoctonia solani Guangdong Rice 24 Pestalotiopsis mangiferae Guangdong Mango 25 Bipolaris maydis Guangdong Corn 表 2供试菌株编号及采集地点 Note: Neocosmospora vasinfecta is a new plant pathogen we found in Guangdong and Jiangxi provi
14、ce, including two kinds of varieties: Neocosmospora vasinfecta var. Africana and Neocosmospora vasinfecta var. vasinfecta 2019/9/20 12 特异引物见下表。 2019/9/20 13 2019/9/20 14 2019/9/20 15 2019/9/20 16 2.采用药皿抑菌法测定杀菌剂的 EC50。测定 18种杀菌剂对花 生脚腐病菌的抑制作用。将花生黑腐病菌于 PDA培养基上 25 预培养 7天 ,用直径 6mm的打孔器在靠近菌落边缘的同一 圆周上打取菌饼 ,接
15、种到含有不同药剂浓度的培养基平板上 , 每皿一片 ,置于 25 恒温箱内黑暗培养 7天 ,用十字交叉法测定 各处理的菌落生长直径 ,以清水为对照。每浓度处理重复 4次 。按照公式求出各个药剂浓度对菌丝生长抑制率 (%)。所得 数据经 Finney概率分析后用 DPS统计软件求出毒力回归方程 式及 EC50。 菌丝生长抑制率 (%)=1-(处理菌落直径 -菌饼直径 ) /(对照菌 落直径 -菌饼直径 )100 2019/9/20 17 原药 规格 类型 溶解度 溶解性 氰菌胺 95% 酰胺类 30.7mg/L 无 百菌清 96% 腈类杀菌剂 0.81mg/L 丙酮 20；二甲苯 80；二甲基亚砜
16、 20g/L 咯菌腈 97% 吡咯类 1.8mg/L 丙酮 190；甲醇 44；甲苯 2.7；正辛醇 20 嘧菌酯 97% 甲氧基丙烯 酸酯类 6mg/L 溶于甲醇，甲苯，丙酮；易溶于乙酸乙酯和二氯甲烷 氟环唑 96% 三唑类 6.63mg/L 丙酮 14.4；二氯甲烷 29.1mg/L 粉唑醇 95% 三唑类 130mg/L 丙酮 190；二氯甲烷 150；甲醇 69；二甲苯 12g/L 福美双 94% 18mg/L 二氯甲烷 170；甲苯 18；异丙醇 0.7g/L 多菌灵 97% 苯并咪唑类 29mg/L（ pH4 ） 丙酮 0.3；二甲基甲酰胺 5； 嘧霉胺 96% 嘧啶胺类 0.12
17、1g/L 丙酮 389；乙酸乙酯 617； 咪鲜胺 97% 34.4mg/L 丙酮 3500g/L；氯仿、乙醚、甲苯、二甲苯 2500g/L 苯醚甲环唑 96% 三唑类 15mg/L 乙醇 330；丙酮 610；甲苯 490g/L； 丙环唑 95% 三唑类 100mg/L 与丙酮、乙醇、甲苯和正丁醇互溶 表 3 拟采用的杀菌剂原药名录 2019/9/20 18 名称 制剂 规格 厂家 霉克定 可湿性粉剂 2亿个 /克 山东嘉禾化工有限公司 噻菌铜 悬浮剂 20% 浙江龙湾化工有限公司 枯草芽孢杆菌 可湿性粉剂 1000亿芽孢 /克 黑龙江强而生化技术开发有限公司 蜡质芽孢杆菌 可湿性粉剂 30
18、0亿个 /克 香港帅克化学国际有限公司 儿茶素 可湿性粉剂 1% 黑龙江平山林业制药厂 咪唑喹啉铜 可湿性粉剂 50% 上海绿油油化工有限公司 吗孤乙酸铜 可湿性粉剂 20% 齐齐哈尔华丰化工有限公司 嘧菌酯 悬浮剂 25% 英国先正达作物保护公司 腈苯唑 悬浮剂 24% 英国陶氏益农公司 烯唑醇 可湿性粉剂 12% 安阳市国丰农药有限公司 苯醚甲环唑 水分散粒剂 10% 深证诺普信农化工有限公司 咪鲜胺锰盐 可湿性粉剂 50% 德国拜耳作物科学公司 代森锰锌 WP 80% 江苏新 中兴化工有限公司 代森联 水分散粒剂 70% 德国巴斯夫欧洲公司 甲基硫菌灵 可湿性粉剂 70% 河北石家庄市伊
19、诺生化有限公司 福美双 水分散粒剂 80% 新加坡立农 溴菌腈 可湿性粉剂 25% 江苏托球农化工有限公司 嘧霉胺 可湿性粉剂 25% 浙江禾本农药化学有限公司 腐雷利 可湿性粉剂 50% 英国汉特生物科技（北京）发展有限公司 丙森锌 可湿性粉剂 70% 德国拜耳作物科学公司 中生菌素 可湿性粉剂 3% 福州凯立生物制品有限公司 三唑酮 可湿性粉剂 15% 江苏剑牌农药化工有限公司 多菌灵 可湿性粉剂 80% 太仑市农药厂 噁霉灵 内吸性土壤杀菌剂 99% 延边西爱斯开化学农药厂 氟硅唑 乳油 40% 深证诺普信农化工有限公司 戊唑醇 悬浮剂 43% 拜耳作物科学（中国）有限公司 氢氧化铜 可
20、杀得 46% 上海杜邦农化有限公司 异菌脲 悬浮剂 25% 深证诺普信农化工有限公司 丙环唑 乳油 25% 深证诺普信农化工有限公司 百菌清 悬浮剂 40% 深证诺普信农化工有限公司 乙唑醇 微乳剂 5% 广东省惠州市中讯化工有限公司 腈菌唑 乳油 12% 深证诺普信农化工有限公司 表 4 拟采用的杀菌剂制剂名录 2019/9/20 19 3.通过花生黑腐病菌对嘧菌酯的敏感性检测及抗药性风险的 研究，有助于明确花生黑腐病菌是否对该杀菌剂产生抗药性 及抗药性风险大小。供试花生黑腐病菌株来自华南农业大学 植物病理系杀菌剂与抗菌化合物实验室。不同地理分布菌株 65株。菌株编号及地理分布（略）。 20
21、19/9/20 20 拟解决问题 建立快速检测花生黑腐病菌的常规 PCR技术 。 筛选出对花生黑腐病防治效果好的杀菌剂， 应用于生产实践。 2019/9/20 21 技术路线 花生黑腐病分离鉴定 典型菌株检测 广东省花生病害样品采集 普通 PCR 菌体直接 PCR 花生种子 PCR 土壤样品 PCR 实时 PCR 引物浓度影响 退火温度影响 灵敏度检验 多重 PCR 退火温度影响 不同引物组合 灵敏度检验 杀菌剂筛选 敏感性基线 2019/9/20 22 预期成果 1. 建 立一种在花生繁殖材料等植物材料中，在花生种子中 ，设计检测花生黑腐病菌的特异引物，建立常规 PCR技 术，快速准确地检测
22、潜在花生黑腐病菌的分子检测方法 。 2. 测 量 20多种杀菌剂对花生黑腐病菌的抑菌作用，得出不 同杀菌剂的 EC50。筛选出对花生黑腐病菌有较好抑制作 用的杀菌剂，并试验性进行温室药效试验。建立一种杀 菌剂（拟定为嘧菌酯）对花生黑腐病菌敏感性基线。 3. 在 核心期刊上发表高水平论文 12篇。 2019/9/20 23 项目特色与创新之处 花生黑腐病菌 Cylindrocladium parasiticum (Bell Crous et al., 1993)列为国家进境植物检疫性病原菌。 国内对该病害的报道很少，我们以国家检疫性病原菌为材 料，开展花生黑腐病检测技术及防治策略的研究，在国内
23、为首次进行。现在检疫部门对花生黑腐病菌检测主要靠选 择性培养基，灵敏度差，特异引物将推动快速检测花生黑 腐病菌技术的发展。建立嘧菌酯对花生黑腐病菌敏感性基 线也为首次进行。 2019/9/20 24 参考文献 1 Bell D. K. ,Sobers.E. K. 1966.A peg, pod, and root necrosis of peanuts caused by a species of CalonectriaJ. Phytopathology 56:1361-1364. 2 Crous. P.W, Wingfield .M.J., Alfenas. A. C. 1993. Cyli
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