1、 DNA 片段的 PCR 扩增 PCR 是一种在体外迅速扩增 DNA 片段的技术，这一技术在遗传疾病的诊断、 刑侦破案、古生物学、基因克隆等方面都有着广泛的应用，本课题的目标是了 解 PCR 技术的基本原理，并尝试用 PCR 技术扩增 DNA 片段。 一、PCR 反应组分 PCR 技术扩增 DNA 的过程，与细胞内 DNA 复制过程类似： 细胞内 DNA 复制条件分析： 条件 组分 作用 模板 DNA 的两条单链 提供复制的模板 原料 四种脱氧核苷酸 合成 DNA 子链的原料 酶 DNA 聚合酶 催化合成 DNA 子链 能量 ATP 为解螺旋和合成子链供能 引物 一 小 段 单 链 DNA或
2、RNA 为 DNA 聚合酶提供合成的 3端起点 PCR 反应体系 10x Buffer 5 L MgCl2（25mM） 5 L dNTP (2.5mM) 1 L 上游引物(10pmol) 1 L 下游引物(10pmol) 1 L Taq 酶（5u/L） 0.5 L 模板 DNA 1 L ddH2O 35.5 L Total 50 L 二、PCR 的反应过程 PCR 利用了 DNA 的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合， 现在使用的 PCR 仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。 PCR 一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤变性、 复性和延伸。 1.变性（模板 DNA
3、 解旋） 模板 DNA 经加热至 90以上。一定时间后，使模板 DNA 双链解离，使成为 单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。 2.复性（退火） 模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降到 50左右，引物与模板 DNA 单链 的互补序列配对结合。 3.延伸 DNA 模板引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以 母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的 DNA 链。 循环数 变性 复性 延伸 第一次 94 C，10min 30 次 94，30s 55，30s 72，1min 最后一次 72，10min 三、PCR 产物的检测 教材中用分光光
4、度计检测 DNA 含量，个人认为不如电泳检测法。因为分光 光度计检测法，只能说明 DNA 含量增加了，没有电泳检测法形象、直观、经济。 琼脂糖凝胶电泳步骤如下： （1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。 （2）配制浓度为 1%（1 g/100 mL）的琼脂糖凝胶。在锥形瓶中，称取一 定量的琼脂糖粉，加入适量蒸馏水，在微波炉内加热，使琼脂糖粉熔化，然后 冷却至 60 ，倒入电泳槽中，待其凝固。 （3）配制 1 倍的 TAE 电泳缓冲液 100 mL。 （4）向电泳槽中缓缓倒入配制好的电泳缓冲液，以没过胶面 2 mm 为宜。 小心移去梳子，注意不要破坏加样孔。如果样品孔内
5、有气泡，应设法除去。 （5）在 DNA 样品中加入相当于样品 0.2 倍体积的载样缓冲液 （10baffer），混匀后，加入样品孔内。 （6）接通电源。一般红色代表正极，黑色代表负极。DNA 样品是由负极向 正极移动，因此要保证靠近加样孔一端的电极为负极。电压为 150 V/cm(长 度以两个电极之间的距离计算)。 （7）当指示剂移动到凝胶中间时，断开电源，终止电泳。一般 200400 个核苷酸长度的 PCR 产物，在 50 V 电压下，电泳 2040 min 即可。 （8）将凝胶放入溴化乙锭溶液（EB）中染色后，在紫外仪上观察电泳带及 其位置，判断扩增产物的情况。 四、PCR 操作演示 现场
6、实际操作，已做过预实验。边操作变讲解。 注意事项：1 PCR 各反应成分的用量（不同材料、不同目的，用量均有 差异。其中 Taq 酶、dNTP 的用量很关键）；2.PCR 反应程序设置（退火温度是 主要影响因子）。 五、PCR 的常见问题 1.假阴性，不出现扩增条带 1）模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有 Taq 酶抑制剂，模板中蛋白质没 有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理， 模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜 随意更改。 2）酶失
7、活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够 而导致假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。 3）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条 带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高， 一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物 的浓度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现， 而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做 PCR 有可 能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，
8、在稀释引物时要 平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致 引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。 4）Mg2+浓度： Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增 的特异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。 5）反应体积的改变：通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul、30ul、50ul。或 100ul， 应用多大体积进行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 6）
9、物理原因：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可 能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响 引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪 或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是 PCR 失败的原因之一。 7）靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列 某段缺失使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。 2 假阳性 出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同
10、源性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。 需重新设计引物。 2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的 交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶 序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应 高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和 试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶 序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出 PCR 产物
11、，而导致假 阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。 3.出现非特异性扩增带 PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引 物聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR 循环次数过多有关。 其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量 过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换 另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或 采用二温度点法(93变性， 6
12、5左右退火与延伸) 。 4.出现片状拖带或涂抹带 PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP 浓度过高，Mg2+ 浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有： 减少酶量，或调换另一来源的酶。减少 dNTP 的浓度。适当降低 Mg2+浓度。增加 模板量，减少循环次数。 六、教材习题 1.引物设计原则？ 1）引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计。 2）引物长度一般在 1530 碱基之间。 因为过长会导致其延伸温度大于 74，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。 3）引物 GC 含量在 40%60%之间 上下游引物的 GC 含量不能相
13、差太大。有效启动温度，一般高于 Tm 值 5。 4）引物 3端要避开密码子的第 3 位。 因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5）引物 3端不能选择 A，最好选择 T。 当末位的碱基为 A 时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为 T 时，错配的引发效率大大降低。 6）碱基要随机分布。 是降低引物与模板相似性的一种方法，减少错配。 7）引物自身及引物之间不应存在互补序列。 避免发夹结构和二聚体的产生。 8）引物 5 端和中间G 值应该相对较高，而 3 端G 值较低。 G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性， G 值越大，则双链越稳定。引物 3 端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构 并引发 DNA 聚合反应。 9）引物的 5端可以修饰，而 3端不可修饰。 引物的 5 端决定着 PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰 而不影响扩增的特异性。引物的延伸是从 3 端开始的，不能进行任何修饰。3 端也 不能有形成任何二级结构可能。 10）扩增产物的单链不能形成二级结构。 某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二 级结构区域。 11）引物应具有特异性。
