1、影响凯氏定氮法测定粗蛋白准确性应注意的问题 随着饲料行业的飞速发展，饲料原料及其饲料产品的价格也居高不下。而粗蛋 白的检测是评定饲料原料及其产品的重要指标之一，目前常用的为凯氏定氮法 （经常使用粗蛋白测定仪来测定饲料总粗蛋白的含量），即国家颁布的饲料 中粗蛋白的测定方法(GB1996-6432)。但是该方法也存在着测定过程较复杂、 费时等缺陷，测定时除严格按照规定程序操作外，还需要一定的实验技巧和实 践经验。因此有很多饲料企业在实际操作过程中总是出现各种问题，导致检测 结果异常而不知如何去分析。本文以 GB/T6432-1994 为准，针对影响凯氏定氮 对测定结果标准性应注意的细节问题和大家共
2、同探讨。 1 试剂的配制 粗蛋白测定中所用的化学药品如浓硫酸、盐酸、氢氧化钠、硼酸、硫酸铜、硫 酸钾( 硫酸钠)、硫酸铵、蔗糖等均为化学纯试剂，标定盐酸标准溶液用的无水 碳酸钠为基准试剂。在配制试剂前一定要用 p H 试纸或酸度计检测一下蒸馏水 是否为中性，所用的烧杯、试剂瓶等配液设备清洗干净。 1.1 盐酸标准溶液的配制 配制的盐酸标准溶液尽量为低浓度，一般 C(HCl)=0.02 0.05mol ? L-1。低 浓度虽然用量大，但可减少操作误差和读数误差。配制盐酸标准溶液一定要严 格按照标准操作进行，基准无水碳酸钠已定于 270 300灼烧至恒重，称准 至 0.0001g，做 4 6 个平
3、行样，去掉最高值和最低值后取平均值，同时还要 做空白试验。盐酸标准溶液的配制量尽量不要太多、使用时间太长，防止水分 蒸发和盐酸挥发而影响其浓度的准确性。 1.2 其他试剂的配制 400g ? L-1 氢氧化钠溶液、20g ? L-1 硼酸溶液、混合指示剂(1g ?L -1 甲基 红乙醇溶液与 5g ? L -1 溴甲酚绿乙醇溶液等体积混合) 等主要是在称量时要 做到快、准、稳，再就是防止使用时间太长，特别是混合指示剂不要超过 3 个 月。 2 试样的选取和制备 2.1 采样 饲料原料及产品的容积和质量往往很大，因此所采集的样品必须 具有代表性，否则，即使一系列的分析工作非常精密、准确，其意义都
4、不大， 有时甚至会得出错误的结论，所以应采用正确的采样方法。采样应从具不同代 表性的区域取几个样点，然后充分混合为整个饲料的代表样品，然后再从中分 出一小部分作为分析样品。在采样过程中应做到随即、客观，避免受人为和主 观因素的影响。还有一点应该注意，就是所采集的样品必须具有一定数量。其 采集数量的多少应视饲料原料和产品水分含量、颗粒大小、均匀程度以及平行 样的数量而酌情定夺。 2.2 分样 所采集的样品往往较多，而检测时所用试样往往较少，因此要对所 采集的样品进行缩分。在多数饲料公司以及检测机构中一般采用方便简单的四 分法。有条件的单位可采用分样器进行分样。 2.3 粉样 饲料的样品一般为颗粒
5、状，所以要对所分得的试样进行粉碎。粉碎 所用的设备一般为咖啡磨或植物样本粉碎机，试样粉碎后一般过 40 目筛，且 一定要把粉碎后的试样及粉碎机中残留的部分清扫后充分混合均匀，避免粉碎 的试样分级而影响分析结果的准确性。对于一些不易粉碎的粗饲料如秸秆渣等 在粉碎机中会剩留极少难以通过筛孔，这部分一定不要丢掉，应尽力弄碎后一 并均匀混入样品中，避免引起分析误差。 2.4 称样 试样的用量标准中规定为 0.5 1g，为保证分析结果的准确性，在分析过程 中应根据试样蛋白质含量的高低来决定所称试样的重量，如浓缩料、鱼粉、玉 米蛋白粉、豆粕等高蛋白的试样可控制在 0.5 1g 之间，玉米、秸秆、苜蓿 等低
6、蛋白、粗饲料试样可适当增加到 2 3g 左右，以增加测定结果的准确性 。还应注意一点，在称量时尽量用电子分析天平，准确到 0.0001g 且无损地放 入凯氏烧瓶或者消化管中。 3 消化 3.1 催化剂及其用量 在环境污染小、价格便宜、催化效果好的前提下，目前催化剂多为硫酸铜和无 水硫酸钾( 或无水硫酸钠)。其添加量不同公司差异较大，其中硫酸铜: 无水硫 酸钾( 或无水硫酸钠) 主要有 19、110、115 和 117 等，国标为 0.4g 硫酸铜和 6g 无水硫酸钾( 或无水硫酸钠)，比例为 112。若添加量加大，消 化液易结块不易转移；添加量减少，消化时间加长或者消化不完全。建议大家 按国标
7、执行为好。亦可根据自己的经验以及试样的多少、消化的难易程度、蛋 白含量的多少自行调整。 3.2 硫酸的用量 浓硫酸的用量应视试样的重量、含水量及其所含蛋白高低而适当调整。对于体 积大重量轻的粗饲料、高蛋白饲料或者含水量较高的试样、淀粉含量多的精料, 应适当加大浓硫酸的用量，多为 15mL 左右。这是由于此类样品，浓硫酸在对 其脱水和碳化是消耗量加大，当加入的浓硫酸量不足或者刚刚够试样脱水和碳 化时就会出现烧干现象。反之则需加入 10mL 左右。若通风柜的排风量较大时 应适当多加浓硫酸 2mL 左右，以防止浓硫酸的蒸发而使其浓度降低，试样消化 不完全从而导致所测得的数值偏低。 3.3 消化温度
8、刚开始时以低温(200 300 ) 加热，待试样焦化泡沫消失后，逐步缓慢提 高温度(360410 )。起初低温加热是为防止试样起泡沫，而溢出烧瓶外或碳 化后的颗粒粘附于烧瓶壁，导致消化不完全，所测结果偏低。对于富含脂肪或 者在消化过程中易发泡的样品，可在消化前滴加少量消泡剂，如辛醇、液体石 蜡等。 3.4 消化时间 消化时间也是许多文献一直在探讨的问题，也有许多快速消化法的研究。其消 化时间的标准为消化呈透明蓝绿色后，再加热消化 15min。根据苏军等研究表 明，消化液澄清后再继续消化 30min 为宜。此试验只是针对于蛋白含量低于蚕 蛹的样品，而对于蛋白含量高于蚕蛹的样品，如进口鱼粉、血粉、
9、羽毛粉等并 未进行试验性研究。因此我个人认为，可根据试样的重量、蛋白含量的多少以 及消化的难易程度而适当调整消化液澄清后的消化时间。对于所称试样质量较 多、蛋白含量高于蚕蛹或者难消化的试样，消化液澄清后继续消化的时间可控 制在 45m i n 2h 不等，具体时间化验工作者可根据自己的工作经验而自行 定夺。 3.5 消化液的转移及定容 消化结束后，把凯氏烧瓶从电炉上取下，放在小铁筐内冷却。此时一定要注意 安全，带稍厚手套防止烫伤。冷却至室温后加入蒸馏水 10 20m L，在等冷 却至室温后转移到 100m L 容量瓶内。再转移是为减少损失误差，应在容量瓶 口上加上漏斗，且要用少量蒸馏水多次洗涤
10、烧瓶和漏斗( 即采用少量多次原则) ，否则会因偶然误差而导致测定结果偏低。转移完成后不要立即定容，应冷却 至室温后再定容。若未冷却而定容，待冷却后，体积缩小，从而使吸取的试样 分解液的量偏大，测定结果将偏高。若消化完毕冷却后，消化液不能当天定容 需隔夜保存时，应先将凯氏烧瓶内加入少量的蒸馏水，防止消化液结晶，再把 凯氏烧瓶口用塑料布包好，防止吸收空气中的氨而影响结果的准确性。消化液 若结晶不易转移时，可将凯氏烧瓶放在电炉上加热一下，待结晶融化后再转移 。 4 蒸馏 4.1 蒸汽发生器内水的体积及酸碱性 蒸汽发生器内的水的体积应控制在其容积的 2/3 左右，并控制液面高度。水的 体积过大易在沸腾
11、后从蒸汽发生器中玻璃管中溢出烫伤工作人员；过少易产生 的气体压力不足或蒸干蒸汽发生器发生事故。水加入的同时一同加入几滴硫酸 和几滴混合指示剂，且保持水一直呈紫红色，以防止水中含有氨态的氮溢出而 影响测定值。 4.2 蒸馏装置的气密性 在蒸馏操作开始前一定要检查一下蒸馏装置的气密性。各导管的接口及用久的 橡皮管应重点检查。添加消化液和碱液的玻杯口要拧紧、液封，防止产生的氨 气逸出。在检查气密性的同时还应打开冷凝水开关且要保持一定的流速，否则 冷却不完全。这是很容易忽视的问题，特别是初学者。 4.3 试样分解液的移取要准确 在移取试样分解液前先把容量瓶摇匀,把 10m L 移液管用所要取的试样分解
12、液 润洗 2 3 次后，再进行移取。移取时移液管应垂直于地面，视线与移液管 刻度线平行。吸取完试样液后把移液管放到反应室内自然流入反应室，切忌把 移液管放到小玻杯内及用吸耳球吹移液管。最后再用少量蒸馏水冲洗一下小玻 杯，并把棒状玻塞塞紧。 4.4 氢氧化钠溶液的加入量 在蒸馏过程中，反应室内溶液应保持碱性，碱的加入量一般为 10m L 左右，若 在消化时所加入的硫酸偏多，40% 氢氧化钠溶液的量也要随之增加，这样才能 保证除用于和硫酸及硫酸铜反应外，还有足以使氨根转化为氨的碱量。加入的 碱先放入小玻杯内，慢慢转动棒状玻塞，使碱缓慢流到反应室内，然后再将小 玻杯内加入蒸馏水液封，切忌把棒状玻塞提
13、起加碱特别是初学者，这样会造 成反应后生成的氨从玻口逸出，导致所测蛋白含量偏低。 4.5 蒸馏速度与气流 蒸馏时产生的气流一定要均匀，切忌热力不稳、中途中断或蒸汽不足，否则反 应室内温度会降低，易产生倒吸；气流过快硼酸吸收不完全。蒸馏的速度除与 气流有关外还与冷却水的流速及电路的温度有关。蒸馏速度快，反应液易被蒸 汽带出而使测定结果偏高；蒸馏速度慢，氨没有被完全蒸馏出来而结果偏低。 那么以什么样的蒸馏速度为宜呢？据贾艳玲和冷柏忠(2000) 实践证明： 蒸馏 速度一般应控制在每分钟蒸馏出液体在 5 7mL 之间。 4.6 蒸馏时间 蒸馏时间多为 5m i n，加入试样分解液及氢氧化钠后蒸馏 4
14、m i n , 使冷凝管 末端离开硼酸液面后再蒸馏 1m i n。但是标准中并未规定从何时开始计时，据 谢文飞(2003) 的试验证明，在蒸馏完 4m i n 钟后再多蒸馏 1 2mi n 对结 果没有什么影响，所以可以从硼酸刚刚出现绿色时开始计时蒸馏 4min( 硼酸出 现绿色说明反映已经开始)。最终在 4min 后是否蒸馏完全可用 pH 试纸进行检 测。在蒸馏时还应注意硼酸的吸收温度。硼酸是极弱的酸，只起吸收氨的作用 ，但要注意硼酸吸收液温度不应超过 40，否则氨的吸收减弱导致结果偏低。 4.7 反应室的冷却与洗涤 首先在蒸馏完毕，将冷凝管末端用蒸馏水冲洗后，再将锥形瓶移开进行滴定。 清洗
15、反应室时严禁将蒸馏瓶两侧的阀门同时关闭，以免发生爆炸。反应室清洗 一定要彻底，一是防止残留液影响下次测定结果的正确性；二是给反应室降温 。如果反应室温度很高，再加之加入的氢氧化钠与硫酸反应放出的大量热，易 产生爆沸，将反应液冲入冷凝管，造成实验失败。另外反应室温度高，反应剧 烈，有部分氨硼酸吸收不完全而逸出，测得的结果将偏低。一般反应室温度降 至不烫手即可。 4.8 锥形瓶的预处理 锥形瓶往往用洗衣粉洗涤，再用自来水、蒸馏水冲洗。洗衣粉不易彻底冲洗干 净，导致锥形瓶内壁环境偏于碱性；另外各地自来水的 p H 不同，所制的蒸馏 水 p H 有时也会偏离中性，这样都会导致测定结果出现偏差。建议把锥
16、形瓶进 行预处理后再使用，其方法为：冲洗干净的锥形瓶加入 20mL 蒸馏水、2 滴混 合指示剂，再用 0.02mol ?L -1 的盐酸溶液或者 0.02m o l ? L -1 的氢氧化 钠溶液滴定至刚好由蓝色变为灰红色，然后倒掉该液体后，再加硼酸吸收液 25 35m L 和混合指示剂 2 3 滴。若加入指示剂后硼酸为蓝色，则说明硼酸 中混入碱性物质或蒸馏水偏碱性，需重新配制硼酸溶液。锥形瓶的预处理虽然 比较繁琐，但是可减少由于锥形瓶本身环境的 p H 偏离中性对测定结果的影响 。 4.9 滴定 滴定是整个实验过程的最后一步，至关重要，否则整个实验将前功尽弃。滴定 前把盐酸标液瓶摇匀后，把酸
17、式滴定管润洗 2 3 次后加入盐酸标液排除气 泡，记下刻度值，开始滴定。滴定时一定要控制好滴定速度，待接收液由浅绿 色逐渐变成无色时要放慢滴定速度，逐滴加入盐酸标液，接收液变成浅红色时 为滴定终点，切勿滴过量。 5 空白测定 5.1 试剂空白测定 另取凯氏烧瓶或者消化管一个，加入硫酸铜、无水硫酸钾( 或无水硫酸钠)、浓 硫酸，其中每个药品的加入量与试样消化时的加入量相同，加热消化至溶液呈 透明的蓝绿色。其后的操作步骤完全相同。这样可以校正试剂不纯所发生的误 差。 5.2 试样空白测定 称取 0.5g 分析纯蔗糖代替试样，以后各种试剂的用量及操作步骤完全相同。 其标准为，空白测定消耗 0.1m
18、o l ? L -1 盐酸标液体积不超过 0.2mL；消耗 0.02mol ?L-1 盐酸标液体积不超过 0.3mL。以上两个空白测定并不需要每次都 要做，隔一段时间操作一次即可，但是在更换药品试剂、标准溶液时一定要做 空白实验测定。若空白值超标，一般是由于所用试剂级别不够或不纯、蒸馏水 不纯、玻璃器皿清洗不干净等原因造成。 6 蒸馏装置及操作准确性检测 在进行样品检测的同时，精确称取 0.2000g 分析纯的硫酸铵代替试样，直接定 容 100m L 后进行蒸馏、滴定，测得硫酸铵含氮量为 21.19% 0.2%，以校正蒸 馏装置的气密性和加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。 7 计算时换算系数的处
19、理 我们在计算蛋白含量时多乘以平均系数 6.25，对于粗蛋白质中含氮量尚未确定 的可以乘以平均系数，对于已经确定的则不妥，以豆粕为例：如果测定豆粕和 以豆粕为主要原料的浓缩饲料的粗蛋白质含量时，用 6.25 作为蛋白质的换算 系数的话，比大豆的实际换算系数 5.70 扩大了 0.54 倍，相对误差将在 8% 左 右，因此对于已经确定的换算系数就用实际系数来换算，例如荞麦、玉米用系 数 6.00，大豆、豌豆、蚕豆、燕麦、小麦、黑麦、箭舌草等用系数 5.70，黄豆 用系数 5.71，大麦用系数 5.83，棉籽、芝麻、葵花籽用系数 5.30，花生用系 数 5.46，全脂大豆粉用系数 5.72，牛奶用系数 6.38。以上是用凯氏定氮法测 定饲料中蛋白质含量的一些体会、经验，与大家共同探讨
