1、基因操作原理电子教案 第一章 基因操作原理的理论基础 第一节 基因操作原理 基因操作（Gene Manipulation）的核心部分为分子克隆（molecular cloning） 。由于 政府对基因操作有一定的法律约束，大多数国家对此都有一个精确的法律定义。比如在英 国将基因操作定义为将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒、质粒或其它载体系 统中，再整合到那些本来不含该类物质的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。 （引自 Principles of Gene Manipulation ，Black well Scientific Publications , RW. OLD As
2、akawa et al. 1997） 。 Not 识别序列，位点十分稀少。重组子通过 Not 消化后，可以得到完整的插入片 段。 Sp6 、 T7 是来源于噬菌体的启动子，用于插入片段末端测序。图 3-28 是 pBeloBAC11 遗传结构图。 BAC 与 YAC 和 PAC（P1 artificial chromosomes ， P1 人工染色体 ） 相似，没有 包装限制，因此可接受的基因组 DNA 大小也没有固定的限制。大多数 BAC 文库中克隆 的平均大小约 120kb ，然而个别的 BAC 重组子中含有的基因组 DNA 最大可达 300kb 。 F 质粒能够编码形成性菌的蛋白，通过大
3、肠杆菌的结合转移可以进行遗传物质的转移。 但是基因操作的时候一般不用这种自发的转化方式。 BAC 载体空载时大小约 7.5kb ，在 大肠杆菌中以质粒的形式复制，具有一个氯霉素抗性基因。外源基因组 DNA 片段可以通 过酶切、连接克隆到 BAC 载体多克隆位点上，通过电穿孔的方法将连接产物导入大肠杆 菌重组缺陷型菌株。装载外源 DNA 后的重组质粒通过氯霉素抗性和 Lac Z 基因的 互补筛选。 三、P1 噬菌体载体和 P1 人工染色体载体 1P1 噬菌体载体（Bacteriophage P1 vectors） 是 Sternberg 基于 P1 噬菌体构建的，与黏粒载体工作原理比较相似的一种
4、高通量载 体。它含有很多 P1 噬菌体来源的顺式作用元件，能容纳 70100kb 大小的基因组DNA 片段（Sternberg 1990, 1992, 1994） 。在这种系统中，含有基因组和载体序列的线状重组 分子在体外被组装到 P1 噬菌体颗粒中，后者总容量可达 115kb （包括载体和插入片段） 。 将重组 DNA 注射到表达 Cre 重组酶的大肠杆菌中，线状 DNA 分子通过重组于载体的 两个 loxP 位点之间而发生环化。另外，载体还携带一个通用的选择标记 kan r ，一个区 分携带外源 DNA 克隆的阳性标记 sacB 以及一个能够使每个细胞都含有约一个拷贝环状 重组质粒的 P1
5、 质粒复制子。另一个 P1 复制子（ P1 裂解性复制子）在可诱导的 lac 启 动子（IPTG 诱导）控制下，用于 DNA 分离前质粒的扩增。图 3-29 是 P1 噬菌体载体 pAd10sacBII 的遗传结构图。 2P1 人工染色体（P1 artificial chromosomes） 结合了 P1 载体和 BAC 载体的最佳特性，包括阳性选择标记 sacB 及噬菌体 P1 的 质粒复制子和裂解性复制子。然而除了将连接产物包装进入噬菌体颗粒以及在 cre-loxP 位 点使用位点特异性重组产生质粒分子以外，在载体连接过程中产生的环状重组 PAC 也可 能用电穿孔的方法导入大肠杆菌中，并且
6、以单拷贝质粒状态维持 （Ioannou et al. 1994） 。代表性 PAC 载体 pCYPAC1 遗传结构图 见图 3-30 。基于 PAC 的人类基因组文库 插入片段的大小在 60kb150kb 之间。 第六节 表达载体 一、大肠杆菌表达载体 大肠杆菌表达载体都是质粒载体。作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求， 即能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中。在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表 达载体。各种表达载体的不同之处在于其表达元件的差异。 1表达融合蛋白的表达载体 当蛋白质表达以后，有效的分离纯化或分泌就成为获得目标蛋白的关键因素。通过以融 合蛋白的形式表达，并利用载体编码
7、的蛋白或多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯 化。用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽 （Tag ） ，常用的有谷胱甘肽转移酶 （glutathione S-transferase, GST） 、六聚组氨酸肽（polyHis-6） 、蛋白质 A（protein A） 和纤维素结合位点（cellulose binding domain）等。 1.1 表达 LacZ 融合蛋白的载体 如 pEX1/2/3 载体（图 3-31） ，P R 受 cIts857 控制，宿主 M5219 含缺陷性原噬菌体， 编码 cIts857 和 N 蛋白。 cIts857 强烈抑制基因转录。 N基因可使 RNA
8、 polymerase 跨 过基因内部潜在终止位点。 一般采用 42-45 灭活 cIts857 阻遏物，此处采用 40 以减 少热激蛋白的诱导并使细菌能继续生长。因为温度转换不仅可诱导 PL/PR 启动子，也可 诱导热激基因，而后者有些可编码蛋白酶。 1.2 表达 GST 融合蛋白的表达载体 GST 表达载体在启动子 tac 和多克隆位点之间加入了两个与分离纯化有关的编码序 列，其一是谷胱甘肽转移酶基因，其二是凝血蛋白酶（Thrombin）切割位点的编码序列。 当外源基因插入到多克隆位点后，可表达出由三部分序列组成的融合蛋白。 GST 是来源 于血吸虫的小分子酶（ 26kDa） ，在 E.c
9、oli 易表达，在融合蛋白状态下保持酶学活性，对 谷胱甘肽有很强的结合能力。 将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白的全细胞提取物通 过层析柱时，融合蛋白将吸附在树脂内，其它细胞蛋白就被洗脱出来。然后再用含游离的 还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱，可将融合蛋白释放出来。再用凝血蛋白酶切割融合蛋白， 便可获得纯化的目标蛋白。除了凝血蛋白酶的切割位点外，其它还有 Xa 因子（Factor Xa）和肠激酶。 1.3 利用 T7 噬菌体启动子的表达载体 表达载体 pET-5a 是典型的 pET 载体（图 3-32） ，其组成是在载体的基本结构的基 础上加入了 T7 噬菌体启动子序列及其下
10、游的几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶切 位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。大肠杆菌中 T7 启动子表达调控模式图见图 3-33 。 1.4 分泌型表达载体 除了在细胞内表达外，还可让表达的蛋白分泌到细胞外或细胞周质区中。这种表达方 式可避免细胞内蛋白酶的降解，或使表达的蛋白正确折叠，或去除 N- 末端的甲硫氨酸， 从而达到维护目标蛋白活性的目的。 利用信号肽序列作为融合标签可将融合蛋白分泌到细胞外，可利用的信号肽有碱性磷 酸酶的信号肽和蛋白质 A 的信号肽。 表达载体 pEZZ18 的表达元件有 lac 启动子、蛋白质 A 的信号肽序列和两个合成的 Z 功能域（domain ） （图
11、 3-34） 。来自金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）的蛋白质 A 具有与抗体 IgG 结合的能力， Z 功能域就是根据蛋白质 A 中结合 IgG 的 B 功能域 而设计的。融合蛋白表达后，在信号肽序列的指导下，分泌到培养基中。然后用固定了 IgG 的琼脂糖层析柱，通过与 ZZ 功能域的结合而得到纯化的融合蛋白。这个 14kDa 的 “ZZ” 肽链对融合蛋白的正确折叠几乎没有影响。 2非融合蛋白表达载体 2.1 pKK223-3 表达载体： M77749 4584bp pKK223-3 载体 4584bp（图 3-35） 。使用的启动子：tac 强启动子，杂合启动子
12、 trp- lac ；终止子： 5SrRNA 区域（rrnB 操纵子区域） ，rrnBT 和 rrnBT2 终止子（ 防止通读） 。受 lac 阻抑物调控， 1-5mM IPTG 诱导。 可直接表达任何含 RBS 和 ATG 的基因， 若无 RBS，其 ATG 需与固有RBS相隔5-13bp 。 2.3 其它 二、穿梭载体 穿梭载体（Shuttle vector）是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。如有 些载体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制，或能在 E.coli 中复制又能在革兰氏 阳性细菌中复制。这类载体主要是质粒载体。 1大肠杆菌/革兰氏阳性细菌穿梭载体 大肠杆菌/革兰
13、氏阳性细菌穿梭载体是典型的穿梭载体，其作用主要是将目标基因转移 到芽胞杆菌或球菌中去。 2大肠杆菌/酵母菌穿梭载体 酵母菌除了在真核生物的细胞生物学研究方面发挥重要作用外，在作为蛋白质的真核 表达系统方面也显示出巨大威力。 大肠杆菌 - 酿酒酵母穿梭质粒载体，含有分别来自大肠杆菌和酿酒酵母的复制起点与 选择标记，另有一个多克隆位点区。由于此类型的载体既可在大肠杆菌细胞中复制，也可 在酿酒酵母细胞中复制，因此在遗传学研究中很受欢迎。它使研究工作者可自如的在两种 不同的寄主细胞之间来回转移基因，并单独或同时在两种宿主细胞中研究目的基因的表达 活性及其它的调节功能。 3其它穿梭载体 在哺乳动物、植物
14、、昆虫细胞等细胞中使用的表达载体或其它载体，一般都有在大肠 杆菌中复制的元件，因此都具备穿梭载体的特征。 三、整合载体 在生物学研究和基因工程应用中，会涉及将某个基因或某些基因插入到染色体中去的 工作，承担这部分工作的载体，可称为整合载体（integration vector） 。根据整合方式的不 同可分为定点整合和随机整合，按其作用来分可归为目标基因的插入或敲除以及随机突变 体库的构建。 1基因插入 / 基因敲除 同源重组整合载体是最常用的整合载体，该载体一方面含有大肠杆菌克隆载体的骨架， 更主要的是含有一段便于同源重组的重组 DNA 片段。也就是从染色体上待插入位点处取 出一段 DNA,
15、将选择标记基因和多克隆位点插入到这个片段中间得到这一重组 DNA 片 段。 2随机插入突变载体 随着功能基因组研究的发展，不断需要一系列发生基因突变的材料。为了满足这一要求， 构建随机突变体库便进入到研究工作中。随机突变体库是指标记基因在载体的携带下通过 DNA 重组事件随机插入基因组中而形成的突变体的集合。 为了提高标记基因插入到基因 组中的频率，一般都要借助转座子来帮忙。 第四章 大分子的分离和分析 本章摘要 DNA 的分离中，质粒的分离是最多的，主要使用碱裂解法。 DNA 凝胶电泳有琼脂 糖凝胶电泳和 PAGE 两种。从琼脂糖凝胶中回收 DNA 的方法很多，根据待回收的 DNA 片段大小
16、选择合适的方法。 RNA 的分离纯化主要是避免 RNA 酶的污染而降解目标分子。 分子杂交根据杂交的对象可以分为 Southern 、 Northern 和 Western 杂交，分别是 DNA 和 DNA ， DNA 和 RNA ，蛋白质和蛋白质的杂交。杂交的过程分为：转膜、预 杂交、杂交洗膜和检测等步骤。 DNA （或 RNA ）探针的标记方法很多，主要有：均匀 标记、单链探针标记和末端标记。不同的标记方法适用于不同的分子，标记方法不同要求 的工具酶也不一样。常见的标记物有放射性同位素和生化酶两种。 第一节 DNA 的分离、检测和纯化 DNA 是基因的物质载体，这些载体和基因绝大多数是以质
17、粒的形式保存在大肠杆菌 中，基因操作是从大肠杆菌开始的。 一、E.coli 质粒 DNA 的分离和纯化 1碱裂解法提取 E.coli 质粒 DNA 的方法 碱裂解法提取质粒 DNA 的方法是经典的方法，由 Birnboim 和 Doly 设计并于 1979 年发表。 溶液 （solution ）：悬浮细胞。该溶液中含有 50mM 的葡萄糖。 溶液 ： 2 倍溶液 体积。该溶液含有 0.2N NaOH 和 1% SDS 。在这种情况 下，细胞会很快破裂，使混浊的细胞悬液变成完全澄清的粘稠液体。此时，由于在 pH12.0-12.5 这样狭小的范围内，线性染色体 DNA 发生变性，而质粒 DNA（c
18、ccDNA ） 不会变性。 溶液 ： 1.5 倍溶液 体积。该溶液为高浓度的醋酸钾缓冲液 （3M, pH4.6） 。 在中和过程中，高分子量的染色体 DNA 复性并聚积成不溶的沉淀，同时高浓度的盐引起 蛋白质与 SDS 复合物以及大分子的 RNA 形成沉淀。而质粒 DNA 是环状的，在变性之 后经过中和仍保持环状，处于可溶解状态。经高速离心，上清液即为质粒 DNA 粗制品。 2通过试剂盒分离纯化 E.coli 质粒 DNA 操作过程如图 4-1 。 二、DNA 的电泳检测 1琼脂糖凝胶电泳 检测 DNA 是否真的存在，是否有降解现象，DNA 经限制性内切酶酶切后其产物的大 小。目前最成熟的检测
19、 DNA 的技术是琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖从海藻中提取的一种线状 高聚物，在 0.7% 的琼脂糖浓度下，对 0.8 10kb 的 DNA 有最佳的分离效果。 上样缓冲液：含有 40% 的蔗糖，用于将 DNA 样品沉积在点样孔内，使样品不易扩散； 还含有溴酚兰等指示剂，用于观察电泳的进程。 电压： DNA 样品都是约 pH8.0 进行保藏或分析的，在这一 pH 条件下， DNA 是带 负电的。因此 DNA 的泳动方向是从负极走向正极。一般电场的大小为 5 伏 / 厘米左右。 DNA 构象：质粒 DNA 有三种构象，即闭合环状超螺旋 （ccc 型） 、缺口环状 （nick）和线状，它们的泳动速率依次
20、递减。 染色：溴化乙啶可很好地掺入到双链 DNA 中，在紫外光的激发下会发出橙红色的荧 光，可用于对 DNA 进行染色和观察。 2聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶电泳可很好的分离 100bp-1kb 大小的核酸分子，对单链核酸来说，其 分辨率可达 1bp 。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N ，N- 亚甲双丙烯酰胺经过聚合而成的高分子聚合物， 其聚合度由浓度和二者的比例决定。一般在变性条件下使用，主要用来检测小分子核酸的 大小，或在同位素标记的情况下分析单链核酸，如分离寡核苷酸探针、 S1 核酸酶产物分 析和 DNA 测序等。 三、DNA 片段的纯化（从 agaroe） 1低熔点琼
21、脂糖凝胶电泳法 低熔点琼脂糖在水溶液中的溶解温度 （melting point）很低，在 65 以下；当温度降 低到 20-30 时凝结成固形物。如果需要分离特定的 DNA 片段，可用低熔点琼脂糖凝胶 进行分析，然后切割带有目标 DNA 的琼脂糖凝胶块，加入适量缓冲液，加热到 60 ， 凝胶溶化， DNA 进入水溶液中，最后通过苯酚 / 氯仿抽提和乙醇沉淀获得纯化的 DNA 片段。 2透析袋电洗脱法 将含有目标DNA片段的琼脂糖凝胶块切割下来，放在透析袋中，置于电泳缓冲液中电 泳， DNA 将从凝胶块中“ 跑 ”出来。常用于回收 5kb 以上的 DNA 片段。 3Glass Milk （bea
22、d）结合法 琼脂糖凝胶在 3 倍体积的 3M NaI 溶液作用下于 55 会溶化，从而将 DNA 释放到 水溶液中；在这样的高盐浓度下，有一种硅珠 （glass bead ，硅的细微颗粒，其水溶液呈 牛奶状，故亦称玻璃奶，glass milk）可特异性吸附 DNA 。当硅珠吸附 DNA 后，通过离 心的方法很容易对硅珠进行洗涤，然后用水或低盐缓冲液可从硅粒中将吸附的 DNA 洗脱 出来。 4Qiagen 纯化柱 第二节 RNA 的分离、检测和纯化 在细胞中除了DNA外还有RNA,即rRNA 、tRNA 和mRNA。对于基因操作来说，涉及到 的RNA主要是 mRNA，而mRNA在细胞中的含量又是
23、最少的。一个典型哺乳动物细胞约 含10-5mg RNA ，其中 80-85% 为rRNA（28S,18S 和 5S 三种 rRNA） ，其余1520% 主要由各种类型的低分子量 RNA 组成（如 tRNA ，核内小分子 RNA 等） 。mRNA 为总 RNA的 15% 。同时由于 mRNA 是单链的，容易受到核酸酶的攻击，导致在 RNA 的 操作过程中易于遭遇降解的厄运。因此，对 RNA 的操作要求比 DNA 的操作更严格，操 作时必须设置专门的处理方法和程序。 一、注意事项 - 控制潜在的 RNA 酶的活性 1用具和溶液的去 RNA 酶处理 用 0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC ）处理过的水
24、浸泡后再灭菌，或购买无 RNA 酶污染的 用具。对于电泳用具最好使用专用的，不要用于其它分析，在使用之前用洗涤剂洗涮干净， 再用 3%H 2O2 和 0.1% DEPC 处理的水浸泡，清洗干净。 2RNA 酶抑制剂的使用 为了进一步防范 RNA 降解，一般在 RNA 样品和 RNA 反应中加入 RNA 酶抑制剂， 现在应用较多的是蛋白类抑制剂，如人胎盘 RNase 抑制剂。除此之外，还有氧铜核糖核 苷复合物（完全抑制剂，且抑制体外翻译）和硅藻土（吸附 RNase 吸附剂） 。 二、 RNA 的抽提和纯化 1酚 - 异硫氢酸胍抽提法 TRIZOL 试剂是使用最广泛的抽提总 RNA 的专用试剂，由
25、 Gibco 公司根据酚 - 异 硫氢酸胍抽提法设计，主要由苯酚和异硫氢酸胍组成。对任何生物材料的 RNA 提取，首 先研磨组织或细胞，或使之裂解；加入该试剂后，可保持 RNA 的完整，同时进一步破碎 细胞并溶解细胞成分；加入氯仿抽提，离心，水相和有机相分离；收集含 RNA 的水相； 通过异丙醇沉淀，可获得 RNA 样品。 2硅胶膜纯化法 RNeasy 试剂盒是由 Qiagen 公司设计，其设计思路与 DNA 的分离纯化思路相似 （见图 8.1） ，也就是含有目标核酸的细胞破碎液通过硅胶膜时，核酸吸附在硅胶膜上， 从而与其它细胞成分分开，然后在低盐浓度下核酸可从硅胶膜上洗脱出来。 三、mRNA
26、 的纯化 mRNA 的纯化主要是针对真核生物而言的，由于真核生物 mRNA 的 3 端有一个 poly（A） 尾，可用亲和层析的方法纯化。有许多类型的商业化层析柱可用于 mRNA 的 纯化。 四、RNA 的电泳检测 RNA 的浓度和纯度可通过测试其OD 260 来判断，OD 260 为 1 时相当于浓度为 40 mg/ml 。而要直观地观察 RNA 的存在以至于分析，可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺 凝胶电泳来完成。 1琼脂糖凝胶电泳 通过琼脂糖凝胶电泳进行 RNA 分析和 DNA 分析的原理是类似的。不同的是， RNA 分析是在变性的条件下进行的。常用的变性剂为甲醛，也可使用氢氧化甲基汞和乙
27、 二醛 - 二甲基亚砜（DMSO） 。 2聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用来分析小分子量的单链核酸，如小分子量 RNA 寡核苷酸、 DNA 序列分析等。其变性条件可用加热方式，或使用尿素等变性剂。 第三节 蛋白质的 SDS-PAGE 一、检测蛋白质的分子量（见实验） 二、 Western blot （见本章第四节） 三、蛋白质氨基端序列测定 3.1 电泳 3.2 转膜 PVDF 3.3 染色、脱色 3.4 干燥、检测 第四节 分子杂交 分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定 核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及其分子量大小。根据其检测对象的不同可分
28、为 Southern 杂交、Northern 杂交和 Western 杂交，以及由此而简化的斑点杂交、狭线杂交和 菌落杂交等。 一、 Southern blotting 1转膜 当目标 DNA 经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳以后，在 0.4N NaOH 碱性条件 下变性，再在 1.5M NaCl/1M Tris（pH7.4） 条件下中和使 DNA 仍保持单链状态。然后 通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝胶上的 DNA 转移到硝酸纤维素滤膜或 尼龙膜上。最后通过 80 处理或紫外线照射将 DNA 固定在滤膜上。图 4-2是通过毛细管 渗吸法进行 Southern blotting
29、的经典装置图。 2分子杂交 2.1 预杂交 将结合了 DNA 分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用 鱼精 DNA 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。 2.2 杂交 在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的 DNA 分 子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。 2.3 洗膜 经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。 3检测 3.1 放射性标记、检测 在分子克隆操作中用于标记核酸分子的标记物主要是放射性同位素，如32P，33P和 35S 。在掺入核苷酸的标记过程中，只有三磷酸核苷酸的 位磷酸
30、整合到核酸链中，因此 使用 位磷酸被标记的三磷酸核苷酸，如 - 32 PdATP 。而在标记 5 末端磷酸基团的 反应中一般使用位磷酸被标记的 ATP 。放射性的信号通过X- 光片放射自显影或磷屏扫 描获取。 3.2 非放射性标记、检测。 其中应用最成功的是原德国宝灵曼公司开发的地高辛 （digoxygenin, DIG） 标记核酸 探针。将 DIG 与 dUTP 交联，在参入核苷酸的标记反应中用 DIG-11-dUTP （或 DIG- 11-UTP）取代 dTTP （或 rTTP） ，使探针 DNA 或 RNA 分子被 DIG 标记。 DIG 标记 的检测是该技术的核心，即利用抗 DIG 的
31、抗体通过酶联免疫反应来完成。将抗 DIG 的 抗体与碱性磷酸酶偶联，通过免疫反应将碱性磷酸酶携带到目标核酸分子处，在加入显色 剂 BCIP/NBT（5-溴 -4-氯-3-吲哚磷酸盐 / 盐酸氮蓝四唑） 后碱性磷酸酶与显色剂反应形 成浓紫色偏棕色沉淀，从而显示出目标分子的有无和位置。图 4-3 是通过地高辛标记探针 的 Southern 杂交实例。 图 4-3 ：通过地高辛标记探 针的 Southern 杂交结果 M，地高辛（DIG）标记的分子量标准 （lDNA/ Hind ） ； 1-3，苏云金芽胞杆菌 YBT-1520 菌株的总 DNA 分别经 KpnPst 、Pst 和 Kpn 酶切。 以
32、 cry1Aa 杀虫晶体蛋白基因中的 728bp 片段作探针，通过随机引物标记的方式， 用 DIG 标记探针。结果显示，该菌株至 少含有两个杀虫晶体蛋白基因，而且其拷 贝数明显不同。预示至少其中一个基因位 于多拷贝的质粒上。 通过放射自显影或生化检测，就可判 断滤膜上是否存在与探针同源的 DNA 分 子及其分子量。 Southern 杂交主要用来 判断某一生物样品中是否存在某一基因， 以及该基因所在的限制性酶切片段的大小。 应用该技术的前提是必须要有探针。 4探针的标记 在一个核酸样品中查找是否存在某一特定序列的分子可用分子杂交来检测，但首先要有 一段与目标核酸分子的序列同源的核酸片段。将该片
33、段标记后与样品核酸进行分子杂交， 通过检测标记核酸的存在从而判断样品中特定核酸片段的存在。用作检测的核酸片段即为 探针 （probe ） 。 4.1 均匀标记 间接标记不是标记探针分子本身，而是复制一段新的探针分子，在复制过程中掺入标 记的核苷酸（如 - 32 PdATP） ，从而使整个新分子被均匀地标记。 4.1.1 切口平移标记 这种标记方式目前只有通过大肠杆菌 DNA 聚合酶 来完成，只有该酶具有 5-3 外切活性。通过在待标记的 DNA 分子上产生切口，该酶引发 5-3 外切反应，在随后的 5-3 DNA 聚合反应中若存在标记的脱氧三磷酸核苷酸 （dNTP） ，新合成的核酸链就带有 标
34、记物。在整个标记反应体系中，待标记的 DNA 分子的任何一条链中的任何位点（除靠 近 5 端外）都可能作为标记反应的起始点，并持续到该链的 3 末端。因此，新合成的被 标记的分子可以代表该待标记的 DNA 分子的绝大部分核苷酸序列。 4.1.2 随机引物标记 利用由 6 个核苷酸组成的序列随机的寡核苷酸为引物，在 Klenow 酶的作用下对目 标 DNA 进行随机扩增。这样扩增出来的 DNA 产物包括从任意某个位点 （可能最靠近 5 的一些核苷酸除外） 起始的单链 DNA 片段，其整体应该包含了目标 DNA 所有核苷 酸序列信息。在扩增中加入标记的 dNTP ，扩增出来的 DNA 产物就可用作
35、探针。该方 法多用来标记一个 DNA 片段。 4.1.3 PCR 扩增标记 在PCR扩增时加入标记的 dNTP ，不仅能对探针 DNA 进行标记还可进行大量扩增， 尤其适合于探针 DNA 浓度很低的情形。 4.2 单链探针 4.2.1 单链 DNA 探针 单链 DNA 探针是通过单链模板来制备的。首先将待标记的双链 DNA 连接到 M13 噬菌体载体或噬菌粒载体上，制备其单链 DNA , 然后以单链 DNA 为模板，以对应于载 体上插入位点两端序列之一的通用引物为引物，在有标记的 dNTP 存在下，通过 Klenow DNA 聚合酶合成单链 DNA 。经过分离纯化后即可得到高质量的带标记的单链
36、 DNA 探 针。 4.2.2 单链 RNA 探针 在有些质粒载体的多克隆位点两端带有噬菌体的启动子，例如 pGEM-3 和 pBluescript 系列载体分别含有 T7/SP6 噬菌体启动子和 T7/T3 噬菌体启动子。将待标记的 DNA 片段插入载体的多克隆位点，在转录区下游选择一个酶切位点，用限制性内切酶将载体线 性化以防止转录出载体的序列和多联体产物。加入对应的噬菌体 RNA 聚合酶， rNTP 和 某个标记的 rNTP 在体外进行转录，合成出标记的单链 RNA 。利用无 RNA 酶活性的 DNA 酶处理以及后续纯化步骤可获得纯化的单链 RNA 探针。单链 RNA 探针的制备不 仅比
37、单链 DNA 探针更容易，而且其产生的杂交信号更强。 4.3 末端标记 直接将探针分子的某个原子替换为放射性同位素原子，或直接在探针分子上加入标记 的原子或复合物，这种直接标记一般是在探针分子的末端进行标记，亦称末端标。 4.3.1 DNA 片段的末端标记 末端标记主要通过酶促反应来完成，但标记的方式很多。如 Klenow DNA 聚合酶和 T4 或 T7 DNA 聚合酶在对 DNA 片段进行末端补平反应或平末端的置换反应时可引入标 记的核苷酸， T4 多核苷酸激酶可在 DNA 的 5 末端引入标记的磷酸基团或将 5 末端 的磷酸基团用标记的磷酸基团置换，末端转移酶可在 DNA 的 3 末端连
38、接标记的核苷酸。 4.3.2 寡核苷酸的标记 合成的寡核苷酸主要通过 T4 多核苷酸激酶在 5 末端引入标记的磷酸基团进行标记， 也可利用末端转移酶在 3 末端连接标记的核苷酸。 二、原位杂交 原位杂交就是将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的 菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解使 DNA 释放出来，并使之固定在滤膜上。然后通过 分子杂交，判断哪个或哪些菌落含有与探针同源的 DNA 。菌落杂交主要用来从用质粒或 Cosmid 构建的基因文库中寻找阳性克隆子，当得到阳性克隆子后，再通过 Southern 杂交 进一步验证。通过这种方法在一张直径为 9cm 的滤膜上，可检测成
39、几百到一千甚至上万 个菌落，达到高通量筛选的目的。 三、斑点杂交 斑点杂交是分子杂交中最简单的一种，直接将 DNA 或 RNA 分子以斑点的形式固定 在滤膜上，然后进行分子杂交。其杂交的信号比菌落杂交和噬菌斑杂交受到蛋白质等细胞 成分的干扰小，其结果的可靠性更强。当核酸分子的斑点面积变得更小，在单位面积滤膜 上处理的样品数量就更多，当检测的灵敏度进一步提高后，就发展成 DNA 芯片。 四、Northern blot Northern 杂交的总体过程与 Southern 杂交相似，只不过在 Blotting 过程中转移的是 RNA 而不是 DNA ,这种将 RNA 样品从凝胶转移滤膜的方法，其设
40、计者为之起了一个与 Southern blotting 对应的名称， Northern blotting 。其后的分子杂交过程与 Southern 杂交 过程中的分子杂交方式是一样的。 Northern 杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的 mRNA 分子， 从而判断在转录水平上某基因是否表达，在有合适对照的情况下，通过杂交信号的强弱可 比较基因表达的强弱。 五、Western blot Western 杂交的总体过程也与 Southern 杂交相似，只不过在 Blotting 过程中转移的 是蛋白质而不是 DNA ，这种将蛋白质样品从 SDS-PAGE 凝胶通过电转移方式转移
41、到滤 膜的方法，称为 Western blotting 。其后的杂交过程不是真实意义的分子杂交，而是通过 抗体以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被抗体识别的蛋白质，并判断其分子量。所用的 探针不是 DNA 或 RNA， 而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体。 Western 杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而 判断在翻译水平上某基因是否表达。这种检测方法与其它免疫学方法的不同是，一方面可 以避免非特异性的免疫反应，而且更关键的是可以检测出目标蛋白质的分子量，从而直观 的在滤膜上显示出目标蛋白。 六、蛋白质 N 末端序列测定 七、RNA 端点分析 1RNA 的 S1
42、 核酸酶作图 对mRNA的端点进行分析之前必须知道 mRNA 的核苷酸序列，也就是必须获得该基因 的核苷酸序列。首先预先判断 mRNA 的端点位置，设计一段覆盖该端点的寡核苷酸，并 作末端放射性标记。然后将该标记的寡核苷酸与 mRNA 混合，退火，形成杂交体。在 S1 核酸酶作用下，呈单链状态的 DNA 和 RNA 被降解，保留 DNA-RNA 杂交体双链，最 后通过凝胶电泳检测 DNA-RNA 杂交体中标记的 DNA 单链的分子量大小，从而推断 mRNA 的末端序列。其工作原理见图 4-4 。这种方法既可以分析 mRNA 的 5 端也可分 析 3 端。 2引物延伸法分析 mRNA 的端点 引
43、物延伸（primer extension）法主要用于 mRNA 的 5 末端作图，先要知道该基因的 核苷酸序列并预先判断 mRNA 的端点位置。首先在 mRNA 的预测的 5 末端下游约 150bp 位置处，设计一段互补寡核苷酸引物。以 mRNA 作模板，用反转录酶延伸该引物， 产生的 cDNA 与 mRNA 模板互补且其长度与引物 5 末端至 mRNA 的 5 末端之间的距 离相等。 第五节 生物芯片技术 一、生物芯片的定义 生物芯片（Biochip）是指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、 凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命科 学领
44、域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组 分的准确、快速、大信息量的检测。 基因芯片（又称 DNA 芯片）是生物芯片的一种类型，它是将 DNA 分子固定于支持 物上，并与标记的样品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的 数量，进而得知样品中 mRNA 的表达量，也可进行基因突变体的检测和基因序列的测定， 为进一步了解基因间的相互关系及基因克隆提供有用的工具。 二、基因芯片技术的发展史 1989 年英国牛津大学的 Southern 等取得了在刚性载体表面固定寡聚核苷酸及杂交法 测序的专利；与此同时俄罗斯和美国的科学家也提出了运用杂交法测定核酸
45、序列（SBH） 的设想。 1994 年研制出了一种基因芯片并用于检测 -地中海贫血病的基因突变，筛选了 一百多个 -地中海贫血病已知的突变基因。 1995 年，一些国际大公司与研究机构合作共 同开发具有商业价值的生物芯片及其相关的分析技术。 1997 年世界上第一张全基因组基 因芯片含有 6116 个基因的酵母全基因组芯片在斯坦福大学 Brown 实验室完成。从 而使基因芯片技术在世界上快速得到应用。 三、基因芯片技术的特点 基因芯片技术的特点的核心是微型化。芯片每平方厘米固体表面上可固定十万个 DNA 片段、数万个基因。一次分析可得到数万个基因的表达信息。微型化的另一方面是 样品用量与试剂用
46、量的微量化，用纳克级的 mRNA 、微升级的杂交液就能分析成千上万 个基因的表达信息。这些都是其它研究技术所无法比拟的。 芯片制作及分析过程易于自动化。芯片设计制作可实现自动化，可根据要求将需要分 析的基因制作成符合要求的芯片；杂交、洗片等过程都可实现自动化，工作效率大幅提高。 四、生物芯片的分类 1按载体材料 按载体材料可将芯片分为玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片。目前，玻片材料因易得、荧 光背景低、应用方便等优点在国际上被广泛接受。通常是将玻片用化学方法处理并联接上 活性基团，如氨基、醛基、巯基等，使生物分子通过共价键或离子键与载体结合。 2按点样方式 根据芯片点样方式不同，可分为原位合成芯片、
47、微矩阵芯片和电定位芯片三类。 原位合成芯片（ Loci-synthetic DNA Chip） 矩阵芯片（ Microarray） 电定位芯片（ Microelectronic） 3按芯片固定的生物分子类型 根据芯片固定的生物分子类型可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片及芯片实 验室。 基因芯片或 DNA 芯片 蛋白质芯片（ Protein Chip） 芯片实验室（ Lab-on-Chip） 4按芯片使用功能分类 生物芯片因功能和用途不同可分为测序芯片、表达谱芯片和基因差异表达分析芯片等。 测序芯片 表达谱芯片 基因差异表达分析芯片 五、 基因芯片的制作 1DNA 样品的来源 2生物芯片的
48、制作 生物芯片微阵列的制作技术按照制作方法可分为两大类，即原位合成和预合成后点样。 预合成后点样是指制备芯片微阵列前，要固定的探针已经合成好，点滴系统需要做的就是 把这些合成好的样品涂印或喷涂在基体上。原位合成方法则是由点滴系统将探针的组成部 分逐步转移到基体上，同时实现探针合成和转移的目的。目前已经知道的基因芯片制作法 有，接触点样法、喷墨法和原位合成法等。 接触点样法 喷墨法 光刻 DNA 合成法 3制作生物芯片常用的工具 4DNA 分子在刚性表面的固定 基因芯片技术包括三大部分，即芯片的制作；样品的标记；探针与标记样品的分子杂 交等。 基因芯片制作的关键就是如何将大量的探针分子固定于支持
49、物上，并保持探针分子的 构像处于自然状态，使探针 DNA 分子能自由地与样品分子进行杂交。 六、 基因芯片的杂交及结果分析 将不同条件下从某生物体中转录出来的所有 mRNA 经标记成为探针后，再与包含它 所有基因而制成的芯片杂交。通过分析杂交位点及其信号强弱，就可得出不同情况下每个 基因是否已表达及表达多少。 1探针的标记 标记的方法通常是在反转录的底物中加入带有标记基团的寡核苷酸单体，通过反转录 将标记分子掺入 cDNA 分子中。 mRNA 反转录标记方法直接影响 DNA 芯片分析结果 的准确性及重现性。 2杂交 在一定的条件下，分子间氢键的断裂与恢复是 DNA/DNA 、 DNA/RNA 分子间选择 性结合的根本动力，这一过程称之为杂交。 3芯片结果读取与扫描仪 4生物芯片的软件系统与数据处理 七、 基因芯片的应用 1基因表达分析； 2基因型及多态性分析； 3杂交测序； 4核酸和蛋白质相互作用的研究； 5疾病的诊断与治疗； 6药物开发； 7在营养
