第二节蛋白质结构与功能的关系.doc

1、3.2 蛋白质分子结构与功能的关系 了解蛋白质的三维结构是理解蛋白质如何行使其功能的基础。蛋白质功能 总是跟蛋白质与其它分子相互作用相联系，被蛋白质可逆结合的其它分子称为 配体。蛋白质配体相互作用的瞬时性质对生命至关重要，因为它允许生物体 在内、外环境变化时，能迅速、可逆地作出反应。蛋白质上的配体结合部位与 配体在大小、形状、电荷以及疏水或亲水性质等方面都是互补的。 3.2.1 细胞色素的分子进化 1、细胞色素 C 的一级结构的种属差异和分子进化 从细菌到人，一切需氧的生物体内，都有细胞色素 C 的存在。细胞色素 C 是一个具有 104112 个氨基酸组成的多肽分子，是一种在需氧细胞的代谢中担

2、 任重要角色的蛋白质，在蛋白质一级结构的种属差异研究的蛋白质中占有最重 要的地位。这是因为，细胞色素 C 分子的结构比较简单，大小合适，容易纯化 结晶，结构测定也比较容易，因此，是研究分子进化的最好材料。现在已对不 同种属来源的细胞色素 C，从一级结构，三维结构以及功能等各方面进行了系 统的研究。 存在部位与作用：细胞色素 C 存在于细胞的线粒体中，是参加生物氧化的 一种电子传递体，大约在十亿年前，生物进化到需要氧的阶段，即出现了生物 氧化过程，于是就产生了细胞色素 C，因此，细胞色素 C 是生物界广泛存在的 一种古老的蛋白质。 细胞色素的残基数：脊椎动物的细胞色素 C 由 104 个氨基酸残

3、基组成。少 数 103 个，昆虫 108 个氨基酸残基，植物 111114 个残基，一般为 112 个氨基 酸残基。 不同生物与人的 CytC 的 AA 差异数目 黑猩猩 0 恒河猴 1 兔 9 袋鼠 10 牛、猪、羊、狗 11 马 12 鸡、火鸡 13 响尾蛇 14 海龟 15 金枪鱼 21 角饺 23 小蝇 25 蛾 31 小麦 35 粗早链孢霉 43 酵母 44 以人的细胞色素 C 为标准进行比较，发现人与黑猩猩的细胞色素 C 的一级 结构完全相同，与恒河猴只相差一个残基，与马相差 12 个残基。从细胞色素 C 的一级结构中的氨基酸残基的改变数的多少可以看出，生物从原核到真核， 从单细胞

4、生物到多细胞生物，从低等生物到高等生物的进化规律，反映了种属 之间的亲缘关系。 2细胞色素 C 三级结构活性部位的保守性 同源蛋白质：在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白 质，指由共同的祖先蛋白分子经过变异和自然选择而产生的功能上相同、相关 并在结构上有某种程度相似性的不同蛋白质。 在进化过程中一级结构始终保持不变的氨基酸残基称为守恒氨基酸残基，在 不同物种的细胞色素 C 一级结构中，则有 35 个位置的氨基酸残基是完全不变 的，因此叫做不变残基或叫做守恒残基，这些守恒残基分散在多肽链的各个部 位，在分子进化过程中，细胞色素 C 的一级结构虽然有很大的变化，但三级结 构基本上保持

5、不变。三维结构的关键部位是守恒的，尤其是活性部位的氨基酸 残基及其三维排布，均不会发生改变。这是蛋白质发挥其生物功能的基本条件。 蛋白质分子的三维结构不能因为变异而受到严重影响。由于分子内部的氨基酸 残基通常对维系三维结构比较重要，因此，变异较多地发生在蛋白质分子表面 上。 血红素是细胞色素 C 分子的电子传递中心，在生物进化过程中保持不变。 其它不变的氨基酸残基有的是为了保证血红素在蛋白质分子中正确的立体位置， 保持多肽的构象形成一个疏水性的狭缝，狭缝的结构严格地决定着整个细胞色 素 C 分子的三维结构，不同物种的细胞色素 C 的狭缝区域，其疏水性残基一般 是保守的，或者是可以保守性取代的残

6、基，脯氨酸在拐角处，甘氨酸没有侧链， 体积小，也在拐角处。 保守性取代：指化学性质相似的氨基酸残基之间有相互置换的现象，例 如：Leu 与 Ile、 Phe 与 Tyr、 Asp 与 Glu 之间都能互相替换。 Rossman 等人研究了各种蛋白质结构与功能的相似性之后指出，在生物 进化的过程中，蛋白质的二级结构、超二级结构以及三级结构存在很大的保守 性，同源蛋白质的一级结构允许有种属差异，但生物功能所要求的特定构象不 能改变。不同生物的细胞色素 C 的氨基酸组成是有一些置换，但它们的生理功 能却是相同的。 3系统树： 根据蛋白质中氨基酸残基的变化情况 与古生物学测定生物进化年代相比较，可以

7、发现各种蛋白质分子进化都有其本身的进化 速率，称为单位进化周期。 单位进化周期是指蛋白质在进化过程 中每一个残基上的变异所需时间。据此分析 出细胞色素 C 的单位进化周期是 2640 万年， 不同蛋白质的单位进化周期是不同的，血红 蛋白仅为 580 万年。 系统树是用计算机分析细胞色素 C 序列 并找出连接分支的最小残基数的方法构建起 来的，用其它计算机方法可推断出系统树分 支点处的潜在祖先序列。根据系统树不仅可 以研究从单细胞生物到多细胞生物的生物进 化过程，还可以粗略估计现存的各类物种的 分支时间 (图 3-34) 。 3.2.2 肌红蛋白的结构与功能 3.2.2.1 肌红蛋白的分子结构

8、肌红蛋白(myoglobin)存在于肌肉中，能贮藏 O2，供生物氧化之用。抹香鲸 肌红蛋白是第一个经 X-射线晶体衍射测定出精确三维结构的球蛋白，它的分子 包括一条 153 个氨基酸残基组成的多肽链和一个血红素，其多肽链的氨基酸序 列。 肌红蛋白多肽链中的残基 7580处于 -螺旋中，其余为无规卷曲，整个 肽链有 8 个长短不一的螺旋段，即 A.B.C.D.E.F.G.H，在侧链基团相互作用下盘 曲形成 4.3nm3.5nm2.3nm 扁园的球体。绝大多数亲水残基分布在分子表面， 使肌红蛋白可溶于水；疏水残基则埋藏于分子内部，血红素结合于 E 与 F 螺旋 之间的裂隙内(图 3-35)。 图

9、3-34 生物进化的系统树 图 3-35 肌红蛋白的三级结构 肌红蛋白分子表面有一狭缝，E 螺旋和 F 螺旋位于狭缝两侧，形成一个疏 水微环境。肌红蛋白的辅基血红素就结合在这个狭缝内。血红素的侧链丙酸基 伸到分子表面，在生理 pH 下，它们带负电荷，Fe 2+与卟啉环四个吡咯 N 原子 配位(图 3-36A)，F8-His 残基咪唑环 N-3 占据第五个配位位置，Fe 2+在邻接 His(F8)一侧，距离卟啉平面约 0.03nm。O2 占据第六配位位置，在卟啉平面另 一侧与血红素可逆地结合。脱氧肌红蛋白中第六配位空置：而在高铁(Fe 3+)肌红 蛋白中 H2O 占据这个位置。在狭缝另一边 E7

10、His 并未与血红素结合，称为远侧 组氨酸，靠近第六配位位置(图 3-36B)。 肌红蛋白由 3 个外显子编码：外显子编码 1 至 30(NA1 到 B2)，外显子 编码 31 至 105(B3 至 G6)，外显子编码 106 至 153(G7 至 HC5)（图 3-32） 。 研究表明，39 至 139(C4 到 H14)的片段与血红素结合关系密切。有人用蛋白酶 从脱辅基肌红蛋白 N-端和 C-端各切去一段，制备出相当于 32 至 139 的多肽， 加入血红素后构成微型肌红蛋白，在体外系统能可逆地与 O2 结合，与天然肌 红蛋白相似。就氧合功能而言，1-31 和 140-153 贡献不大，但

11、不排除这些片段 在稳定分子结构、促进合成、折叠和运输以及种系发生等方面可能的作用。 图 3-36 血红素辅基的结构 3.2.2.2 肌红蛋白的功能 血红素在水中可以短暂地氧合，然后形成血红素-O2-血红素夹层中间物， 很快产生不能氧合的高铁血红素。虽然肌红蛋白中真正与 O2 结合的是血红素， 但是肽链起着围篱作用。由于血红素结合在肽链绕成的疏水狭缝中，远侧 His 的位阻效应防止了夹层复合物的形成，避免了 Fe2+氧化或流失，使血红素可以 长时间可逆的氧合-放氧，完成 O2 载体的使命。同样是血红素辅基，在细胞色 素中它是电子载体，在过氧化氢酶中参与过氧化氢分解为水和氧的催化过程。 可见辅基的

12、功能在一定程度上依赖于它所结合的多肽链提供的微环境。 为了给肌红蛋白肽链的围篱作用提供实验支持，James 和 Collman 合成了 围篱铁卟啉复合物，在铁卟啉平面一侧，有一个咪唑衍生物占据 Fe2+第五个配 位位置，另一侧有疏水侧链基团形成保护 O2 结合的围篱 (图 3-38)，它对 O2 的 亲和力与肌红蛋白相仿。 CO 是许多含碳物质不完全燃烧的产物，也是血红素在体内降解的产物之 图 3-37 血红蛋白 -亚基的形成 一。游离血红素对 CO 的亲和力比对 O2 的亲和力大 25000 倍：而肌红蛋白对 CO 的亲和力仅比对 O2 的亲和力大 200 倍。这是因为游离血红素与 CO 结

13、合时， C-Fe2+键与 CO 键在一条直线上；而血红素与 O2 结合时 Fe2+-O 键与 O=O 键 之间形成 121的夹角。在肌红蛋白中，远侧 His(E7)的存在对其与 CO 的结合 显然会产生更大的位阻效应，结果大大降低了对 CO 的亲和力和 CO 中毒的危 险，保证在生理条件下肌红蛋白能有效地履行贮藏和输送 O2 的功能(图 1.37)。 脱氧肌红蛋白中 -螺旋含量约 60，三维结构比较松散，稳定性下降。 与血红素结合后，构象发生变化，-螺旋含量恢复至 75，分子结构比较紧凑， 稳定性也明显提高。这说明血红素辅基对肽链折叠也有影响。 3.2.3 血红蛋白的结构与功能 血红蛋白(he

14、moglobin, Hb)存在于脊椎动物红细胞中，是运输 O2 和 CO2 的 工具。Hb 是第一个得到 X-射线衍射结构分析初步结果的蛋白质，还是第一个 与生理功能相联系的蛋白质。从异常血红蛋白一级结构研究中提出了分子病的 概念，从 Hb 与 O2 结合中发现了协同效应。从而成为迄今认识蛋白质结构与功 能关系最好的范例。 3.2.3.1 血红蛋白分子结构 血红蛋白由四个亚基组成( 2 2)，每个亚基含一条多肽链和 1 个血红素辅 基。 亚基多肽有 141 个氨基酸残基， 亚基多肽链有 146 个氨基酸残基，二 者有 60 个相同，约占 42，其中有 23 个残基与 Mb 相同。Hb 的亚基与

15、 Mb 的 氨基酸序列虽有明显不同，但血红素结合部却非常保守，而且它们的二、三级 结构也十分相似，仔细对比也有一些差异(表 3-5)。 表 3-5 血红蛋白 -和 -链与肌红蛋白二、三级结构的异同 肽链区段 肌红蛋白（Mb） -链（） -链（） A 螺旋 AB 非螺旋 B 螺旋 BC 螺旋 C 螺旋 -螺旋 非螺旋 -螺旋 非螺旋 -螺旋 =Mb A16-B1 不同 =Mb =Mb 有 310 螺旋 =Mb 少 2 个残基 =Mb =Mb 有 310 螺旋 CD 螺旋 D 螺旋 E 螺旋 EF 螺旋 F 螺旋 FG 螺旋 G 螺旋 GH 螺旋 H 螺旋 HC 螺旋 残基总数 无规卷曲 -螺旋

16、-螺旋 无规卷曲 -螺旋 无规卷曲 -螺旋 无规卷曲 -螺旋基(24 个残基) 含 5 个残基 153 都不同于 Mb 不存在 无规卷曲 EF25 不同于 Mb =Mb =Mb G13 为 310 螺旋 Mb 含 20 个残基 含 3 个残基 141 CD57 不同于 Mb =Mb E1820 为无规卷曲 (=) =Mb =Mb (=) GH13 不同于 Mb (=) (=) 146 血红蛋白的四个亚基按四面体排布，亚基间凹凸互补，构成一个 6.55.55nm 的四面体。两个 与两个 亚基按双重对称轴排布，沿 X 或 Y 轴旋转 180，外形相似；沿 Y 轴两个 与两个 亚基间均有空隙，形成

17、中心空穴( 图 1.38)。 1/ 1 或 2/ 2 之间接触面较大，包括 G10H9 之间以及 B、D 螺旋的 34 个残基，由 1719 个氢键将其缔合成稳定的二聚体( 1/ 1 和 2/ 2)，不受血 红素和 O2 结合的影响。 1/ 1 或 2/ 2 之间接触面较小，涉及 1 的 CD 和 2 的 FG 非螺区中 19 个残基，将两个二聚体缔合为四聚体，此种结合易受 O2 和血红素结合的影响。 脱氧血红蛋白中,亚基间的静电相互作用（图 1.39） ，以及分子中心空穴周围 两个 链的 N-端-NH 3+、Lys-82（EF6） 、His-2 和 His143（HCl）共 8 个正电荷 与

18、空穴中的效应剂分子 2，3-二磷酸甘油酸（BPG）之间静电相互作用（图 1.40）对稳定脱氧血红蛋白的四级结构发挥着重要作用。这些静电相互作用在 血红蛋白氧合后不复存在。 3.2.3.2 血红蛋白的变构效应 Mb 和 Hb 均为储藏和运输 O2 的载体，Mb 是单体，Hb 为四聚体，在氧分 压较低时 Mb 对 O2 的亲和力远大于 Hb，如以 P50 表示一半结合部位被 O2 饱和 时的氧分压，Hb 的 P50=26Torr，Mb 的 P50=1Torr。 Mb+O2 MbO2 设 K 为 MbO2 解离常数，则 ；若 Y 为 Mb 氧饱和度，则2MbOK ；用 pO2 代替O 2，P 0 代

19、替 K，上式改写为：OY2 ，是一个典型的双曲线方程50Pp 对 Hb 来说，Hb+nO 2 Hb（O 2） 。 ，或nnPpOY)(502nPpY501 取对数，olg =nlogpO2-nlogP50 上式即 Hill 方程，是一个直线方程，Y=0.5 时 n(斜率 )值即为 Hill 系数。Mb 的 n=l， Hb 的 n=2.8，表明 Hb 与 O2 结合 存在协同效应( 或变构效应)，即先结合的 O2 影响同一分子中空闲的 O2 结合部位对 后续 O2 的亲和力(详见别构酶一节)。若 以纵坐标表示 Y，横坐标表示 pO2，Mb 的氧合曲线为双曲线，Hb 的是 S 型曲线 (图 1.4

20、1)。 Hb 的氧合曲线反映了 HbO2 的解离 特征：即在氧分压较高的区间，只有很少 HbO2 解离，表现为 S 型曲线上段：在氧 分压很低时，只剩下不多的 HbO2 缓慢地 解离，表现为 S 型曲线下段；只有在 S 型曲线中段相应的氧分压区间， HbO2 随 pO2 下降快速解离。如果肺泡中 pO2=100Torr，活动肌肉毛细血管中 pO2=20Torr，P 50=30Torr， n=2.8，在肺泡中 Y=0.97，在活动肌肉毛细血管中 Y=0.25，二者之差Y=0.72，即在此条件下血液从肺泡流到活动肌肉中将释放 所携带的 72的 O2 假如没有协同效应，即 n=l，其他条件不变，那么

21、 Y 肺泡 =0.77， Y 毛细血管=0.41 ，Y=0.36 ，可见在同样条件下协同效应使 Hb 的 O2 释放量增加一倍。实际测算表明，pO 2 从 100 降至 20Torr，MbO 2 只释放 10 的 O2。显然，血红蛋白适合于从肺泡到组织的 O2 运输，肌红蛋白则适合于通 过组织间液从血液接受 O2，将它储藏在细胞内备用。 人体的血红蛋白除 HbA( 2 2)外，还有 HbA2( 2 2)和 HbF( 2 2)。 、 链的一级结构仅有个别氨基酸不同，二、三级结构十分相似。成人 血液中 HbA2 仅占 2，HbF 不到 1，而胎儿血液中 HbF 是主要血红蛋白，在 足月的新生儿血液

22、中 HbF 占 7080。在生理条件下，HbF 对 O2 的亲和力大 于 HbA，使得胎儿通过胎盘循环从母体得到 O2(图 1.42)。 Hb 对 O2 的亲和力对 pH 和CO 2的变化敏感，pH 值下降时，Hb 对氧的亲 和力降低，HbO 2 解离曲线右移，S 型渐趋双曲线型。实际上血液 pH 变化很小， 而CO 2增大同样导致 Hb 对 O2 的亲和力下降。Hb 链 N-端氨基可逆地与 CO2 结合。在代谢活跃的组织中，CO 2增大或 pH 下降促进 HbO2 放 O2，而 O2 的释 放又促进 Hb 与 CO2 结合，这种现象称为 Bohr 效应(图 1.43)。 1967 年，Rei

23、nhold Benesch 和 Ruth Benesch 发现 2，3-二磷酸甘油酸(BPG) 是血红蛋白的别构效应剂。在成熟的人红细胞中HbBPG，每个 Hb 在其中 央空穴结合一分子 BPG，通过与周围正电荷集团的相互作用使 Hb 的四级结构 更趋稳定(见图 1.39)。如果没有 BPG，Hb 的氧合就不存在协同效应，在生理条 件下，BPG 的结合使 Hb 对 O2 的亲和力下降到 1/26。在某些内外因素影响下净 输氧量下降时，机体可通过调整 BPG 浓度进行补偿。例如肺气肿病人因支气管 气流受阻，Hb 不能充分氧合，动脉血 pO2 仅为 50Torr，只有正常值的一半。由 于 BPG

24、浓度从 4.5 升至 8.0mmol/L，使 P50 从 26 升至 31Torr，动脉 O2 饱和度 从 0.86 变到 0.82，静脉 O2 饱和度从 0.60 变为 0.49，因此净输 O2 量Y 从 0.26 增至 0.33。又如一个人从海拔 0 米到海拔 4500 米时，48 小时内他的红细胞中 BPG从 4.0 增至 7.5mmol/L，净输 O2 量相应增大(图 1.44)。由于 亚基 HCl 是 Ser 而不是 His，不能与 BPG 形成盐键，致使胎儿血红蛋白 HbF( 2 2)对 BPG 的结合力小于 HbA( 2 2)，因此对 O2 亲和力较高。 3.2.3.3 血红蛋白

25、别构效应的分子机制 Hb-亚基的单体具有对 O2 的高亲和力，氧合曲线为双曲线，与 Mb 极为 相似。孤立的 亚基易形成四聚体， 4 被称为 HbH，没有 HbA 的变构效应。 因此，血红蛋白的别构性质来源于亚基间的相互作用。 (1)氧合中血红素铁原子的变化：在脱氧血红蛋白中，由于连接血红素 F8His 咪唑环与血红素卟啉环间的位阻斥力，以及血红素铁外层电子处于高自旋状态， 半径较大，不能进入卟啉环中央小孔，而离开卟啉平面约 0.06nm：同时血红素 向 F8His 方向稍微隆起，呈现圆顶形(图 1.45)。在氧合过程中，铁外层电子变 成低自旋状态，半径缩小了 13，移动 0.06nm，进入卟

26、啉平面中央小孔，血红 素完全呈平面状态。血红素的状态既受 O2 结合的影响，又依赖于 Hb 整体的四 级结构。 (2)亚基三级结构的变化：在血红蛋白亚基中，血红素及 F8His 与邻近的 15 个侧链基团有紧密的联系。因此，氧合过程中铁原子的位移牵动 F8His 位移以 及 F 螺旋、EF 和 FG 片段等的位移(图 1.46)。F 螺旋向 H 螺旋移动二者之间的 空隙变小，迫使 HC2 的 Tyr 侧链从隙中移开，导致链间盐键的断裂。这样，血 红素上氧合引起的变化，触发亚基内部的构象改变，导致亚基交界面上的结构 改变。 (3)四级结构的变化：氧合引发的构象变化传递到亚基界面上，促使两个原 体

27、( 1 1)与( 2 2)相对旋转 15，平移 0.08nm(图 1.47)。脱氧状态时 1 亚 基 C7Tyr-42 酚基与 2 亚基 G1Asp99 羧基间的氢键，在氧合引起的亚基位移中 被破坏，而在 1 亚基 G1Asp9 的羧基与 2 亚基 G4Asn102 酰胺基间产生一个 新的氢键(图 1.48)。 氧合过程中亚基的旋转和位移，使维持四级结构的盐键断裂，两个 亚基 的铁原子间的距离从 3.99 减为 3.31nm，分子中央空穴变小以致容纳不下 BPG，盐键的断裂也引起 亚基的构象改变，如 E11Val 侧链移开，解除了 O2 结合的空间位阻。按照序变模型，上述血红蛋白氧合过程变构效

28、应的机制概括 于图 1.49。 3.2.2.4 异常血红蛋白 编码血红蛋白多肽链的基因发生突变，导致个别氨基酸取代、缺失、肽段 融合，延长甚至整个肽链的缺失，形成 300 种以上的异常血红蛋白。由于取代 发生的位置、范围、性质各不相同，对血红蛋白结构和正常功能的影响也就有 所不同，有的异常血红蛋白结构和功能均无重大改变，有些异常血红蛋白的结 构发生显著变化而导致疾病，因此，对于阐明蛋白质结构与功能的联系极有参 考价值。根据变异的性质，可将异常血红蛋白分为以上四类。 (1)分子表面发生变异的 Hb：分子表面发生取代的异常 Hb 已发现一百多种， 绝大多数不影响 Hb 的稳定性和功能，在临床上是无

29、害的。但有少数可引起临 床症状，尤其是镰刀状红细胞贫血症，患者红细胞含异常的 HbS，红细胞呈镰 刀形，易破碎，寿命短，从而导致严重的贫血，甚至危及生命。现已查明，镰 刀状红细胞贫血患者编码珠蛋白 链的基因有一个碱基突变(TA) 结果 6(A3)的 Glu 被 Val 取代，致使 HbS 比 HbA 少 24 个负电荷，pI 从 6.68 增至 6.91，在脱氧状态下溶解度仅为 HbA 的 1/25。Val 取代 Glu 使 HbS 每个亚基外 侧产生一个粘斑，而脱氧 HbS 还有与粘斑互的部位，互相粘结，形成细长的脱 氧 HbS 聚合体(图 1.50)。几股这样的聚合体盘旋缠绕，形成在电镜下

30、可见的直 径为 17nm 和 21.5nm 的两种纤维。直径 21.5nm 的螺旋纤维更常见，有 14 股螺 旋纤维。这些纤维使红细胞变成易碎的镰刀形。红细胞破碎后释放出 HbS 纤维， 使血液粘度增大，血流不畅，小血管阻塞，造成供 O2 不足又恶性循环地导致形 成更多的镰刀形红细胞。被释放的 HbS 随即被降解，以致造成严重的贫血，最 后危及生命。纯合子(HbS/HbS)患者红细胞中 HbS 含量高达 95以上，多于成 年前夭亡；杂合子(HbS/HbA)患者红细胞中 HbS 含量约为 35，一般不表现严 重的临床症状，但在高海拔进行重体力活动或麻醉均可能引发红细胞镰刀化。 镰刀形红细胞贫血是

31、第一个证实的单一基因中一个等位基因点突变导致蛋白质 分子变异而造成的分子病。 (2)血红素结合部位发生变异的 Hb:Hb 每个亚基都有一个结合血红素的疏水 性裂隙，除结合血红素的 F8His 和 E7His 外，其余与血红素接触的 19 个残基有 15 个是疏水残基。上述残基发生取代涉及到血红素的结合及 Hb 的稳定性。影 响的大小和临床症状的严重程度取决于取代残基的性质。例如 HbM 为 E7 或 F8His 被 Tys 取代，带负电荷的酚基与 Fe3+形成络合物，把血红素锁定在高铁 (Fe3+)状态，从而丧失结合 O2 的能力。纯合子 HbM 几乎总是致死的，杂合子 HbM 只有一半血红素

32、与 O2 结合，造成供 O2 不足，发绀和继发性红细胞增多。 HbM-Milwaukee-1 虽是 链的 Val167(E11)被 Glu 取代，但它与 E7 在螺旋同一 侧，Glu 的侧链羧基负电荷也能与 Fe3+络合，把血红蛋白定格在高铁状态，并 将 E7His 挤出血红素裂隙(图 1.51)。另外，HbBristol 链 67 的 Val 被 Asp 取代， 其侧链负电荷与 E7His 的咪唑基正电荷形成盐键，使血红素裂隙遭到破坏，产 生高度不稳定的 Hb 和严重的先天性亨氏小体溶血性贫血 (CHBHA)。Hb Hammersmith 则是由于 链血红素裂隙人口处的 Phe42(CD1)

33、被亲水的 Ser 取 代，使水进入空穴，阻碍血红素的结合。 (3)三级结构突变的 Hb：如果多肽链中螺旋段的残基被 Pro 取代，或螺旋段 及非螺旋拐弯处缺失一个或多个残基，均可破坏 -螺旋和肽链的构象，导致 Hb 稳定性下降，丧失 O2 结合能力。例如 Hb Genoa 26(B10)Leu 被 Pro 取代； Hb Duarte 62(E6)Val 被 Pro 取代，致使 Hb 不稳定和严重的 CHBHA。Hb Freiburg 23(B7)Val 缺失， Hb Gen Hill 91-95(F7-FG2)缺失，造成构象破坏， 不能结合血红素，丧失氧合能力(图 1.52)。 (4)四级结构

34、突变的 Hb：Hb 氧合前后四级结构发生明显改变， 1/ 2 或 2/ 1 发生位移，因此亚基界面上的突变易造成变构效应的丧失，出现异常的 氧亲和力。例如 Hb Uakima 和 Hb kqempsey、Hb Radclife 的 亚基 99(G1)Asp 分别被 His、Asn 和 Ala 取代，导致脱氧 Hb 稳定性增大，O 2 亲和力升高。Hb Kansas 亚基 102(G4)Asn 被 Thr 取代，氧合态 Hb 的构象破坏，O 2 亲和力下 降，患者动脉 O2 饱和度仅 0.6 而不是正常的 0.97，因而明显发绀。 3.2.3 免疫球蛋白的结构与功能 免疫（immunity）是人

35、类和脊椎动物最重要的防御机制，免疫系统能在分子水平上识 别“自我”和“非我” ，然后破坏那些被鉴定为非我的实体。在生理水平上免疫系统对入侵 的反应或应答（respone）是多种类型的蛋白质，分子和细胞之间的一套复杂而协同的相互 作用，然而在个别蛋白质水平上免疫反应是配体与蛋白质可逆结合的一个生化系统。 3.2.3.1 抗原(antigen) 抗体(antibody)的一般概念：当外源物质，如蛋白质、毒素、糖蛋白、 脂蛋白、核酸、多糖、颗粒（细菌、细胞、病毒）进入人或动物体内时，机体的免疫系统 便产生相应的免疫球蛋白（immune globin） ，并与之结合，以消除异物的毒害。此反应称 为免疫

36、反应，此异物便是抗原，此球蛋白便是抗体。 抗体的特点：高度特异性，多样性。特异性是指抗体通常只能与引起它产生相应抗原 发生反应，多样性是指抗体可以和成千上万的各种抗原起反应。 3.2.3.2 免疫球蛋白（immune globin）的分类：人免疫球蛋白分为： IgG、IgM、IgA、IgD、IgE。 3.2.3.3 免疫球蛋白结构 抗体的四链单位：抗体有五大类：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE。人类所有的抗体都具有 共同的四链结构单位，在四链单位中，有两条相同的重链（H 链）和两条相同的轻链（L 链） ，重链的分子量为 5104710 4，大约由 450 个氨基酸残基组成，轻链的分子量为

37、 2200023000，由 210230 个氨基酸残基组成，两条轻链之间以及重链与轻链之间，均以 二硫键相连，不论是重链或轻链都可以分成可变区和恒定区（图示）从多肽的 N末端算 起，占轻链的二分之一或重链的四分之一的肽段，是可变区（V 区） ，在同类抗体的不同抗 体分子中，其恒定区的序列变化很小，所有抗体都可以用（H2L2）n 通式表示，H2L2 是一 个四链单位，n 表示是四链单位数, IgG、IgA、IgD、IgE 均为 H2L2， IgM 为（H2L2） 5J，J 为 J 链，分子量为 20000，这 5 种抗体在结构上的主要区别是：H 链结构，链间二硫 键的数目与位置，以及四链单位数的

38、不同。所有的抗体都是糖蛋白。 1免疫球蛋白的一级结构：IgG 是人类血清抗体中含量最多（占抗体总量的 70%） ， 作用最大，研究最清楚的一类抗体。它可以作为各类抗体的代表，因此，这里只介绍 IgG 分子的结构与功能。 (1)IgG 的分子结构是对称的，由两个相同的半分子构成，每个半分子包含一条轻链 和一条重链，轻链与重链之间由一个二硫键连接，两个半分子的重链之间由 2 个二硫键连 接，每条轻链包含 214 个氨基酸残基，分为长度大至相等的两个肽段，即 VL 和 CL 区，每 个肽段都包含一个链内二硫键，每条重链包含 446 个氨基酸残基，分为四个长度大致相等 的四个肽段。即 VH、CH、CH

39、2、CH3 区，每个肽段都包含一个链内二硫键。 (2)VL 和 VH 的同源性和高变异区：IgG 分子结构最明显的特征是：轻链和重链都可 以区分为易变区和恒定区，VL 区和 VH 区的长度大致上相等。 对各种抗体的易变区序列的比较表明，各种抗体的易变区序列，虽然有高度的差异，但是 仍然有一定的同源性。一级结构可变区内各个位置的残基变异频率并不相同，高度可变的 区域称为高变区，L 链可变区中有 3 个高变区，H 链可变区有 4 个高变区，高变区是抗体与 抗原直接结合的部位。 (3)CH1、CH2、CH3、CHL 同源性：如果按照链内二硫键的位置，把重链的恒定区分 为大致相同等的 CH1、CH2、

40、CH3 3 个片段，并按最大同源性的方式排列，然后加以比较发 现，3 段之间每 100 个氨基酸残基中就有 2224 个位置的残基是相同的，3 段与 CL1 区也 有高度的同源性。 (4)IgG 的活性片段 用木瓜蛋白酶对 IgG 进行有限的水解反应，可以把 IgG 分子切成 3 个活性片段，其中 N 端两个相同的片段能与抗原结合，称为 Fab，含有一个能与抗原结合的部位， （单价的） ， 与抗原结合的复合物不产生沉淀，抗体分子有两个 Fab，是双价的，与抗原结合的复合物 可以形成沉淀。 Fc 是酶解的另一个片段，可执行各种生物学功能。IgG 的生物学功能只有在抗体与抗原结 合后才能产生，故有

41、人认为抗原-抗体的结合好比“开关，一旦打开，引发出一系列生物学 效应” 。但对这种开关的机理尚未搞清。有的学者认为抗原与抗体结合后，抗体构象发生变 化，但无论从 X-光衍射或光的回光散射等方法都未确证构象的变化。 二空间结构 1铰链区：IgG 分子呈“Y”字形或“T”形，2 个 Fab 和一个 Fc 通过一个铰链区连接在一 起。铰链区的特征是： 重链区之间的二硫键多集中于铰链区，彼此平行 含有较多的脯氨酸，不可能形成 螺旋 有相当的柔曲性，易被蛋白酶分子接近。 2同源区：IgG 分子有十二个结构域，其中每个轻链含有 4 个结构域（VL 和 CL） ，每个重 链含有 4 个结构域（VH、CH1、

42、CH2、CH3）图示。这些结构域由于其氨基酸残基序列有高度 相似性，因此，在二维结构方面，是很相似的，被称为同源区，每个结构域内部有一个链 内二硫键，此二硫键能够维持结构域的稳定。 3结构域：对任何一个结构域而言，肽链折叠，形成 7 条 折叠股，其中 4 条 折 叠股构成一个反平行 折叠片层的四链层，另 3 条 折叠股构成了一个反平行 折叠片层的三链层，四链层与三链层通过一个二硫键相连。 3.2.3.4 免疫球蛋白的主要功能 1 凝集作用和沉淀作用(结合抗原 )：与抗原结合是 Ig 免疫功能的基础，它是由每个 Fab 片 段中重链和轻链的变区所组成。每一个四链单位表现为二价，能与 2 个抗原决

43、定簇结合， 而无论是分子抗原(如蛋白质等)还是颗粒抗原(如细菌、病毒、红细胞等)一般都表现为多 价，能与多个抗体结合，因此在抗原、抗体结合后可形成大的网格结构，出现凝集和沉淀 等现象。凝集的病原体会影响营养物质的吸收或代谢物质的排泄，而且凝集的颗粒或沉淀 的颗粒会有助于吞噬细胞的吞噬。 2 激活补体：补体是血浆中一组参与免疫反应的对抗原非特异性的蛋白酶系，血清中游离 的 IgG 不能固定补体，只有当 Ig 与具有抗原性的细胞结合后，并且只有在 2 个以上的 IgG 与抗原结合后才能通过 Fc 部分激活补体酶系来激活补体、固定补体，使酶系按一定顺序依 次活化，最后形成 19 个补体分子组成的十聚

44、体。这说明 IgG 的 CH2 功能区与 C1q 的相互作 用必须在抗原-抗体复合物处于集聚状态时才能发挥激活补体的生理功能。 3 调理作用：调理作用是指促进颗粒抗原（如细菌）被吞噬细胞的吞噬作用。Ig 颗粒抗原 结合后有调理作用，即 Ig 与颗粒抗原结合后，可改变抗原表面的电荷，从而减少抗原与吞 噬细胞间的静电排斥力。吞噬细胞本身就有吞噬异物，包括病原微生物的功能，不过，当 有抗体及补体参与时，则可大大增强其吞噬能力，由于吞噬细胞有多种补体受体，当补体 分子或其片段与相应受体结合，可刺激该细胞促进吞噬，诱导呼吸爆发，增强因子分泌及 杀菌能力，称为补体的调理作用。 4 中和毒性和病毒：一些引起

45、疾病的细菌如破伤风杆菌、白喉杆菌以及内毒素杆菌等，都 能产生外毒素(exotoxin),因而引起各种疾病。这些外毒素在体内可以诱导 IgG 类抗体， IgG 类抗体与外毒素结合，使之丧失毒性(称为中和毒素作用)，保护了机体。例如白喉毒 素，它对敏感细胞的毒性作用是抑制细胞的蛋白质合成。白喉毒素与氨基酰转移酶共价结 合，抑制细胞内蛋白质的合成，致使敏感细胞死亡造成对机体的危害。 5. 多克隆抗体和单克隆抗体：如果给动物注射抗原,虽然抗原与各种抗体产生细胞的亲和 性有所不同，但是还是有大量抗体产生，细胞将与之结合，结果血液中出现的抗体源于数 种不同的细胞克隆，这些抗体就是多克隆抗体（polyclo

46、nal antibodies） 。如果可以分离到抗 体产生细胞的单克隆，然后使所有的抗体均来自同样的克隆，这样制备的抗体称为单克隆 抗体（monoclonal antibodies ） 。 由于单抗细胞的寿命有限，严重限制了单抗的常规制备。1975 年，Milsetein 和 Kohler 创建了不受限制地大量制备针对特异抗原的单抗技术，将可产生专一性抗体的 B 淋 巴细胞与具有无限繁殖能力的恶性淋巴瘤细胞（骨髓瘤细胞）融合，融合体称为杂交瘤， 它既可以永久地培养，又可分泌大量的均一的抗体。由于用这个技术产生的抗体具有很高 的专一性，现已成为研究的常用工具。 3.2.4 朊病毒的结构与功能 朊

47、病毒 3.3 蛋白质组学研究 3.3.1 功能基因组与蛋白质组 人类基因组计划被誉为 20 世纪的三大科技工程之一。其划时代的研究成果 人类基因组序列草图的完成，宣告了一个新的纪元“后基因组时代” 的到来。其中，功能基因组学（functional genomics）成为研究的重心，蛋白质 组学（proteomics）则是其 “中流砥柱” 。正因为如此，Nature 、Science 分别在 2001 年 2 月 15 日、16 日公布人类基因组草图的同时，分别发表了“And now for the proteome”（Nature 409：747，2001） 、 “Proteomics in

48、genomeland” （Science 291：1221，2001）的述评与展望，将蛋白质组学的地位提到前所未 有的高度，认为是功能基因组学这一前沿研究的战略制高点，蛋白质组学将成 为新世纪最大战略资源。 以人类基因组计划为工程的基因组计划是 20 世纪的重大科技工程。其中， HGP 旨在完成人基因组 24 条染色体上 5 万左右基因的作图 (遗传图与物理图) 和 30 亿碱基的 DNA 全序列的测定。此计划自 1990 年实施以来得到快速发展： 1994 年人基因组全套遗传连锁图发表，1995 年全基因组覆盖率高达 94的物 理图问世；同年，汇集了人基因组初步全物理图，3、12、16、22 号染色体高 密度物理图以及 30 余万左右 cDNA 序列信息的“人基因组指南”经 Nature 结 集出版；2000 年 6 月 26 日，宣告人类基因组序列草图测定完成；2001 年 2 月 15 日、16 日，国际人类基因组计划与美国 Celera 公司分别在 Nature、Scien