1、第二十五章免 疫 学 诊 断,教 学 要 求:1 掌握凝集反应、沉淀反应的定义及其基本类型。2 掌握间接免疫荧光法和ELISA的双抗夹心法及间接法的基本操作步骤。3 熟悉检测体液免疫和细胞免疫的常用试验方法。4 了解免疫学检测方法的应用。,第二十四章免疫学诊断,免疫学诊断即用免疫学方法确定疾病相关因子、监测疾病过程、判断疗效及预后，涉及对疾病相关因子的诊断和辅助诊断，以及检测机体免疫功能状态。 第一节 抗原或抗体的检测 抗原抗体反应原理：抗原的抗原决定基与抗体的结合部位之间的结构应具有互补性，二者相互结合后，在适宜条件下，可出现可见反应。,免疫学诊断,一、抗原抗体反应的特点（一）抗原抗体反应的
2、特异性 指一种抗原只能与由它刺激所产生的抗体结合的专一性。它是免疫学诊断的重要基础。 1 亲和力(affinity)：抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定基之间的结合强度。 2 亲合力(avidity):一个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。 3 抗血清： 4 一抗： 5 二抗：,免疫学诊断,（二）抗原抗体反应的可见性： 抗原、抗体比例适合时，在适宜的盐浓度下可形成肉眼可见的反应物（凝集物或沉淀物）。（三）抗原抗体反应的可逆性： 抗原抗体之间的结合主要是分子表面的非共价键结合，稳定，但在适当条件（如低pH、高浓度盐、冻融等）下可解离开，各自的生物学特性不发生改变。根据此特点，可利用亲合层
3、析法纯化抗原或抗体。,（五）影响抗原抗体反应的因素：P379 1 温度：适当的温度可增加抗原与抗体分子碰撞的机会， 加快二者结合速度。不宜过高过低。2 电解质：可使IC复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应。常用生理盐水稀释抗原或抗体。,免疫学诊断,3 酸碱度：最适pH68，否则可出现假阴或假阳性结果 4 抗原和抗体性质：抗体的特异性和亲和力是关键，初次应答抗体亲和力低，单克隆抗体亲和力低；抗原理化性质、抗原表位多寡等。,二 抗原或抗体的检测方法,根据抗原的性质、出现结果的现象、参与反应的成分不同，可将抗原抗体反应分为下列几类： （一）凝集反应（agglutination) P381 细菌、红细胞
4、等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在适宜电解质下形成肉眼可见凝集物的反应。,1. 直接凝集：玻片和试管凝集2 间接凝集： 正相间接凝集和反向间接凝集。 补充介绍：3. 协同凝集：以SPA为载体的反向间接凝集。在微生物检测中常用。4. 间接凝集抑制试验：,抗原或抗体的检测方法,（二）沉淀反应（precipitation)： p380 血清蛋白质、细菌裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后，在有电解质存在时，出现肉眼可见的沉淀物的反应。 1 单向免疫扩散 (single immunodiffusion)（1）特点：定性定量试验（2）用途：可用于测定血清IgG,IgM,IgA和C3等的含量（3）原
5、理：沉淀环的直径与抗原含量呈正相关。（4）操作：铺板 打孔 加样 放湿盒 看结果。,2 双向免疫扩散(double immunodiffusion)（1）特点：定性半定量（2）用途：用于抗原或抗体的定性检测、组成和多抗原相 关性分析。（3）操作：铺板 打孔 加样 放湿盒 看结果 。,3 对流免疫电泳试验 （补充介绍） 其实质是将双扩与电泳相结合。（1）特点：定性试验（2）用途：主要用于病原微生物抗原的定性检测。（3）操作：铺板 打孔 加样 电泳 看结果 。,4 免疫电泳 （immunoelectrophoresis) 也是将电泳技术与双向免疫扩散结合的一种技术，先电泳后双向免疫扩散（见图） 。
6、,5 免疫比浊 （immunoephelometry） 在一定量抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间形成IC，液体浑浊，用浊度计测反应体系的浊度，据标准曲线推算样品中抗原含量。,（四）免疫标记技术 P381 用荧光素、酶、放射性核素等标记抗原或抗体后进行抗原抗体反应。提高检测灵敏度、快速、可定性、定量，定位等。,免疫荧光标记技术,1 免疫荧光法 可对标本中的抗原进行鉴定和定位。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC）和藻红蛋白（PE），前者发黄绿色荧光，后者发红色荧光。 用途：可用于检查细菌、病毒、螺旋体等的抗原或抗体，帮助诊断传染病；也可用于鉴定免疫细胞的CD分子，检测AID的抗核抗体等。
7、,（1）直接法：缺点是每检查一种抗原必须制备相应的荧光抗体。（2）间接法：敏感性比直接法高，制备一种荧光二抗可用于多种抗原的检查，但非特异性增多。,2. 酶免疫测定： 是将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合。敏感度可达1ug/L,甚至1ng/L。常用的标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。 常用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定可溶性抗原或抗体，用酶免疫组化法测定,免疫酶标记技术,组织中或细胞表面的抗原。（1）ELISA: 双抗体夹心法：用于检测可溶性的特异性抗原。 操作基本步骤：用已知抗体包板
8、洗涤 封板 洗涤 加入待检标本 洗涤 加酶标抗体 洗涤 加底物显色 结果观察。,免疫酶标记技术,间接法：检测特异性抗体。非特异性增加。 基本步骤：用已知抗原包板 加入待检标本 加酶标二抗 加底物显色 观察结果。,免疫标记技术,（2）酶免疫组化法： 将酶标抗体与组织或细胞表面的抗原反应后，结合形态学检查，对抗原进行定性、定量、定位检测。 3 放射免疫测定法： 用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测，敏感度可达pg水平。常用于检测微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、吗啡、地高辛药物和IgE等。,4 免疫印迹法：P383 又称Western-blotting，用于蛋白质检测。是将凝胶电泳与固相
9、免疫结合，把电泳分区的蛋白质转移到固相载体后，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。常可检测多种病毒的抗原或抗体。,第二节 淋巴细胞的测定,淋巴细胞是机体内主要的免疫细胞，检测其数量和功能是了解机体免疫状态的重要手段。 一 淋巴细胞的分离 常用ficoll（淋巴细胞分离液）密度梯度离心除去红细胞、粒细胞而获得外周血单个核细胞（PBMC），再经吸附除去单核细胞而得到淋巴细胞。若要分离T细胞，可用尼龙毛柱、抗CD3单抗、E花结试验等分离。,二、淋巴细胞的鉴定 P386 根据淋巴细胞的某些标志，采用免疫荧光法、磁珠分离法、流式细胞术等方法可确定细胞的不同类型和比例。（一）T细胞功能测定 1. T细胞增殖试
10、验 植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）等丝裂原及抗CD3单抗等能非特异性激活培养的T细胞，使其转化成淋巴母细胞的试验。,淋巴细胞功能测定,在该增殖过程中，细胞DNA、RNA、蛋白质的合成增加，细胞形态改变。也可检测特异性抗原致敏的T细胞。 （1）氚标记的胸腺嘧啶核苷掺入法：该法灵敏、可靠，应用广泛，但需特殊仪器（液体闪烁仪），易有放射性污染。 （2）MTT法：该法操作简单，无放射性污染，但敏感性相对较差。,淋巴细胞功能测定,2 细胞毒试验： Tc、NK细胞对靶细胞有直接杀伤作用，可根据待检效应细胞的性质，选用相应的靶细胞。 （1）51Cr释放法：用51Cr标记靶细胞，记数仪测定释放的
11、51C活性。 （2）MTT法：其原理与增殖试验相同，但甲 生成量与靶细胞溶解破坏水平呈负相关。,3 细胞因子检测： CK的检测有助于了解其在免疫调节中的作用，鉴定分离的淋巴细胞，监测某些疾病状态的细胞免疫功能。常用的检测方法有以下三种：（1）ELISA法：（2）生物活性测定法：（3）聚合酶链反应（PCR）：,淋巴细胞功能测定,4 皮肤实验 正常机体对某种抗原产生细胞免疫后，用相同抗原做皮肤试验时出现以局部红肿为特征的DTH。细胞免疫正常时出现阳性反应，细胞免疫低下则呈阴性反应。 该方法简便，可帮助诊断某些病原微生物感染（如结核杆菌、麻风杆菌等）及免疫缺陷病等。,淋巴细胞功能测定,（二）B细胞功能测定 P389 B细胞介导体液免疫，检查B细胞的数量与功能是确定体液免疫是否正常的重要手段。1 B细胞增殖试验2 抗体形成细胞的测定：吸附有特异性抗原的SRBC与抗体形成细胞分泌的Ig特异性结合后活化补体，溶解SRBC。又称溶血空斑试验。,第四节 免疫学检测方法的应用（自 学）,
